沈平，章秋艷，楊立桃，張麗，李文龍，梁晉剛，李夏瑩，王顥潛，沈曉玲，宋貴文

（1農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心，北京 100122；2農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津 300191；3上海交通大學(xué)，上海 200240；4中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074；5天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，天津 300381）

基因組編輯技術(shù)及其安全管理

沈平1，章秋艷2，楊立桃3，張麗4，李文龍1，梁晉剛1，李夏瑩1，王顥潛1，沈曉玲5，宋貴文1

（1農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心，北京 100122；2農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津 300191；3上海交通大學(xué)，上海 200240；4中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢 430074；5天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，天津 300381）

基因組編輯技術(shù)利用核酸酶對生物體內(nèi)的DNA雙鏈進(jìn)行斷裂，并以非同源末端連接或同源重組的方式對基因組DNA特定位點進(jìn)行突變、缺失或者基因的插入與替換。鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶、成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列是目前基因組編輯技術(shù)應(yīng)用中的3種關(guān)鍵核酸酶。基因組編輯技術(shù)已在植物基因功能、育種等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，特別是基于成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列的基因編輯技術(shù) CRISPR-Cas9。具有優(yōu)良性狀的基因組編輯大豆、玉米等產(chǎn)品已逐步從實驗室走向田間，基因組編輯作物展現(xiàn)了較傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因作物更為優(yōu)越的應(yīng)用前景。本文簡要概述了主要使用的3種基因組編輯技術(shù)及其原理。對這些技術(shù)的優(yōu)缺點進(jìn)行了分析，并依據(jù)物種分類梳理了利用上述3種技術(shù)在動物、植物中突變體建立、基因功能研究、分子育種等方面的研究進(jìn)展。同時，針對基因編輯產(chǎn)物的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用前景，討論了基因編輯技術(shù)及其產(chǎn)品較傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)產(chǎn)品的優(yōu)勢，分析了基因編輯技術(shù)及其產(chǎn)品可能因脫靶效應(yīng)而引發(fā)的生物安全風(fēng)險,介紹了美國、歐盟等國家對基因編輯技術(shù)及其產(chǎn)品安全管理和商業(yè)化應(yīng)用的政策。文章結(jié)合中國現(xiàn)行法規(guī)對轉(zhuǎn)基因生物的定義及安全評價（實質(zhì)等同、個案分析）原則，討論了基因編輯技術(shù)及其產(chǎn)品的安全管理，初步提出了基于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因生物安全評價框架的基因編輯產(chǎn)品的安全評價和管理思路。針對基因編輯產(chǎn)品需要按照個案原則進(jìn)行評價和管理，安全評價重點開展分子特征及食用安全評價；同時需要針對基因編輯技術(shù)的特點建立更加有效、特異的檢測新方法，實現(xiàn)對基因編輯產(chǎn)品的有效監(jiān)測，以促進(jìn)基因組編輯產(chǎn)品的商業(yè)化應(yīng)用。

基因組編輯；轉(zhuǎn)基因生物；安全監(jiān)管

隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，能夠?qū)崿F(xiàn)對生物體基因組精確編輯的多種基因組編輯（genome editing）技術(shù)相繼出現(xiàn)。可對生物體基因組進(jìn)行精確地敲除、插入或置換的這些技術(shù)已被用于動物、植物基因組的改造，作為一種新型技術(shù)展現(xiàn)出在基因工程技術(shù)育種中的巨大潛力。基因組編輯技術(shù)為“按需定制”的新型分子育種提供了技術(shù)保障，將會廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)育種?；蚪M編輯技術(shù)雖然具有高精確性，但由于其脫靶效應(yīng)的存在，可能為基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品帶來潛在的安全性問題，也為基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品的安全管理帶來新的挑戰(zhàn)。

1 基因組編輯技術(shù)簡介

基因組編輯技術(shù)是指對基因組進(jìn)行定點修飾和改變的技術(shù)。該技術(shù)主要利用序列特異性的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和非特異性的 DNA修飾結(jié)構(gòu)域組合而成的序列特異性核酸內(nèi)切酶（sequence specific nuclease, SSN）在基因組特定位置對雙鏈DNA進(jìn)行定向切割，進(jìn)而激活細(xì)胞自身的修復(fù)機(jī)能來實現(xiàn)基因敲除、定點插入或替換等定向改造[1]。這種技術(shù)能夠在不改變目標(biāo)生物基因組整體穩(wěn)定性的基礎(chǔ)上，在目標(biāo)位點產(chǎn)生堿基缺失或插入，實現(xiàn)對單一或多個性狀的消除或獲得，研究基因的功能，進(jìn)而應(yīng)用于生物育種、臨床治療等領(lǐng)域。

目前，基因編輯技術(shù)主要有：鋅指核酸酶（zinc finger nuclease，ZFN）[2]、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）系統(tǒng)[3]、規(guī)律成簇的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/ CRISPR關(guān)聯(lián)蛋白（CRISPR-associated proteins，Cas）系統(tǒng)[4]、格氏嗜鹽堿桿菌的 Argonaute蛋白（Natronobacterium gregoryi Argonaute, NgAgo）核酸酶[5]和結(jié)構(gòu)引導(dǎo)的內(nèi)切酶（structure-guided nuclease，SGN）系統(tǒng)[6]等，其基本原理是核酸內(nèi)切酶在基因組的特定位點切割DNA雙鏈，然后利用細(xì)胞自身的DNA損傷應(yīng)答機(jī)制，以同源重組修復(fù)（homologydirected repair，HDR）或非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）的方式修復(fù)斷裂DNA雙鏈，從而實現(xiàn)外源基因的插入、一個或多個堿基的缺失或替換，使目的基因的功能發(fā)生改變。上述5種基因組編輯技術(shù)的主要區(qū)別在于對序列的靶向識別方式和機(jī)制。ZFNs和 TALEN是利用蛋白與DNA結(jié)合方式靶向特定的基因組位點，而CIRISPR/ Cas9、NgAgo和 SGN系統(tǒng)則利用簡單的核苷酸互補配對方式識別結(jié)合基因組靶位點。

ZFNs是經(jīng)過人工改造的核酸內(nèi)切酶，由特異性DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和非特異性切割域核酸內(nèi)切酶FokⅠ兩部分組成。結(jié)合結(jié)構(gòu)域由一系列串聯(lián)的具有Cys2-His2結(jié)構(gòu)的鋅指蛋白構(gòu)成[2]。每個鋅指蛋白識別并結(jié)合一個特異的堿基三聯(lián)體，結(jié)合域能識別一段 9—12 bp的堿基序列。在基因組靶標(biāo)位點左右兩邊各設(shè)計1個ZFN，識別結(jié)構(gòu)域會將2個ZFN結(jié)合到特定靶點，當(dāng)2個識別位點間距為6—8 bp時，2個FokⅠ單體相互作用形成二聚體，行使酶切功能對目標(biāo) DNA雙鏈進(jìn)行切割，實現(xiàn)基因組編輯。

TALEN的構(gòu)成與ZFN相似，由改造的TALE蛋白 DNA結(jié)合域和 FokⅠ核酸酶兩部分融合而成，TALEN蛋白最初來源于黃單胞桿菌。TALEN和ZFNs的差別在于特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其DNA結(jié)合域由13—28個串聯(lián)的具有DNA識別特異性的高度保守的重復(fù)單元組成。每個重復(fù)單元含有大約34個氨基酸，且不同單元的氨基酸序列非常保守，僅第12和13位氨基酸不同。這兩個可變氨基酸被稱為重復(fù)可變的雙氨基酸殘基（repeat variable-diresidue，RVD），它們決定重復(fù)單元的DNA識別特異性。TALEN根據(jù)靶標(biāo)位點兩側(cè)的序列設(shè)計一對TALEN，結(jié)合到對應(yīng)的識別位點后，2個 FokⅠ單體相互作用形成二聚體，對靶標(biāo)序列進(jìn)行切割，實現(xiàn)基因修飾[3]。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)基于細(xì)菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機(jī)制而產(chǎn)生，由CRISPR和及其相關(guān)Cas蛋白組成。該系統(tǒng)先產(chǎn)生與靶標(biāo)序列對應(yīng)的RNA序列，與病毒或質(zhì)粒的DNA互補形成RNA-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)，然后引導(dǎo) Cas9內(nèi)切酶對目的DNA雙鏈進(jìn)行切割，使DNA雙鏈斷裂，進(jìn)而對基因組進(jìn)行編輯[4]。靶序列通常由23個堿基組成，包括與小向?qū)NA（small guide RNA，sgRNA）堿基配對的前20個堿基，以及3'端Cas9識別的三核苷酸NGG序列PAM（protospacer adjacent motifs，PAM）。Cas9切割位點位于PAM上游3nt處。靶序列的結(jié)合特異性是由sgRNA和PAM序列共同決定的。Cas9蛋白不需要形成蛋白二聚體起作用，而向?qū)NA（guide RNA，gRNA）通過堿基互補配對決定靶序列的特異性。因此，CRISPR/Cas9系統(tǒng)大大降低了技術(shù)門檻，一經(jīng)面世就迅速得到廣泛應(yīng)用。

NgAgo-gDNA系統(tǒng)的工作原理與 CRISPR-Cas9類似，都是在引導(dǎo)序列的引導(dǎo)下，核酸酶對特定位點的基因序列進(jìn)行切割，從而進(jìn)行基因編輯。不同的是NgAgo-gDNA系統(tǒng)中的內(nèi)切酶是源自格氏嗜鹽堿桿菌的 Argonaute蛋白，引導(dǎo)工具是一段引導(dǎo) DNA（guideDNA，gDNA）[5]。

SGN系統(tǒng)利用了一種能識別3′flap結(jié)構(gòu)的內(nèi)切酶FEN1（flapstructure-specific endonuclease1）。FEN1與Fn1（FokⅠ）的剪切結(jié)構(gòu)域結(jié)合起來可以識別靶序列與gDNA形成的3′flap結(jié)構(gòu)，通過Fn1二聚化對靶序列進(jìn)行切割，實現(xiàn)基因組的編輯[6]。

新型基因組編輯技術(shù)的興起，已經(jīng)開啟了基因組工程的一個新篇章。特別是CRISPR-Cas9系統(tǒng)已成功應(yīng)用于植物、細(xì)菌、酵母、魚類及哺乳動物細(xì)胞，為構(gòu)建更高效的基因定點修飾技術(shù)提供了全新的平臺，是目前最高效的基因組編輯系統(tǒng)[7]。

2 國內(nèi)外研究與應(yīng)用現(xiàn)狀

基因組編輯技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多種模式生物靶基因的定點斷裂、插入、缺失、替換等編輯，積極推動了生物體基因功能研究、作物遺傳改良和分子育種以及人類疾病的基因治療等領(lǐng)域的發(fā)展。2012年和2013年《Science》分別將TALEN和CRISRP/Ca9技術(shù)評為年度十大重要科學(xué)突破，2014年《Nature Methods》將基因組編輯技術(shù)評為過去十年中對生物學(xué)研究最有影響力的十項研究方法之一。ZFN、TALEN和CRISPR/CAS9技術(shù)已成功用于黑長尾猴、大鼠、線蟲、小鼠、中國倉鼠、非洲爪蟾卵細(xì)胞、斑馬魚、果蠅、海膽、家蠶、擬南芥、煙草、玉米、大豆等模式生物的細(xì)胞或胚胎的內(nèi)源基因的定點突變，特別是在果蠅、斑馬魚、大鼠等物種中獲得了可穩(wěn)定遺傳的突變體[8-14]。部分已經(jīng)報道的基因組編輯的物種和基因等信息見表1[15-30]。

在動物或人類的基因治療等應(yīng)用中，由于現(xiàn)有的基因組編輯技術(shù)存在一定的脫靶效應(yīng)，可能造成致命的后果，其安全性備受關(guān)注。在植物生產(chǎn)中，脫靶效應(yīng)不是應(yīng)用的主要制約因素。因此，在培育過程中可以通過全基因組測序、分子檢測等手段可評價是否存在脫靶，或通過與親本多次回交降低脫靶位點的頻率，從而可以有效避免因脫靶效應(yīng)帶來的潛在風(fēng)險[31]。因此，基因組編輯植物產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用相對成熟。迄今為止，基因組編輯植物已經(jīng)開始商業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用。2009年，SHUKLA等[32]利用ZFN將除草劑抗性基因?qū)胗衩谆蚪M的預(yù)設(shè)位點，破壞玉米中的ZmIPK1，抑制肌醇六磷酸的合成，獲得了抗除草劑和減少肌醇六磷酸水平的植株。CAI等[33]利用ZFN改變煙草植物細(xì)胞單個基因的序列，獲得了耐除草劑的煙草。2012年，愛荷華州立大學(xué)LI等[34]利用TALEN技術(shù)對水稻感病基因OsSWEET14進(jìn)行編輯后，提高了水稻對白葉枯病的抗性；2012年，美國政府已經(jīng)批準(zhǔn)了首個基因組定向修飾的磷高效玉米，可以直接作為常規(guī)品種進(jìn)行田間評價。2014年，美國Cellectis Plant Sciences公司利用基因組編輯敲除大豆脂肪脫氫酶2個基因家族，得到的大豆中油酸含量從20%提高到80%，并降低了儲存中易發(fā)生氧化的亞油酸含量，顯著改善了大豆油的品質(zhì)[35]。2015年，美國Calyxt公司利用TALEN技術(shù)對一個馬鈴薯品系進(jìn)行了基因編輯，降低了天門冬酰胺和單糖的含量，提高馬鈴薯的耐儲藏性，并減少高溫烹飪時產(chǎn)生的致癌物質(zhì)丙烯酰胺[35]。Calyxt公司還利用TALEN技術(shù)研發(fā)了2種大豆改良品系，其單不飽和脂肪酸的含量與橄欖油和菜籽油相當(dāng)。2016年，杜邦公司利用CRISPR技術(shù)將自然存在的糯玉米性狀直接引入優(yōu)秀的高產(chǎn)雜交品種中，解決了糯玉米產(chǎn)量低的問題[36]。2016年，利用CRISPR技術(shù)對雙孢菇（Agaricusbisporus）中一類編碼導(dǎo)致褐變的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）基因家族進(jìn)行了刪除，將PPO酶的活性降低了30%，讓雙孢菇抗褐變[37]。

中國基因組編輯技術(shù)進(jìn)展迅速，特別是在轉(zhuǎn)基因動物領(lǐng)域。2016年，GAO等[5]和XU等[6]發(fā)明了新的基因組編輯技術(shù)NgAgo和SGN。高彩霞等通過基因組編輯水稻甜菜堿乙醛脫氫酶基因（OsBADH2），改善了稻米的香味品質(zhì)[38]；在小麥中，同時敲除 A、B和 D基因組上 3個拷貝的白粉病基因（mildew resistance locus O，MLO），獲得了對白粉病具有廣譜和持久抗性的小麥材料[39-40]。2011年，YU等[41]通過ZFN技術(shù)成功地在牛上實現(xiàn)了基因定點突變，得到了β-乳球蛋白基因敲除牛。2012年，QIAN等[42]利用ZFN技術(shù)制備了肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）基因編輯梅山豬，該豬具有顯著的高瘦肉率表型，并進(jìn)入轉(zhuǎn)基因生物安全評價的環(huán)境釋放階段；在2013年和2014年又利用TALEN技術(shù)制備了MSTN基因編輯梅山豬和大白豬（未發(fā)表），并進(jìn)入轉(zhuǎn)基因生物安全評價的中間階段。2013年，LIU等[43]利用ZFN技術(shù)將溶葡萄球菌素（lysostaphin）基因插入到 β-酪蛋白（beta-casein）基因座，制備的基因編輯牛的乳腺能夠生成溶葡萄球菌素蛋白；2014年，LIU等[44]通過ZFN技術(shù)將人溶菌酶（human lysozyme，hlyz）基因插入到牛的β-酪蛋白基因座，獲得的轉(zhuǎn)基因牛的乳汁中可分泌人溶菌酶，具有殺死金黃色葡萄球菌的能力。2015年，WU等[45]利用TALENs技術(shù)將胞內(nèi)病原體抗性基因1（intracellular pathogen resistance1，Ipr1）定點插入牛的基因組中，使轉(zhuǎn)基因牛獲得了抵抗結(jié)核病的能力，為中國抗結(jié)核病轉(zhuǎn)基因牛新品種培育奠定了良好的基礎(chǔ)。2016年，LUO等[46]利用TALEN技術(shù)將人血清白蛋白基因定點插入到牛β乳球蛋白座位上，并制備了轉(zhuǎn)基因牛。同時，中國學(xué)者利用基因組編輯技術(shù)，發(fā)掘了Rosa26[47]、H11[48]等“友好基因座”位點，制備了一批具有重要醫(yī)學(xué)價值的人類疾病模型[49-52]及生產(chǎn)人藥用蛋白的動物生物反應(yīng)器[53-54]。

表1 使用ZFN、TALEN和CRISPR/Cas對生物體進(jìn)行基因組修飾統(tǒng)計表Table1 List of the applications of genome editing using ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas systems

ZFN系統(tǒng)由于鋅指單元與靶序列結(jié)合的特異性有限，其脫靶效應(yīng)較高，限制了ZFN技術(shù)的應(yīng)用。TALEN和CRISPR/Cas9系統(tǒng)特異性高，脫靶效應(yīng)較低，已經(jīng)基本上代替了ZFN用于基因組編輯。特別是CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有構(gòu)建簡單、突變效率高、成本低、多靶點同時突變等優(yōu)點，被廣泛地應(yīng)用于動植物的精準(zhǔn)遺傳改良[11-12]。2016年，NgAgo和SGN兩種新的基因組編輯技術(shù)被首次報道，引起了科學(xué)界的熱議，其有望成為繼CRISPR/Cas9技術(shù)之后的更具突破性和適用性的基因組編輯技術(shù)。但是，針對這兩種新編輯技術(shù)的未來還需要更多的試驗和實際應(yīng)用來進(jìn)行驗證。

3 基因組編輯技術(shù)主要優(yōu)勢

3.1 較高的安全性

基因組編輯技術(shù)在進(jìn)行基因敲除或替換時，序列和結(jié)構(gòu)特異核酸酶的整合位點與靶基因位點通常不在同一染色體上，通過后代的自然分離即可獲得無轉(zhuǎn)基因痕跡的遺傳材料。如果采用序列特異核酸酶的瞬時表達(dá)等方法，可使人工核酸酶基因不整合到受體基因組的同時獲得基因定點敲除或替換突變體。基因組編輯獲得的突變體一般只有幾個堿基的刪除或者改變，與傳統(tǒng)的天然突變、人工誘變和種內(nèi)雜交獲得的遺傳材料相類似，而且基因組編輯引發(fā)的突變是定向的，相比非定向的傳統(tǒng)誘變技術(shù)可以很大程度減少隨機(jī)突變所帶來的非預(yù)期效應(yīng)。在定點插入方面，基因組編輯技術(shù)主要是利用同源重組的方式，可以做到外源DNA序列的定點插入整合，與傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)相比，極大地減少了由于隨機(jī)插入和整合所帶來的非預(yù)期效應(yīng)產(chǎn)生的安全性風(fēng)險。因此，從技術(shù)層面上基因組編輯技術(shù)比傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)具有較高的安全性。

3.2 多位點突變

利用TALEN或CRISPR技術(shù)，可以將多個序列特異性核酸內(nèi)切酶識別位點同時導(dǎo)入細(xì)胞，實現(xiàn)DNA片段刪除、倒位、易位等染色體重組及多基因敲除[11-12]。染色體重組和多基因敲除是反向遺傳學(xué)研究的重要技術(shù)手段。利用多基因敲除技術(shù)可提高復(fù)雜數(shù)量性狀基因功能研究的效率，構(gòu)建多基因缺失突變體，實現(xiàn)多個關(guān)聯(lián)基因的功能網(wǎng)絡(luò)研究。同時，也可以通過構(gòu)建成千上萬基因的大規(guī)模向?qū)gRNA文庫，從全基因組層面進(jìn)行定點敲除、抑制、激活，再結(jié)合功能性篩選平臺和深度測序技術(shù)，實現(xiàn)高通量方式進(jìn)行全基因組范圍的飽和篩選，全面認(rèn)識基因的功能和相互作用網(wǎng)絡(luò)。

3.3 研發(fā)成本低

基因組編輯技術(shù)最顯著的特點是“精準(zhǔn)靶定目標(biāo)位點”，突破了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)外源基因“隨機(jī)插入”受體基因組的瓶頸，直接將基因型和表現(xiàn)型聯(lián)系在一起，極大地減少了需要篩選的群體樣本數(shù)量，可準(zhǔn)確判斷基因的功能和育種應(yīng)用價值，提高了產(chǎn)品研發(fā)速度，降低了研發(fā)成本。另外，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)通過不斷改進(jìn)，其載體構(gòu)建更加簡單易行，靶向效率更高，極大地降低了實驗室研發(fā)成本。

4 基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品安全管理的探討

基因組編輯技術(shù)及其產(chǎn)品已經(jīng)從實驗室研究階段逐步進(jìn)入產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用階段，基因組編輯產(chǎn)品將對農(nóng)牧漁業(yè)生產(chǎn)、糧食安全、醫(yī)療健康產(chǎn)業(yè)等國計民生產(chǎn)生重大而深遠(yuǎn)的影響，其潛在經(jīng)濟(jì)效益更是不可估量。在分子育種方面，基因組編輯技術(shù)已經(jīng)展現(xiàn)了較傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因技術(shù)高效、精準(zhǔn)、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢，未來將會有大量的基因組編輯作物新品種出現(xiàn)。鑒于世界各國對于轉(zhuǎn)基因技術(shù)及轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性的高度關(guān)注和爭議，通過基因組編輯技術(shù)獲得的產(chǎn)品的安全性將會同樣引起全社會的關(guān)注。中國在基因組編輯技術(shù)研究和應(yīng)用方面已處于世界前列，理應(yīng)盡早思考和規(guī)劃即將出現(xiàn)的基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品和新品種的安全性及其安全性管理，促進(jìn)其產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，切實為國家的生物安全和糧食安全作出重要貢獻(xiàn)。

4.1 國外安全評價和管理現(xiàn)狀

自2014年開始，歐美等國多家公司相繼研發(fā)生產(chǎn)了源于基因組編輯技術(shù)的作物新品種，并向本國政府提交了這些新品種的商業(yè)化應(yīng)用申請。由于基因組編輯技術(shù)作為一種新的技術(shù)，世界各國還沒有明確的、針對性的法律法規(guī)，目前，對于這類產(chǎn)品的安全性及其安全管理很大程度上還處于討論階段或者是發(fā)布初步的管理建議。

2015年7月，美國白宮表示，將對1992年頒發(fā)的《生物科技產(chǎn)品的審核框架》進(jìn)行修訂，重新明確美國食品與藥物監(jiān)督管理局（FDA）、美國農(nóng)業(yè)部（USDA）和美國環(huán)境保護(hù)署（EPA）在判定轉(zhuǎn)基因動植物安全性中的地位和作用。此外，針對新型技術(shù)的審核過程也將進(jìn)行更新修正。如對基因組編輯產(chǎn)品的監(jiān)管遵循個案分析的原則，以科學(xué)為基礎(chǔ)開展。美國農(nóng)業(yè)部認(rèn)為某些基因組編輯作物與傳統(tǒng)育種得到的作物相似，基因組編輯作物不需要像轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品那樣進(jìn)行審批管理。2016年 5月，美國農(nóng)業(yè)部宣布利用CRISPR-Cas9基因組編輯的蘑菇和玉米不屬于轉(zhuǎn)基因生物監(jiān)管范疇[53]。2015年，阿根廷決定針對新的育種技術(shù)產(chǎn)品（包括基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品），實施“個案分析”的管理審批政策，如果確認(rèn)最終產(chǎn)品不含有外源基因，則不屬于轉(zhuǎn)基因生物監(jiān)管范疇[56]。2013年，澳大利亞新西蘭食品標(biāo)準(zhǔn)局建議，簡單的堿基缺失的基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品不屬于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，但是有新的外源DNA插入的基因組編輯產(chǎn)品仍將被認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行管理。日本明確表示基因組編輯產(chǎn)品不屬于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的范疇，和常規(guī)作物產(chǎn)品一樣。加拿大對于基因組編輯產(chǎn)品的管理基于產(chǎn)品管理的原則，關(guān)注其是否產(chǎn)生新的性狀，而不考慮利用什么樣的技術(shù)獲得新性狀[57]。歷來對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品持相對保守態(tài)度的歐盟也在審視其針對基因組編輯技術(shù)的政策。歐盟委員會已啟動了對“轉(zhuǎn)基因生物體”定義的法律審查程序，重新定義轉(zhuǎn)基因生物體。歐洲食品安全局轉(zhuǎn)基因生物小組則表示，如果新品種中無外源遺傳物質(zhì)且基因組編輯產(chǎn)生改變與自然突變無法區(qū)分，不應(yīng)作為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品對待。歐洲科學(xué)院科學(xué)咨詢委員會認(rèn)為，需要對新產(chǎn)品進(jìn)行評估，不對育種技術(shù)進(jìn)行風(fēng)險評估。

4.2 中國安全評價和管理探討

中國已利用基因組編輯技術(shù)研發(fā)了一系列的水稻、小麥和動物等新品系[38-54]，具有良好的商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用前景。為此，中國農(nóng)業(yè)管理部門十分重視基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品的安全性及其安全管理，努力為新產(chǎn)品的生產(chǎn)應(yīng)用保駕護(hù)航。以李家洋院士牽頭的研究小組，提出了基因組編輯作物管理框架，包括5個關(guān)鍵點，即：（1）產(chǎn)品在實驗室和田間試驗階段，應(yīng)該嚴(yán)格控制管理，避免向外界逃逸。（2）如果開發(fā)過程中基因編輯的元件以DNA載體的形式引入，必須確?；蚪M編輯作物中的外源DNA被完全去除。（3）準(zhǔn)確報告記錄靶標(biāo)位點處詳盡的DNA序列變化。如果通過同源重組引入了新的序列，需確定供體和受體的親緣關(guān)系，以此來表征引入的序列與遺傳背景是否有新的相互作用可能性。若通過同源重組引入的外源基因與受體親緣關(guān)系很遠(yuǎn)，須具體情況具體分析。（4）確保產(chǎn)品中的主要靶點沒有發(fā)生非預(yù)期的二次編輯事件，并基于現(xiàn)有參考基因組信息和全基因組重測序技術(shù)，評價是否發(fā)生脫靶效應(yīng)及其可能的安全性風(fēng)險。（5）以上4點應(yīng)在新品種登記資料中詳細(xì)說明備案。只有在滿足上述5個條件的基礎(chǔ)上，基因組編輯作物產(chǎn)品在進(jìn)入市場之前才能和常規(guī)育種作物同等監(jiān)管[55]。

在上述基因組編輯作物管理框架的基礎(chǔ)上，結(jié)合中國轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例，從以下4個方面探討了中國今后對于基因組編輯作物的安全性評價和管理。

4.2.1 明確基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品的安全管理范疇中國《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》第三條明確定義，“本條例所稱的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物，是指利用基因工程技術(shù)改變基因組構(gòu)成，用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)或者農(nóng)產(chǎn)品加工的動植物、微生物及其產(chǎn)品”?；蚪M編輯技術(shù)主要是對基因組DNA序列進(jìn)行定向修飾的技術(shù)，其屬于基因工程技術(shù)范疇。根據(jù)上述定義，通過基因組編輯技術(shù)獲得的農(nóng)作物其產(chǎn)品，應(yīng)該屬于農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物，應(yīng)依法納入農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理范疇。但由于《條例》主要是針對第一代轉(zhuǎn)基因技術(shù)而言，即通過基因工程技術(shù)，在受體基因組上插入整合了外源DNA序列，而獲得的具有新的性狀的產(chǎn)品?；蚪M編輯技術(shù)主要用來對靶標(biāo)基因進(jìn)行精準(zhǔn)修飾或?qū)⒛繕?biāo)基因定點整合到基因組中，對內(nèi)源基因進(jìn)行精準(zhǔn)修飾時只在操作過程中涉及外源DNA的導(dǎo)入，篩選的后代中只有目標(biāo)基因被修飾而不含有外源DNA，與傳統(tǒng)誘變育種獲得的最終產(chǎn)品相似，因此，建議將進(jìn)行基因精準(zhǔn)修飾獲得的少量堿基缺失、替換或者敲除的突變體類新產(chǎn)品視為特殊農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，可簡化這一類產(chǎn)品的安全評價和管理。通過基因組編輯技術(shù)進(jìn)行定點整合有外源DNA插入的，則按傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行安全評價和管理。

4.2.2 確定安全評價的內(nèi)容 現(xiàn)階段，中國基于實質(zhì)等同性和個案分析的原則，對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行安全性評價管理，主要包括3個方面的內(nèi)容：分子特征評價、環(huán)境安全評價和食用安全評價。對于基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品，仍然需要按照轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行安全性評價管理。應(yīng)重點關(guān)注是否存在非預(yù)期的基因編輯，是否產(chǎn)生新的環(huán)境安全和食用安全風(fēng)險。其中，堿基缺失或敲除的突變體類基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品可簡化安全性評價管理，重點開展分子特征評價和食用安全評價。安全性評價的具體內(nèi)容可參考傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因生物安全評價辦法和評價指南。但是，對分子特征的評價，可利用全基因組重測序等手段進(jìn)行分析，以便清楚地解釋基因組編輯發(fā)生的位點，以及引起的缺失、插入、重組等。

4.2.3 建立分子檢測新方法 基因組編輯技術(shù)由于其定點編輯，且在改造的受體生物體內(nèi)留下的痕跡較少，原有的分子生物學(xué)檢測技術(shù)方法，如蛋白質(zhì)水平和核酸水平檢測方法，已經(jīng)很難滿足基因組編輯產(chǎn)品的檢測，特別是單堿基或少量堿基缺失的基因組編輯產(chǎn)品。需要加強(qiáng)檢測新技術(shù)的研究，建立特異性的針對基因組編輯產(chǎn)品的檢測新方法，以保護(hù)研發(fā)人的知識產(chǎn)權(quán)，為國家安全監(jiān)管監(jiān)測提供有力的技術(shù)支撐。

4.2.4 完善配套的安全管理法律法規(guī) 2001年，中國頒布《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》，2002年農(nóng)業(yè)部發(fā)布了《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價管理辦法》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)口安全管理辦法》和《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識管理辦法》等 3個配套管理辦法，對轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)行全程監(jiān)控。近幾年，為規(guī)范管理轉(zhuǎn)基因生物，又制定了安全評價指南和一系列檢測標(biāo)準(zhǔn)，使轉(zhuǎn)基因生物研發(fā)人員、轉(zhuǎn)基因檢測機(jī)構(gòu)和國家農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價委員會工作有章可循、有據(jù)可依。隨著基因組編輯技術(shù)的研發(fā)應(yīng)用，原有法規(guī)中規(guī)定的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物概念的范圍等已經(jīng)不完全適合于基因組編輯技術(shù)產(chǎn)品。因此，中國亟需對已有的法律法規(guī)進(jìn)行修改完善，參考國際上先進(jìn)做法，相機(jī)而行。促進(jìn)新技術(shù)的發(fā)展，推進(jìn)第二代基因工程育種技術(shù)創(chuàng)新性革命，創(chuàng)制新農(nóng)作物種質(zhì)資源，培育突破性新品種。

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（責(zé)任編輯 李莉）

The Safety Management of Genome Editing Technology

SHEN Ping1, ZHANG QiuYan2, YANG LiTao3, ZHANG Li4, LI WenLong1, LIANG JinGang1, LI XiaYing1, WANG HaoQian1, SHEN XiaoLing5, SONG GuiWen1
(1Science and Technology Development Center, Ministry of Agriculture, Beijing 100122;2Agro-Environmental Protection Institute, Ministry of Agriculture, Tianjin 300191;3Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240;4School of Life Science, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074;5Tianjin Academy of Agriculture Science, Tianjin 300381)

Genome editing technologies using sequence-specific nuclease (SSN) creates DNA double-strand breaks (DSBs) in the genomic target sites, and the DSBs can be repaired by the non-homologous end joining (NHEJ) or homologous recombination (HR) pathways with the help of artificially engineered nucleases, which can be employed to achieve targeted genome modifications such as gene mutation, gene insertion, gene replacement or chromosome rearrangement. There are three major artificially engineered nucleases including zinc finger nuclease (ZFN), transcription activator-like effector nuclease (TALEN) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9 (CRISPR/Cas9) systems. The genome editing techniques have been widely used in the fields of plant gene function research, molecular breeding, and etc. The genome editing crops (GEC) showpromising application prospects compared with traditional genetically modified organism (GMO). The GECs with good traits have been gradually transferred from labs to fields. Herein, the principles, characters, and applications of these three mainly used techniques in animal and plants genome editing have been described. The advantages and disadvantages compared with conventional transgenic technique were also discussed, including the safety came from the off-target effects. The management regulations of GECs of different countries in global area were elaborated. Finally, the safety management of GECs and their products in China were discussed combined with Chinese current regulations on the safety management of GMOs, so as to facilitate the development and commercialization of GECs and their products.

genome editing; genetically modified organisms; safety management

2016-10-19；接受日期：2016-11-17

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項（2016ZX08012-003）

聯(lián)系方式：沈平，Tel：010-59198111；E-mail：shenping84@Hotmail.com。通信作者宋貴文，Tel：010-59198150；E-mail：songguiwen@agri.gov.cn