趙 新， 蘭青闊， 陳 銳， 朱 珠， 劉 娜， 王 永

（天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，天津300381）

應(yīng)用微滴數(shù)字PCR技術(shù)快速檢測(cè)食用菌中沙門氏菌

趙 新， 蘭青闊， 陳 銳， 朱 珠， 劉 娜， 王 永*

（天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，天津300381）

定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估是整個(gè)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系的發(fā)展趨勢(shì)和終極體現(xiàn)形式，而快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的定量技術(shù)則是保障整個(gè)體系順利、有效完成的核心支撐。作者根據(jù)沙門氏菌invA毒力基因序列，在前人對(duì)引物研究結(jié)果基礎(chǔ)上，合成特異性引物和探針。以沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為研究對(duì)象，建立沙門氏菌微滴數(shù)字PCR的快速定量檢測(cè)方法，并對(duì)其特異性、靈敏度、樣品實(shí)測(cè)等關(guān)鍵指標(biāo)與傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行對(duì)照驗(yàn)證。結(jié)果表明，所建立的微滴數(shù)字PCR方法具有較好的特異性，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到102CFU/mL，樣品實(shí)測(cè)與傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)法對(duì)比，二者符合率100%。所建立的沙門氏菌微滴數(shù)字PCR定量檢測(cè)方法，可以快速、準(zhǔn)確、直接地分析沙門氏菌的含量，無(wú)需構(gòu)建質(zhì)粒和標(biāo)準(zhǔn)曲線，避免了因標(biāo)準(zhǔn)曲線量值偏差而影響樣品定值的準(zhǔn)確性，所建立的方法為食源性沙門氏菌污染的快速定量檢測(cè)提供了技術(shù)支撐，為微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系的完善奠定了基礎(chǔ)。

微滴數(shù)字PCR技術(shù)；沙門氏菌；定量檢測(cè)

食用菌是一類有機(jī)、營(yíng)養(yǎng)、保健的綠色食品，為人們廣泛食用。質(zhì)檢總局將食品安全的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)列入了民生民計(jì)的重大解決問題，影響食品安全的因素有很多，而其中由微生物危害導(dǎo)致的食品安全問題達(dá)到了總量的40%[1-2]。當(dāng)前中國(guó)在食源性病原菌微生物方面面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，急需對(duì)潛在危害做出合理的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，將危害控制在可接受水平[3]。而目前微生物定量監(jiān)測(cè)的技術(shù)手段主要為傳統(tǒng)培養(yǎng)法，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，輔助的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，雖在時(shí)間上有了很大突破，但其定量結(jié)果的準(zhǔn)確性要依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建的準(zhǔn)確性和引物的擴(kuò)增效率，而微滴數(shù)字PCR技術(shù)在食源性病原菌上的應(yīng)用，彌補(bǔ)了這一缺陷。

微滴數(shù)字PCR技術(shù)作為第三代PCR技術(shù)，是在傳統(tǒng)PCR方法基礎(chǔ)上采用一種全新的方式進(jìn)行核酸分子的定量，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相比，無(wú)需構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，不受擴(kuò)增效率的影響，其結(jié)果具有更高的精確度、準(zhǔn)確性和靈敏度。微滴數(shù)字PCR的核心是能夠?qū)⒁环輼悠贩殖?0 000個(gè)納升級(jí)的微滴，其中每個(gè)微滴或不含待檢核酸靶分子，或者含有一個(gè)至數(shù)個(gè)待檢核酸靶分子，且每個(gè)微滴都作為一個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)器。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，采用微滴分析儀逐個(gè)對(duì)每個(gè)微滴進(jìn)行檢測(cè)，有熒光信號(hào)的微滴判讀為1，沒有熒光信號(hào)的微滴判讀為0，最終根據(jù)泊松分布原理以及陽(yáng)性微滴的比例，分析軟件可計(jì)算給出待檢靶分子的濃度或拷貝數(shù)，以絕對(duì)定量的方式直接“數(shù)”出靶分子的個(gè)數(shù)[4]。

沙門氏菌是腸道桿菌中最重要的病原菌，人的沙門氏菌感染和帶菌非常普遍。食用生前感染的動(dòng)物或食品受到污染，均可使人發(fā)生食物中毒。在世界各地的食物中毒中，沙門氏菌食物中毒常占首位或第二位。傳統(tǒng)培養(yǎng)法是目前常用檢測(cè)方法，但其檢測(cè)沙門氏菌的檢驗(yàn)程序復(fù)雜繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力，全過程需至少4～7 d，才能得出明確的診斷結(jié)果。因而，建立一種準(zhǔn)確快速的檢測(cè)沙門氏菌的方法一直是研究的熱點(diǎn)[5]，而微滴數(shù)字PCR的應(yīng)用解決了這一難題，并填補(bǔ)了微滴數(shù)字PCR技術(shù)在食源性病原菌檢測(cè)上的空白。

研究表明，沙門氏菌的侵襲蛋白（invasion protein，inv）決定細(xì)菌進(jìn)入宿主上皮細(xì)胞的能力，與沙門氏菌的致病性密切相關(guān)，它是由invA、invB、invC、invD和invE等一組基因編碼，其中invA為沙門氏菌的主要毒力因子，因此在前人研究的基礎(chǔ)上根據(jù)invA毒力基因序列合成特異性引物和TaqMan探針，通過特異性、靈敏度等試驗(yàn)的優(yōu)化摸索，建立微滴數(shù)字PCR沙門氏菌快速定量檢測(cè)方法，以克服傳統(tǒng)致病微生物檢測(cè)方法的諸多不便，并與傳統(tǒng)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比較，為食源性病原菌檢測(cè)開辟了新的技術(shù)領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙型副傷寒沙門氏菌CMCC（B）50094、甲型副傷寒沙門氏菌CMCC（B）50433、鼠傷寒沙門氏菌CMCC（B）50013、腸炎沙門氏菌CMCC（B）50041、金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、蠟樣芽孢桿菌CMCC（B）63301、枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501、大腸埃希氏菌CMCC（B）44102、單核增生李斯特氏菌CMCC（B）54002、痢疾志賀氏菌CMCC（B）51592、銅綠假單胞菌CMCC（B）10104、馬紅球菌ATCC6939、乙型溶血性鏈球菌CMCC（B）32210：作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏標(biāo)準(zhǔn)菌株。

緩沖蛋白胨水（BPW）培養(yǎng)基、生化鑒定試劑盒：北京陸橋有限公司；法國(guó)科瑪嘉沙門氏菌顯色培養(yǎng)基：鄭州博賽生物科技有限公司；微滴數(shù)字PCR試劑，包括ddPCR Supermix for probes、Droplet Generator Oil：美國(guó) Bio-Rad公司；Chelex-100 sodium：Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

QX-l00微滴式數(shù)字PCR儀：美國(guó)Bio-Rad公司；Allegra 21R Centrifuge高速冷凍離心機(jī)：美國(guó)BECKMAN公司；PCR儀：德國(guó)耶拿；制冰機(jī)：日本三洋公司；電磁爐：天津中環(huán)電爐實(shí)驗(yàn)有限公司；全自動(dòng)高壓滅菌鍋：日本三洋；生物安全柜、超凈工作臺(tái)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、OLYMPUS CX31顯微鏡等。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針的合成 根據(jù)沙門氏菌invA毒力基因序列，在前人研究的基礎(chǔ)上[6]，合成特異性引物和探針序列，由上海生工生物工程有限公司完成，上游引物5ˊ-CTCACCAGGAGATTACAACATG G-3ˊ，下游引物5ˊ-AGCTCAGACCAAAAGTGAC CATC-3ˊ，熒光探針5ˊ-CACCGACGGCGAGACC GACTTT-3ˊ，探針5ˊ端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)FAM，3ˊ端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。

1.3.2 傳統(tǒng)培養(yǎng)法計(jì)數(shù) 取5種沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株磁珠，分別接種于緩沖蛋白胨水中，于（36±1）℃培養(yǎng)箱增菌8 h，增菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋制成不同濃度的菌懸液，參照傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)培養(yǎng)法（GB 4789.4-2010）[7]選擇適宜的梯度分別計(jì)數(shù)，并對(duì)典型菌落進(jìn)行生化鑒定和血清學(xué)鑒定。

1.3.3 沙門氏菌DNA提取 分別取108～105CFU/mL 4個(gè)稀釋度菌懸液1 mL離心取沉淀，沉淀中加入100 μL 13%Chelex-100溶液，振蕩混勻，100℃水浴10 min后，立即冰浴10 min，13 200 r/min離心3 min，上清液即為DNA溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 微滴數(shù)字PCR檢測(cè)體系的建立 在20 μL的PCR反應(yīng)體系中，包括2×ddPCR Supermix for probes預(yù)混液10 μL，上下游引物和探針各1 μL，模板1 μL，無(wú)菌超純水補(bǔ)足20 μL，混勻后離心。將其小心轉(zhuǎn)移至微卡發(fā)生器，切忌產(chǎn)生氣泡，同時(shí)與微卡發(fā)生器相應(yīng)位置加入重油70 μL，蓋上墊片，放入微滴生成器中生成微滴。吸取40 μL生成的微滴，小心轉(zhuǎn)移至數(shù)字PCR96孔反應(yīng)板中，170℃熱封后在PCR儀上開始循環(huán)，PCR儀爬坡速度設(shè)置為2℃/s，循環(huán)參數(shù)為：95℃，10 min；40cycles（94℃，30 s，60℃，1 min）；98℃，10 min。

1.3.5 特異性實(shí)驗(yàn) 分別選取金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希氏菌、單核增生李斯特氏菌、痢疾志賀氏菌、銅綠假單胞菌、馬紅球菌、乙型溶血性鏈球菌適宜梯度濃度的DNA作為PCR反應(yīng)的模板，各取1 μL，以乙型副傷寒沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌DNA作為陽(yáng)性對(duì)照模板，分別按1.3.4所建立的微滴數(shù)字PCR檢測(cè)體系進(jìn)行定量分析，以驗(yàn)證所設(shè)計(jì)引物、探針的特異性。

1.3.6 靈敏度實(shí)驗(yàn) 分別選取 106、105、104、103、102、101、100CFU/mL 7個(gè)梯度稀釋度菌懸液進(jìn)行DNA提取，各取1 μL作為PCR反應(yīng)模板，以1.3.4所建立的微滴數(shù)字PCR檢測(cè)體系進(jìn)行定量分析，確定所建立方法的檢測(cè)靈敏度。

1.3.7 模擬污染樣品的檢測(cè) 將沙門氏菌制備一定濃度的菌懸液，分別取1 mL加入10 g滅菌的金針菇樣品中，制成模擬污染待測(cè)樣，同時(shí)以滅菌金針菇樣品作為空白本底對(duì)照。于模擬污染待測(cè)樣中加入90 mL緩沖蛋白胨水，均質(zhì)后取1 mL稀釋液按照1.3.3的方法進(jìn)行DNA提取，取1 μL作為PCR反應(yīng)模板，以1.3.5所建立的微滴生成步驟和擴(kuò)增程序進(jìn)行數(shù)字PCR絕對(duì)定量分析，同時(shí)與傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)法相驗(yàn)證。

1.3.8 樣品實(shí)測(cè) 將120份不同食用菌樣品（樣品來(lái)自農(nóng)業(yè)部風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目山東、河南兩地的市場(chǎng)抽樣匯總）參照傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)方法分別制備1∶10的稀釋液，對(duì)稀釋液進(jìn)行DNA提取，采用所建立的微滴數(shù)字PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)將樣品進(jìn)一步稀釋與傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)方法進(jìn)行對(duì)照，驗(yàn)證所建立的微滴數(shù)字PCR方法檢測(cè)沙門氏菌的適用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)培養(yǎng)法測(cè)定結(jié)果

4種沙門氏菌磁珠經(jīng)復(fù)蘇活化后，參照GB 4789.4-2010進(jìn)行傳統(tǒng)培養(yǎng)及生化鑒定，對(duì)活化菌液濃度進(jìn)行計(jì)數(shù)測(cè)定，整個(gè)過程要7 d，結(jié)果見表1。

表1 4種沙門氏菌活化菌液計(jì)數(shù)結(jié)果Table 1 Count results of four Salmonella spp.

2.2 沙門氏菌DNA提取結(jié)果

利用簡(jiǎn)易的Chelex-100法提取的細(xì)菌DNA完整性較好，同時(shí)Chelex-100中的螯合劑又對(duì)雜質(zhì)具有一定的吸附能力，從而減少雜質(zhì)對(duì)PCR擴(kuò)增體系的抑制，保證DNA標(biāo)本初始濃度。對(duì)4種沙門氏菌的4種梯度濃度的DNA提取結(jié)果見表2。

2.3 沙門氏菌微滴數(shù)字PCR分析結(jié)果

對(duì)4種沙門氏菌的4種濃度梯度進(jìn)行微滴數(shù)字PCR定量檢測(cè)，同時(shí)與傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)果相驗(yàn)證，以確定所建立方法的準(zhǔn)確性以及對(duì)沙門氏菌的適用性。由于數(shù)字PCR最終的拷貝數(shù)濃度是由陽(yáng)性微滴數(shù)與總微滴數(shù)的泊松分布情況換算得來(lái)，因此要求陽(yáng)性微滴數(shù)不能過于接近總微滴數(shù)，否則會(huì)影響換算結(jié)果的可信性。4種沙門氏菌4種濃度梯度的微滴分析結(jié)果見表3和圖1。我們得出106CFU/mL的菌液濃度是數(shù)字PCR最高分析濃度，同時(shí)根據(jù)DNA提取菌量為1 mL，回溶量為100 μL，PCR總體系20 μL，上樣模板1 μL，推算菌液濃度換算公式為CFU/mL=拷貝數(shù)/μL×20 μL×100 μL，經(jīng)計(jì)算與傳統(tǒng)培養(yǎng)法基本一致。

表2 4種沙門氏菌活化菌液DNA提取結(jié)果Table 2 DNA concentration of four Salmonella spp.

表3 4種沙門氏菌活微滴數(shù)字PCR分析結(jié)果Table 3 Results of four Salmonella spp.by droplet digital PCR

圖1 4種沙門氏菌活微滴數(shù)字PCR分析結(jié)果Fig.1 Results of four Salmonella spp.by droplet digital PCR

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以4種沙門氏菌和9種其它細(xì)菌制備的基因組 DNA為模板，進(jìn)行微滴數(shù)字PCR分析，結(jié)果除沙門氏菌外，其他9種相關(guān)細(xì)菌均無(wú)微滴生成，見圖2。證實(shí)所建立的方法具有較好的特異性。

圖2 方法特異性微滴數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Specificity results of the method by droplet digital PCR

2.5 靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以乙型副傷寒沙門氏菌為例，將其活化菌液作10倍梯度稀釋，進(jìn)行微滴數(shù)字PCR定量檢測(cè)，結(jié)果顯示為106～102CFU/mL，見表4、圖3。均能檢測(cè)到陽(yáng)性微滴，表明本方法最低檢測(cè)限為102CFU/mL菌液濃度。

表4 乙型副傷寒沙門氏菌靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Sensitivity results of Salmonella paratyphi b

圖3 乙型副傷寒沙門氏菌靈敏度實(shí)驗(yàn)微滴數(shù)字PCR分析結(jié)果Fig.3 Sensitivity results of Salmonella paratyphi b by droplet digital PCR

2.6 模擬污染樣品檢測(cè)結(jié)果

取10份模擬污染沙門氏菌的金針菇樣品，分別采用微滴數(shù)字PCR方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法進(jìn)行同步檢測(cè)，結(jié)果兩種方法均能對(duì)金針菇中的沙門氏菌進(jìn)行有效檢出，見表5、圖4。二者符合率為100%。

2.7 樣品實(shí)測(cè)結(jié)果

應(yīng)用微滴數(shù)字PCR方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法分別對(duì)120份不同食用菌樣品進(jìn)行對(duì)比檢測(cè)，結(jié)果微滴數(shù)字PCR方法陽(yáng)性10份，陽(yáng)性檢出率為8.3%，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法一致，見表6。結(jié)果顯示，微滴數(shù)字PCR方法和傳統(tǒng)培養(yǎng)法均能對(duì)食用菌樣品中的沙門氏菌進(jìn)行有效的檢出，而微滴數(shù)字PCR方法整個(gè)實(shí)驗(yàn)可在1 d內(nèi)完成，簡(jiǎn)便快捷，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法（7 d）相比時(shí)間大為縮短。

3 結(jié)語(yǔ)

據(jù)全球食源性致病菌最新數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，沙門氏菌一直是居高不下的食源性危害之首，對(duì)其在食品中的有效監(jiān)測(cè)和控制將成為風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估長(zhǎng)期預(yù)警的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[8-10]。隨著GB29921-2013《食品中致病菌限量》標(biāo)準(zhǔn)的正式發(fā)布實(shí)施，預(yù)示著對(duì)于食品中致病菌的定量檢測(cè)正在不斷的規(guī)范和完善，該標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定了相關(guān)產(chǎn)品不同致病菌的定量判定方法。而微滴數(shù)字PCR技術(shù)開啟了新一代PCR技術(shù)定量檢測(cè)食源性致病菌的先河[11-14]。

試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)微滴數(shù)字PCR方法對(duì)食品中沙門氏菌的檢驗(yàn)具有快速、檢出率高、方便等優(yōu)點(diǎn)，且對(duì)被檢細(xì)菌不需要進(jìn)行純培養(yǎng)，只要存在于增菌培養(yǎng)基中即可檢出，整個(gè)實(shí)驗(yàn)可在1 d內(nèi)完成，簡(jiǎn)便快捷，與傳統(tǒng)培養(yǎng)法（7 d）相比時(shí)間大為縮短，且準(zhǔn)確率高，具有較好的特異性。在120份樣品中，微滴數(shù)字PCR方法檢出10份陽(yáng)性樣品，與傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)方法一致。

表5 10份模擬污染樣品兩種方法實(shí)測(cè)結(jié)果Table 5 Comparison of results detected by two methods of ten simulation samples

圖4 10份模擬污染樣品微滴數(shù)字PCR分析結(jié)果Fig.4 Results of ten simulation samples by droplet digital PCR

然而，數(shù)字PCR也是基于普通常規(guī)PCR的原理，因此常規(guī)PCR中假陽(yáng)性問題的存在，導(dǎo)致了數(shù)字PCR假陽(yáng)性的無(wú)法避免，因此要注意多方面的控制：如引物設(shè)計(jì)；引物探針的保存與使用，避免反復(fù)凍融；數(shù)字PCR微滴操作，防止氣泡產(chǎn)生，但氣泡造成的假陽(yáng)性可以用經(jīng)驗(yàn)排除，其產(chǎn)生的微滴是線性的，非散點(diǎn)式微滴，縱向分布于陽(yáng)性微滴與陰性微滴的交接處；環(huán)境控制，避免污染。

微滴數(shù)字PCR方法簡(jiǎn)單、快捷、靈敏、特異，因此作為一種快速篩查方法用來(lái)檢測(cè)沙門氏菌是完全可行的，符合快速檢測(cè)的要求，且更適合于大批量應(yīng)急預(yù)案樣品的檢測(cè)。在實(shí)際檢測(cè)中也可以將微滴數(shù)字PCR方法和國(guó)標(biāo)方法以及分子生物學(xué)方法結(jié)合應(yīng)用，提高樣品中病原菌的檢出率，但由于數(shù)字PCR檢測(cè)食源性致病菌前期需進(jìn)行DNA提取，而該技術(shù)的可信性濃度范圍的最低檢出限為1個(gè)拷貝數(shù)，由于1 mL菌株中的帶菌量經(jīng)提取轉(zhuǎn)化為20 μL上樣體系中的拷貝數(shù)存在一定的濃度換算，因此要想提高菌株初始濃度的檢出率，可在DNA提取步驟進(jìn)行富集提取，該研究有待于進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。表6 本研究建立的數(shù)字PCR方法和傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)方法的樣品檢測(cè)比對(duì)結(jié)果

Table 6 Comparison of results detected by real-time PCR and traditional national standard method

產(chǎn)品 本研究建立的數(shù)字PCR方法 國(guó)標(biāo)方法GB 4789.4-2010樣品數(shù)/個(gè) 檢出數(shù)/個(gè) 檢出率/% 樣品數(shù)/個(gè) 檢出數(shù)/個(gè) 檢出率/%金針菇 21 3 14.3 21 3 14.3鳳尾菇 36 5 13.9 36 5 13.9鮮香菇 23 0 0 23 0 0雞腿菇 21 2 9.5 21 2 9.5猴頭菇 18 0 0 18 0 0總計(jì) 120 10 8.3 120 10 8.3

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[8]MAURISCHAT S1，BAUMANN B1，MARTIN A，et al.Rapid detection and specific differentiation of Salmonella enterica subsp. Enteritidis，Typhimurium and its monophasic variant 4，[5]，12：i：-by real-time multiplex PCR[J].Int J Food Microbiol，2014，13（193）：8-14.

[9]PARK SH1，RICKE S C.Development of multiplex PCR assay for simultaneous detection of Salmonella genus，Salmonella subspecies I，Salm Enteritidis，Salm Heidelberg and Salm Typhimurium[J].J Appl Microbiol，2014，30（13）：118-124.

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Rapid Detection of Salmonellla spp.in Edible Fungi by Droplet Digital PCR

ZHAO Xin， LAN Qingkuo， CHEN Rui， ZHU Zhu， LIU Na， WANG Yong*
（Tianjin Institute of Agricultural Quality Standard and Testing Technology，Tianjin Academy of Agricultural Sciences，Tianjin，300192，China）

Quantitative Risk Assessment（QRA）is the future trend of the risk assessment system in which simple，rapid and accurate quantitative technologies made crucial contributions to the smooth and efficient accomplishment of QRA.In this study，a method for detecting the virulence-specific gene，invA in Salmonellla spp.was established by using droplet digital PCR technology.In contrast to the traditional method of national standard（GB 4789.4-2010）for Salmonellla detection，our developed method showed higher specificity and sensitivity as low as 102CFU/mL.The coincidence rate was 100%as compared with simulation specimens with culture strains.The establishment of this method based on droplet digital PCR for Salmonella detection provided a rapid and accurate approach for identification of food-borne pathogens without the use of standard curves or plasmids. These results demonstrated that this developed method offered a promising way for rapid quantitativedetection of Salmonella and provided technical support for the future studies of the microbial risk assessment system.

droplet digital PCR，Salmonellla，quantitative detection

TS 251.5

A

1673—1689（2017）03—0315—07

2015-03-02

天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目（14JCQNJC14800）。

趙 新（1983—），女，北京人，理學(xué)碩士，助理研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品分子檢測(cè)技術(shù)方面的研究。E-mail：zhaoxin2008999@126.com

*通信作者：王 永（1977—），男，天津人，理學(xué)博士，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品安全質(zhì)量分子檢測(cè)技術(shù)方面的研究。

E-mail：wyzl2007@yahoo.com.cn

趙新，蘭青闊，陳銳，等.應(yīng)用微滴數(shù)字PCR技術(shù)快速檢測(cè)食用菌中沙門氏菌[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（03）：315-321.