劉 蘇, 楊宇晴, 2, 張海發(fā), 張 勇, 2, 吳錦輝, 黃錦雄, 石和榮

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藍(lán)身大斑石斑魚染色體核型分析

劉 蘇1, 楊宇晴1, 2, 張海發(fā)1, 張 勇1, 2, 吳錦輝1, 黃錦雄1, 石和榮1

(1. 廣東省海洋漁業(yè)試驗(yàn)中心, 廣東 惠州 516081; 2. 中山大學(xué) 水生經(jīng)濟(jì)動物研究所 暨廣東省水生經(jīng)濟(jì)動物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510275)

為了解藍(lán)身大斑石斑魚()的細(xì)胞生物學(xué)特征, 作者采用體內(nèi)注射PHA培養(yǎng)腎細(xì)胞法對藍(lán)身大斑石斑魚染色體核型進(jìn)行了研究。結(jié)果表明, 其染色體核型為2=48t, 屬于石斑魚屬魚類典型的高位類中原始類群, 是石斑魚屬進(jìn)化過程中出現(xiàn)較早的物種。

藍(lán)身大斑石斑魚(); 核型; 染色體

魚類是脊椎動物在自然界中分布最廣、種類最多的類群, 中國魚類資源豐富, 多樣性水平高, 經(jīng)濟(jì)價值大。染色體作為遺傳信息的載體, 其核型具有一定的物種特異性, 對魚類染色體的研究可以探討魚類種群的進(jìn)化和親緣關(guān)系, 為現(xiàn)代遺傳學(xué)提供有價值的理論數(shù)據(jù), 為魚類資源的開發(fā)利用提供科學(xué)的指導(dǎo)。

藍(lán)身大斑石斑魚()是中國沿海養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類之一, 其生長速度快、營養(yǎng)豐富, 具有很高的市場價值, 養(yǎng)殖前景十分廣闊。藍(lán)身大斑石斑魚屬中大型魚類, 性成熟時間較晚, 一般需要3~4齡魚才能達(dá)到初次性成熟, 親魚的培育難度大, 其苗種來源主要靠天然捕撈, 嚴(yán)重制約了養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前對藍(lán)身大斑石斑魚的研究較少, 僅見于線粒體基因克隆[1]、神經(jīng)壞死病毒傳播研究[2]及產(chǎn)卵和幼苗培育的研究[3-4]。本研究利用體內(nèi)注射PHA腎細(xì)胞培養(yǎng)法對藍(lán)身大斑石斑魚染色體核型進(jìn)行了分析, 旨在開展藍(lán)身大斑石斑魚繁殖生物學(xué)的基礎(chǔ)研究, 可為其繁育提供數(shù)據(jù)支持, 為其繁育研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)用藍(lán)身大斑石斑魚取自廣東省海洋漁業(yè)試驗(yàn)中心, 共取樣2尾, 魚體質(zhì)量分別為922.4 g和1 341.3 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 前處理

試驗(yàn)魚按5 mL/kg魚體質(zhì)量進(jìn)行抽血刺激, 按10 μg/g魚體質(zhì)量進(jìn)行胸腔PHA一次性注射, 5 h后注射1 μg/g的秋水仙素, 1.5 h后剪開鰓部動脈放血20 min,取頭腎于0.9%生理鹽水中洗滌, 剪碎, 用紗布過濾細(xì)胞懸液至離心管中, 1 000 r/min離心10 min收集沉淀細(xì)胞, 用生理鹽水洗滌細(xì)胞2次。

1.2.2 制片

低滲: 向離心管中加入5 mL的0.075 mol/L的KCl低滲液, 30℃處理23~33 min, 1 000 r/min離心10 min,棄上清, 留底部沉淀。

固定: 加入5 mL預(yù)冷新配的卡諾氏固定液(甲醇︰冰醋酸=3︰1), 用吸管輕輕吹打沉淀至充分混勻, 固定30 min后1 000 r/min離心10 min, 棄上清, 反復(fù)2次, 第3次固定于冰上進(jìn)行, 棄上清, 留底部沉淀, 加入2~4 mL固定液重新懸浮細(xì)胞, 冰浴10 min。

滴片: 冷滴片法制片。取出預(yù)凍于無水乙醇的干凈玻片, 于濾紙上稍微擦干, 立刻進(jìn)行滴片。滴片前先混勻懸液, 然后用滴管吸取少量懸液, 于距離玻片約50 cm高處滴下, 自然風(fēng)干。

染色: 待玻片完全干透后用10% Giemsa染液倒扣染色30 min, 用蒸餾水沖洗干凈并晾干。

1.2.3 核型分析

用光學(xué)顯微鏡(Olympus)觀察并拍照, 選取清晰的染色體中期分裂相計數(shù)確定染色體眾數(shù); 選取10個分散效果良好、著絲粒清晰、長度適中、兩條單體適度分開、形態(tài)清楚的分裂相放大, 確認(rèn)著絲點(diǎn)位置, 測量并統(tǒng)計每條染色體的相對長度、臂比, 按照Levan等(1964)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配對, 分類排列核型。

2 結(jié)果

對100個圖像清晰, 染色體分散良好的中期分裂相細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計得出, 藍(lán)身大斑石斑魚染色體眾數(shù)為48, 眾數(shù)出現(xiàn)頻率為68%(表1)。對10個中期分裂相進(jìn)行鏡檢和測量, 得出藍(lán)身大斑石斑魚染色體核型公式為2=48t, 由48條端部著絲粒染色體組成(圖1)。

表1 藍(lán)身大斑石斑魚染色體眾數(shù)統(tǒng)計

圖1 藍(lán)身大斑石斑魚染色體核型

由表2可見, 在藍(lán)身大斑石斑魚48條染色體中, 相對長度最大的為2.69%±0.11%; 相對長度最小的為1.38%±0.09%, 明顯短于其他染色體。相對長度最大的染色體與相對長度最小的染色體比值為1.95。

3 討論

3.1 石斑魚染色體制備

無論是何種生物, 獲取新陳代謝活動旺盛、分裂增生較快的組織都是染色體制片取得成功的基本前提[5], 生命活動越旺盛, 則染色體標(biāo)本的制備就越簡單, 獲得的細(xì)胞分裂指數(shù)也越高。大量的研究證實(shí)PHA能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖[6-8], 但每種魚類對PHA的處理濃度和時間差異較大[9-12], 在本研究中, 為獲得更多的分裂相, 除利用10 μg/g魚體質(zhì)量的PHA進(jìn)行腹腔注射外, 還對試驗(yàn)魚進(jìn)行了抽血刺激。結(jié)果表明, 抽血和PHA雙重刺激的處理方法能有效促進(jìn)細(xì)胞增殖, 獲得數(shù)量較多、效果較好的染色體中期分裂相, 與王德祥等[13]研究結(jié)果相一致。

3.2 石斑魚染色體核型與系統(tǒng)分類和種質(zhì)鑒定的關(guān)系

中國已發(fā)現(xiàn)的海水魚類染色體數(shù)目為26~56, 大部分海水魚類染色體數(shù)目為2=48, 根據(jù)原始性狀普遍性原則, 2=48被認(rèn)為是海水魚類原始核型數(shù)目[14-15]。

現(xiàn)有研究表明, 石斑魚二倍體種類的染色體數(shù)目均為2=48, 染色體數(shù)目具有高度一致性, 但不同魚種類的核型結(jié)果不同, 可用作鑒別不同種屬的重要依據(jù)[16-17]。目前, 石斑魚的分類主要依據(jù)其外部形態(tài)特征, 但其體色和斑紋易受到環(huán)境、年齡和生理變化的影響而發(fā)生改變, 給分類鑒定造成極大的困難。許多石斑魚的外形特征極為相似, 特別是在應(yīng)激狀態(tài)下, 難以根據(jù)外部形態(tài)將它們區(qū)分開來, 如七帶石斑魚()和褐石斑魚()、斜帶石斑魚()和點(diǎn)帶石斑魚()等,然而它們?nèi)旧w核型差異明顯, 七帶石斑魚的核型為2=48t, 褐石斑魚的染色體核型為2=2m+4sm+42t, 斜帶石斑魚的核型為2=2sm+46t, 點(diǎn)帶石斑魚的染色體核型為2=48t[18-19]?？梢娦螒B(tài)差異大的石斑魚染色體核型不同, 染色體核型相同的形態(tài)差異較大, 因此染色體核型的多樣化對石斑魚的系統(tǒng)分類和種類鑒定有著重要的輔助作用。

表2 藍(lán)身大斑石斑魚染色體相對長度和臂比

在本研究的試驗(yàn)過程中, 作者發(fā)現(xiàn)藍(lán)身大斑石斑魚在強(qiáng)光照射或應(yīng)激情況下, 魚體色變深, 體表的斑紋會發(fā)生變化, 魚體側(cè)會出現(xiàn)隱約的條帶性斑紋, 與斜帶石斑魚、褐石斑魚、青石斑魚()等的外表特征相似, 不易根據(jù)外部形態(tài)區(qū)分它們, 但藍(lán)身大斑石斑魚和斜帶石斑魚、褐石斑魚的染色體核型組成有較大的差異, 藍(lán)身大斑石斑魚的染色體核型為2=48t, 斜帶石斑魚的染色體核型為2=2sm+46t, 褐石斑魚的染色體核型為2=2sm+46t, 因此根據(jù)染色體核型能很好地將其區(qū)分開來。但是, 石斑魚種類繁多, 從現(xiàn)有的研究結(jié)果來看, 僅依據(jù)染色體的核型分析進(jìn)行石斑魚類種質(zhì)鑒定是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的, 若能進(jìn)一步結(jié)合染色體的C帶、銀染等多種方法, 將提高石斑魚類的系統(tǒng)分類的準(zhǔn)確性, 為石斑魚類種質(zhì)鑒定提供更有力的佐證。

3.3 藍(lán)身大斑石斑魚染色體核型與種類進(jìn)化的關(guān)系

魚類的演化程度與其細(xì)胞染色體類型是一致的, 進(jìn)化中處于上位的, 染色體數(shù)目越收斂, 端部著絲粒染色體多, 臂數(shù)少[20]。李樹深[21]認(rèn)為在特定分類階元中, 具有較多中部或亞中部著絲粒染色體的是特化類群, 而具有較多端部著絲粒染色體的為原始種群, 也就是說染色體臂數(shù)多的比染色體臂數(shù)少的種類更特化。王世鋒[19]在對6種石斑魚染色體核型進(jìn)行比較分析后指出, 原始類群的石斑魚在進(jìn)化過程中, 其染色體結(jié)構(gòu)未發(fā)生大的變化, 基本保持了原始核型特征, 特化類群的石斑魚在進(jìn)化過程中染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生了易位、倒位等重組, 形成染色體特化核型特征。在本研究中, 藍(lán)身大斑石斑魚的染色體核型為2=48t, 染色體相對長度從1.38±0.09到2.69± 0.11, 相差不大, 收斂性強(qiáng), 染色體臂數(shù)少, 推測其應(yīng)屬于典型的高位類中原始類群, 是石斑魚屬演化過程中出現(xiàn)較早的物種。由于石斑魚種類繁多, 而其染色體數(shù)目具有高度一致性, 因此有必要利用染色體顯帶和熒光原位雜交等技術(shù)對藍(lán)身大斑石斑魚的同源染色體進(jìn)行更為精確的分析和鑒定, 為其種類進(jìn)化提供更為翔實(shí)的數(shù)據(jù)資料。

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The karyotype of

LIU Su1, YANG Yu-qing1, 2, ZHANG Hai-fa1, ZHANG Yong1, 2, WU Jin-hui1, HUANG Jin-xiong1, SHI He-rong1

(1. Marine Fisheries Development Center of Guangdong Province, Huizhou 516081, China; 2. Institute of Aquatic Economic Animals and Guangdong Provincial Key Laboratory for Aquatic Economic Animals, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China)

This study aims to assess the cell biological characteristics of. We analyzed the karyotype offrom their renal tissue using the PHA and colchicine injection methods. The results revealed 48 telocentric chromosomes in the diploid number, and their karyotypic formula was 2= 48t. The study deduces thatcomprises the characteristics representative of the ancestral karyotypic pattern and belongs to the primitive groups.

; karyotype; chromosome

(本文編輯: 譚雪靜)

[Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest, No.201403011; Special Fund for Marine Fisheries Development in Guangdong Province, No.201743; Special Fund for Fishing Port Construction and Fishery Development in Guangdong Province, No.201611; Special Fund for Marine Fishery Science and Industry Development in Guangdong Province, No.A201400A01, A201600A02; Science and Technology Planning Project of Guangdong Province, No.2015A020208002]

Jun. 13, 2017

劉蘇(1985-), 男, 湖南省寧遠(yuǎn)人, 工程師, 碩士, 主要從事海洋生物繁育學(xué)研究, 電話: 0752-5574826, E-mail: 306151183@qq.com

Q343.22

A

1000-3096(2017)12-0046-05

10.11759//hykx20170613002

2017-06-13;

2017-09-13

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201403011); 廣東省海洋和漁業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金(201743); 廣東省漁港建設(shè)和漁業(yè)發(fā)展專項(xiàng)資金(201611); 廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項(xiàng)(A201400A01, A201600A02); 廣東省科技計劃項(xiàng)目(2015A020208002)