趙秀艷，常飛，方澤民，張寅良，肖亞中

?

黏細菌漆酶序列篩選及其重組酶酶學性質

趙秀艷1,2，常飛1,2，方澤民1,2，張寅良1,2，肖亞中1,2

1 安徽大學生命科學學院，安徽合肥 230601 2 安徽省微生物與生物催化工程技術研究中心，安徽合肥 230601

漆酶是一種應用廣泛的綠色環(huán)保的多酚氧化酶。漆酶過去被認為廣泛存在于植物、昆蟲和真菌中，而近年來，越來越多的細菌中也發(fā)現(xiàn)了漆酶的存在。黏細菌是一類重要的資源菌，但與一般細菌相比，較難分離和純化。文中利用生物信息學的方法，綜合應用Blast和隱馬爾可夫模型方法對黏細菌蛋白質組數(shù)據(jù)庫進行搜索，并根據(jù)多銅氧化酶的保守銅離子結合位點進行進一步篩選，獲得30個候選黏細菌漆酶序列。挑選其中9個，在大腸桿菌中進行重組表達。利用2,6-甲氧基苯酚 (DMP) 等常用漆酶底物檢測重組酶的催化氧化活性，其中7個重組蛋白具有漆酶催化活性。選擇1個對2,6-甲氧基苯酚 (DMP) 具有較高氧化活性的重組酶 (命名為rSC-2)，通過Ni-NTA親和層析柱純化rSC-2，測試其酶學性質。純化的rSC-2蛋白分子量約57 kDa，在最適反應條件下，rSC-2催化DMP反應的比酶活為0.27 U/mg。催化DMP反應的最適溫度為60 ℃，最適pH為7.0。rSC-2在pH 7.0?8.0有較高酶活，在60 ℃孵育1 h保留50%以上剩余酶活。低濃度的Ca2+對酶活有一定的促進作用，而較高濃度的Fe3+、Co2+、Ba2+對酶活的抑制作用較明顯。這是首次對黏細菌漆酶序列進行系統(tǒng)性的生物信息學分析，并實現(xiàn)纖維堆囊菌序列來源的漆酶活性蛋白在大腸桿菌細胞中重組表達。

生物信息學，黏細菌漆酶，重組表達，分離純化，酶學性質

漆酶 (Laccase) 是一種含銅的多酚氧化酶，屬于多銅氧化酶家族，能催化多種酚類及非酚類化合物氧化，在工業(yè)染料脫色、新型藥物合成、生物傳感器研制和食品飲料加工等領域具有潛在應用價值[1-3]。漆酶最初在漆樹的汁液中被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在認為其廣泛分布于植物、 動物、特別是真菌中。1993年，Givaudan等[4]從植物根際細菌生脂固氮螺菌中首次發(fā)現(xiàn)了細菌漆酶的存在。通過對不同微生物來源漆酶的性質比較發(fā)現(xiàn)，不同的漆酶同工酶蛋白發(fā)揮不同的生理功能，且物種來源不同的漆酶具有差異的酶學性質，如細菌來源的漆酶在中性及偏堿性等環(huán)境有較高催化能力[5-6]，古細菌來源的漆酶熱力學穩(wěn)定性較好，而真菌來源的漆酶比活力較高。因此，從不同種屬微生物中發(fā)現(xiàn)新型漆酶，對于深入理解漆酶的功能，以及促進其在生物工程領域的應用具有重要意義。

黏細菌 (Myxobacteria) 是一類革蘭氏陰性單細胞生物，主要存在于富含微生物和有機質的環(huán)境中，最適生長溫度在30 ℃左右，處于饑餓干旱環(huán)境中形成子實體，并在內部生成黏孢子，黏孢子對逆境有較強的抗性[7-8]。根據(jù)對底物利用能力的不同，黏細菌被分為兩大類群。一類是不能利用纖維素，但可降解利用活細菌 (嗜細菌類群)；另一類不能降解利用活細菌，卻能分解利用纖維素 (嗜纖維素類群)[9]。與一般細菌相比，黏細菌生長緩慢，細胞壁上有復雜的胞外附屬物，易于黏附攜帶其他污染物，較難分離和純化。已有研究表明，黏細菌次級代謝產物具有豐富多樣的生物活性，是篩選獲得新型抗菌、抗腫瘤等活性化合物的重要資源[10-12]，但關于黏細菌漆酶的研究未見報道。

基因序列測定技術的快速進步為利用生物信息學方法挖掘難分離培養(yǎng)微生物資源提供了便利。迄今，有13個黏細菌基因組序列被發(fā)布，在此基礎上，我們對候選黏細菌漆酶序列進行了生物信息學分析，結合基因人工合成方法，進一步對篩選的9個候選序列進行重組表達，并對黏細菌來源的具有漆酶活性的重組蛋白rSC-2的酶學性質進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器

2,6-甲氧基苯酚 (DMP)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸) 二銨鹽 (ABTS)、多巴胺、丁香醛連氮 (SGZ)、甲氧基苯酚、愈創(chuàng)木酚、二茂鐵、鄰苯二酚、標準分子量蛋白marker和異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 購自上海生工生物工程技術服務有限公司；超聲細胞破碎儀，冷凍離心機，鎳離子親和層析柱，One Drop微量紫外分光光度計，pH計，電泳儀。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB 固體培養(yǎng)基 (g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸膏5，NaCl 10，瓊脂15，自然pH值，121 ℃滅菌20 min。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：胰蛋白胨10，NaCl 10，瓊脂15，自然pH值，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 黏細菌潛在漆酶基因序列的篩選

從NCBI下載所有已知的黏細菌目下的蛋白質組序列，以枯草芽孢桿菌的CotA蛋白序列 (PDB ID：1GSK) 和來自大腸桿菌的CueO蛋白序列 (PDB ID：3OD3) 為模板，對黏細菌基因組數(shù)據(jù)庫 (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/genome/?term=myxobacteria) 中有蛋白序列信息的氨基酸序列進行Blast比對，發(fā)現(xiàn)潛在黏細菌漆酶序列。保留evalue≤0.001且比對長度≥200個氨基酸的結果。

按照Ausec等[13]的方法，同時用5種漆酶多銅氧化酶 (Laccase-like multicopper oxidase，MCO) 的隱馬爾可夫模型，分別表征5類不同類型的漆酶特征。以這5個模型為種子，用HMMER3.0軟件分別對下載的黏細菌進行全蛋白質組比對。保留最高分數(shù)大于100的序列，對于每一條比對出的蛋白質序列，選取分數(shù)最高的種子模型作為該序列的特征。

通過ClustalO工具對這些序列進行多序列比對，找出銅離子保守位點，去除不包含4個銅離子保守位點的序列。利用MEGA6工具構建系統(tǒng)分類樹狀圖。

1.2.2 黏細菌漆酶表達體系的構建

選取目標黏細菌蛋白序列，根據(jù)大腸桿菌偏好性對編碼序列密碼子進行優(yōu)化，將優(yōu)化后的序列送往商業(yè)公司進行基因合成。用pET22b構建黏細菌漆酶重組表達載體，選擇BL21 (DE3)作為宿主細胞，將構建好的重組表達載體轉化入BL21 (DE3) 細胞進行重組表達。

1.2.3 重組酶的制備

挑取待培養(yǎng)的重組大腸桿菌陽性克隆單菌落于LB液體培養(yǎng)基 (按1%接種量)，37 ℃、 220 r/min搖床培養(yǎng)至對數(shù)期，轉接4 mL培養(yǎng)液至400 mL LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至600達到0.8，加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG，16 ℃、150 r/min誘導表達15–18 h。收集菌體，超聲破碎細胞，8 000×離心30 min，收集上清，利用Ni2+-NTA柱親和純化蛋白，純化過程參照生產商提供的使用說明書進行。SDS-PAGE檢測蛋白純度，用One Drop微量紫外分光光度計測定280并計算蛋白濃度。

1.2.4 重組酶的活性測定

以DMP為底物考察重組蛋白的漆酶活 力，反應體系包括：10 μL適當稀釋的酶液、 終濃度為1 mmol/L的DMP以及50 mmol/L的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液(pH 7.0)，60 ℃反應 5 min后，冰上孵育30 s終止反應，設置1個空白對照組，3個平行實驗組，測定方法參照Fang等[14]。酶活力單位 (U) 定義為每分鐘氧化 1 μmol DMP所需的酶量。

1.2.5 重組酶的最適反應溫度和溫度穩(wěn)定性

將漆酶酶液用50 mmol/L Na2HPO4-KH2PO4緩沖液 (pH 7.0) 適當稀釋，置于20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃的水浴中保溫1 h，0 h測定初始酶活，1 h后測定剩余酶活，計算相對酶活，以最高的酶活為100%，相對酶活 (%) = (各溫度條件下的酶活/最高酶活)×100%。以未處理酶液的酶活力為100%，剩余酶活 (%) = (各溫度條件下的剩余酶活/最初酶活)×100%。

1.2.6 重組酶的最適pH值和pH穩(wěn)定性

取等量的酶液置于不同pH值 (pH 4.5?5.5 CH3COONa-CH3COOH；pH 5.5?8.0 Na2HPO4- KH2PO4；pH 8.0?8.5 Tris-HCl) 的緩沖液中，在最適溫度下測定酶活力，以0 h為對照，計算相對酶活。以最高的酶活100%，相對酶活 (%) = (各pH條件下的酶活/最高酶活)×100%。在酶對pH值的穩(wěn)定性實驗中，以pH 4.5?8.5的緩沖液適當稀釋酶液于30 ℃保溫1 h后測定其剩余酶活。

1.2.7 金屬離子對重組酶活性的影響

選取K+、Ca2+、Mg2+、Na+、Zn2+、Mn2+、Fe3+、Co2+、Ba2+，用Na2HPO4/KH2PO4(50 mmol/L、pH 7.0) 配成母液濃度分別為100 mmol/L金屬離子溶液，測定金屬離子存在的條件下對重組酶漆酶活力的影響，以不含金屬離子的反應液為對照，加入適量母液金屬離子緩沖液，使其終濃度為1 mmol/L和5 mmol/L，每種金屬離子的2個濃度都設3個平行，結果以平均值±標準偏差(±) 計算。

2 結果與分析

2.1 黏細菌漆酶活性蛋白候選序列的篩選及分析

從已發(fā)布的13個黏細菌蛋白質組篩選獲得31條潛在漆酶序列。通過多序列比對，去除1個不完全包含4個保守銅離子結合位點的序列 (WP_002631421.1)，共計30個序列作為漆酶活性蛋白候選序列。構建的30個漆酶活性蛋白候選序列系統(tǒng)分類進化圖如圖1所示。從圖1可以看出，黏細菌漆酶活性蛋白候選序列大致可分為4類。

圖1 候選黏細菌漆酶系統(tǒng)分類進化圖

Fig. 1 Phylogenetic evolutionary tree of the myxobacteria laccase candidates.

類別Ⅰ包含8個候選黏細菌漆酶，來源于6個物種，分別為珊瑚狀珊瑚球菌、深褐孢囊桿菌、葉柄黏球菌、黃色黏球菌、纖維堆囊菌和橙色標樁菌。隱馬爾可夫模型分析顯示，這8個漆酶活性蛋白屬于typeB的兩域小漆酶[15]，氨基酸數(shù)目較少，在410?456之間。另外，這8個黏細菌漆酶活性蛋白兩兩之間氨基酸序列一致性超過60%，雖然來源不同，但相似性較高。

類別Ⅱ也包含了8個候選黏細菌漆酶，來源于5個物種，分別為珊瑚狀珊瑚球菌、葉柄黏球菌、黃色黏球菌、太平洋鄰囊菌和纖維堆囊菌。隱馬爾可夫模型分析表明，這8個黏細菌漆酶活性蛋白屬于普通的三域漆酶，氨基酸數(shù)目在450?502之間。值得注意的是，它們中有4個均來源于，而這4個蛋白的兩兩序列一致性只有30%?40%。反而是3個不同菌株來源的候選漆酶 (、和) 序列一致性較高，達到50%?60%。

類別Ⅲ包含6個候選黏細菌漆酶，來源于4個物種，分別是脫鹵厭氧黏桿菌、深褐孢囊桿菌、赫黃嗜鹽囊菌和纖維堆囊菌。這6個蛋白較大，氨基酸數(shù)量在591?1 359之間，兩兩序列一致性也只有20%?30%，雖然包含4個銅離子結合位點，但可能還擁有其他酶的活性。

類別Ⅳ同樣包含了8個候選黏細菌漆酶，來源于6個物種，分別為軟骨霉狀菌、深褐孢囊桿菌、細小玻管狀菌、太平洋鄰囊菌、纖維堆囊菌和橙色標樁菌。隱馬爾可夫模型分析表明這8個候選黏細菌漆酶也屬于普通的三域漆酶，但氨基酸數(shù)目比類別Ⅱ大，在527–651之間。兩兩之間序列一致性差異較大，有的只有20%?30%，而有的高達70%。

對獲得的30個候選黏細菌漆酶序列以及真菌來源且具有晶體結構的2個漆酶序列 (1KYA、1GYC) 和2個細菌漆酶(CotA、3OD3_A)序列進行全序列比對。結果表明，所比對序列的4個銅離子結合區(qū)氨基酸類型高度保守，分別為HxHG、HxH、HxxHxH和HCHxxxH (圖2A)，而4個底物結合區(qū)域編碼序列的長度和類型差異較大 (圖2B，2C)。此外，我們還標注了漆酶的4個底物結合loop區(qū)，這4段區(qū)域彼此高度特異，序列長度和氨基酸類型均不同。

2.2 重組酶的分離純化及其性質分析

從4個類別分別選取2個潛在黏細菌漆酶序列，共計9個潛在漆酶序列送往公司進行基因合成，并構建重組酶大腸桿菌表達體系BL21 (DE3)/pET22b-lacX。初步重組蛋白表達后，獲得粗酶液，分別用底物SGZ、DMP、愈創(chuàng)木酚、二茂鐵和鄰苯二酚等檢測發(fā)現(xiàn)，其中來自WP_012240709.1、WP_012240711.1、WP_012233138.1、WP_012234756.1、WP_002621665.1、WP_006975397.1、WP_044243002.1序列獲得的7個重組蛋白具有催化活性。

選取其中一個來自類別II () 對DMP具有較高催化活性的三域漆酶SC-2 (WP_012240711.1) 的重組酶進行純化制備，分析其酶學性質。

2.2.1 rSC-2表觀分子量

成功構建表達載體pET22b-SC-2，并實現(xiàn)具有漆酶活性蛋白SC-2在BL21 (DE3)中的活性表達。通過Ni2+-NTA柱純化蛋白，經過SDS-PAGE檢測顯示單一目標蛋白條帶 (圖3)，說明rSC-2已被成功純化到SDS-PAGE電泳純。編碼rSC-2的氨基酸共525個，理論計算rSC-2分子量為57.15 kDa，與蛋白電泳條帶位置大小一致。

2.2.2 溫度對rSC-2活性的影響

將反應體系置于各溫度水浴中，測定溫度對rSC-2活性的影響。由圖4A可以看出，rSC-2的最適反應溫度是60 ℃，50 ℃?70 ℃剩余酶活保留80%以上，80 ℃時剩余酶活40%左右。

圖3 rSC-2的SDS-PAGE電泳

圖4 溫度、pH對rSC-2酶活力的影響

2.2.3 rSC-2熱穩(wěn)定性分析

將最適反應體系置于各溫度水浴中20 ℃–70 ℃放置1 h后測定其剩余活性。由圖4B可以看出，rSC-2在低溫時 (0 ℃?30 ℃) 的穩(wěn)定性較好，酶活損失較少，剩余酶活都在80%以上。30 ℃以后，隨著溫度升高，酶活下降較快，70 ℃時剩余酶活殘留約45%，rSC-2適宜低溫保存。

2.2.4 pH對rSC-2活性的影響

分別將各pH反應體系置于60 ℃水浴中測定不同pH對rSC-2活性的影響。結果如圖4C所示，rSC-2的最適反應pH為7.0時，酶活最高，在pH為7.5時，酶活較高，剩余酶活在90%以上。

2.2.5 rSC-2的pH穩(wěn)定性

將重組酶SC-2與不同pH緩沖液充分混合稀釋后，置于30 ℃孵育1 h，在最適條件下測量剩余酶活。結果如圖4D所示，在pH為6.5?8.0時具有較高的酶活，酶的穩(wěn)定性比較好，pH 7.5時酶具有最好的保藏穩(wěn)定性。

2.2.6 金屬離子對rSC-2活性的影響

在反應體系中加入適量金屬離子緩沖液，使金屬離子終濃度分別為1 mmol/L、5 mmol/L，最適溫度孵育3 min，反應5 min測量酶活。不同金屬離子對rSC-2活性影響的差異較大，結果如表1所示，金屬離子終濃度1 mmol/L時，Ca2+對rSC-2的活性有一定促進作用，Mn2+、Na+、K+、Mg2+對rSC-2活性影響不大，Zn2+、Fe3+、Co2+、Ba2+對rSC-2活性有不同程度的抑制作用。金屬離子終濃度為5 mmol/L時，各金屬離子對rSC-2活性都有不同程度的抑制作用，F(xiàn)e3+、Co2+、Ba2+對rSC-2活性影響最大，實驗中檢測不到酶活 (表1)。

表1 金屬離子對漆酶活性影響

3 討論

細菌漆酶于1993年首次從植物根際細菌生脂固氮螺菌中被發(fā)現(xiàn)。自此，不斷有新的細菌漆酶被報道。已有研究顯示，漆酶活性蛋白在細菌中廣泛存在，且已經從真細菌[16-17]、古細菌[18]、放線菌[19]等微生物中克隆并表達獲得了相應的細菌漆酶活性蛋白。然而，至今未見有對黏細菌漆酶序列生物信息學分析和酶學性質研究的報道。我們利用生物信息學方法結合基因人工合成技術，篩選黏細菌漆酶序列并實現(xiàn)其在中異源表達，能為深入理解細菌漆酶的功能，以及促進其在生物工程領域的應用奠定基礎。

Blast方法是基于啟發(fā)式算法尋找進化上親緣關系較近、全局高度相似的序列，是最常用的序列相似性比對工具；隱馬爾可夫模型是一個動態(tài)的模型，可以通過訓練識別同一特征的蛋白質序列，更加準確地獲得進化上親緣關系較遠但具有保守特征的序列，基于隱馬爾可夫模型的方法越來越多地用在生物信息學中。我們分別用Blast和HMMER的方法對黏細菌進行了全蛋白質組的比對，從13個黏細菌蛋白質組篩選獲得30個漆酶活性蛋白候選序列，且兩種方法獲得的序列完全相同，由于這兩種方法完全獨立，因此也說明獲得的序列可信度較高。

Kües等對來自6個真菌基因組的45個多銅氧化酶序列進行生物信息學分析，結果顯示，這些序列聚類為6個亞家族，包括漆酶亞家族1 (Laccase sensustricto subfamily 1)、漆酶亞家族2 (Laccase sensustricto subfamily 2)、真菌鐵基氧化酶亞家族 (Fungal ferroxidases)、鐵基氧化酶/漆酶亞家族 (Ferroxidase/laccase)、真菌色素多銅氧化酶亞家族 (Fungal pigment MCOs) 以及真菌抗壞血酸氧化酶 (Fungal ascorbate oxidases)，這些蛋白在微生物中發(fā)揮不同的生理功能，如參與木質素的分解、菌絲體的發(fā)育、對植物的致病性等[20]。與Kües等的結果類似，我們對獲得的30個黏細菌來源多銅氧化酶序列的生物信息學分析顯示，其可分為4個類別 (Ⅰ–Ⅳ)，且同物種來源的多銅氧化酶序列一致性較低；同時，潛在黏細菌漆酶序列的4個銅離子結合區(qū)序列之間和底物結合區(qū)序列之間也存在差異，暗示其在黏細菌中也可能發(fā)揮不同的生理功能。

為了了解黏細菌漆酶功能，掌握其酶學性質，選取不同類別來源共計9個序列進行基因合成，并構建重組酶大腸桿菌表達體系。檢測發(fā)現(xiàn)，有7個重組蛋白具有催化丁香醛連氮氧化活性，其中rSC-2具有最高活性，rSC-1次之。丁香醛連氮被認為是鑒別漆酶與酪氨酸酶等的專一性底物。因此，rSC-2和rSC-1可被認為是細菌漆酶。同時，以結構信息已知的真菌漆酶為參考，全序列比對結果表明，分布于類別Ⅱ中的潛在黏細菌漆酶與真菌漆酶的序列相似性最高 (圖2)。因此，選擇歸類于類別Ⅱ的rSC-2進行深入研究。

一般情況下，真菌來源漆酶催化酚類底物氧化的最適pH在5.0左右，當催化pH高于7.0時，酶活力迅速降低[21-23]；而細菌來源漆酶通常在pH 7.0左右具有最適的催化活力[24-25]。對rSC-2酶學性質的初步分析表明，與其他細菌來源漆酶蛋白類似，rSC-2擁有中性偏堿的最適催化pH (7.0?7.5)。然而，與rSC-2不同，來自牛瘤胃微生物元基因組文庫的細菌漆酶RL5[26]催化丁香醛連氮的最適pH為4.5。另外，rSC-2具有較好的耐熱性，在60 ℃水浴1 h，殘留55%活性，高于海洋來源細菌漆酶Lac15 (45℃半衰期為72 min)[11]，但低于枯草芽孢桿菌來源細菌漆酶CotA[27]?？傊瑢SC-2酶學性質的初步研究表明，對于某些偏堿性的工業(yè)廢水如造紙和染料廢水等，使用真菌漆酶處理時活性較低，rSC-2可能具有較好的應用潛力。

REFERENCES

[1] Shradd ha, Shekher R, Sehgal S, et al. Laccase: microbial sources, production, purification, and potential biotechnological applications. Enzyme Res, 2011, 2011: 217861.

[2] Riva S. Laccases: blue enzymes for green chemistry. Trends Biotechnol, 2006, 24(5): 219–226.

[3] Reiss R, Ihssen J, RichterM, et al. Laccaselaccase-like multi-copper oxidase: a comparative study of similar enzymes with diverse substrate spectra. PLoS ONE, 2013, 8(6): e65633.

[4] Givaudan A, Effosse A, Faure D, et al. Polyphenol oxidase inisolated from rice rhizosphere: evidence for laccase activity in non-motile strainsof. FEMS Microbiol Lett, 1993, 108(2): 205–210.

[5] Fang ZM, Li TL, Chang F, et al. A new marine bacterial laccase with chloride-enhancing, alkaline- dependent activity and dye decolorization ability. Bioresour Technol, 2012, 111: 36–41.

[6] Ruijssenaars HJ, Hartmans S. A clonedmulticopper oxidase exhibiting alkaline laccase activity. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 65(2): 177–182.

[7] Volz C, Kegler C, Müller R. Enhancer binding proteins act as hetero-oligomers and link secondary metabolite production to myxococcal development, motility, and predation. Chem Biol, 2012, 19(11): 1447–1459.

[8] Cao P, Dey A, Vassallo CN, et al. Howmyxobacteria cooperate. J Mol Biol, 2015, 427(23): 3709–3721.

[9] Mu?oz-Dorado J, Marcos-Torres FJ, García-Bravo E, et al. Myxobacteria: moving, killing, feeding, and surviving together. Front Microbiol, 2016, 7: 781.

[10] Wang DT, Ma ZL. The molecular biology of myxobacterium. Chem Life, 2010, 30(5): 779–782 (in Chinese).王德韜, 馬中良. 黏細菌的分子生物學. 生命的化學, 2010, 30(5): 779–782.

[11] Zhao TF, Gong GL. Myxobacteria: natural pharmaceutical factories. Biotechnol Bull, 2014, 30(12): 40–46 (in Chinese). 趙婷峰, 龔國利. 黏細菌: 天然的制藥工廠. 生物技術通報, 2014, 30(12): 40–46.

[12] Vaksman Z, Kaplan HB.growth, development, and isolation. Curr Protoc Microbiol, 2015, 39: 7A.1.1–7A.1.21.

[13] Ausec L, Zakrzewski M, Goesmann A, et al. Bioinformatic analysis reveals high diversity of bacterial genes for laccase-like enzymes. PLoS ONE, 2011, 6(10): e25724.

[14] Fang ZM, Li TL, Wang Q, et al.A bacterial laccase from marine microbial metagenome exhibiting chloride tolerance and dye decolorization ability. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 89(4): 1103–1110.

[15] Ihssen J, Reiss R, Luchsinger R, et al. Biochemical properties and yields of diverse bacterial laccase-like multicopper oxidases expressed in. Sci Rep, 2015, 5: 10465.

[16] Roberts SA, Weichsel A, Grass G, et al. Crystal structure and electron transfer kinetics of CueO, a multicopper oxidase required for copper homeostasis in. Proc Natl Acad Sci USA, 2002, 99(5): 2766–2771.

[17] Singh SK, Roberts SA, McDevitt SF, et al. Crystal structures of multicopper oxidase CueO bound to copper (Ⅰ) and silver (Ⅰ): functional role of a methionine-rich sequence. J Biol Chem, 2011, 286(43): 37849–37857.

[18] Uthandi S, Prunetti L, De Vera IMS, et al. Enhanced archaeal laccase production in recombinantby modification of N-terminal propeptide and twin arginine translocation motifs. J Ind Microbiol Biotechnol, 2012, 39(10): 1523–1532.

[19] Tishchenko S, Gabdulkhakov A, Trubitsina L, et al. Crystallization and X-ray diffraction studies of a two-domain laccase from. Acta Crystallogr F Struct Biol Commun, 2015, 71(9): 1200–1204.

[20] Kües U, Rühl M. Multi plemulti-copper oxidase gene families in basidiomycetes—what for?. Curr Genomics, 2011, 12(2): 72–94.

[21] Liu J, Cai Y, Liao X, et al. Purification and characterization of a novel thermal stable laccase fromsp. SYBC-L3 and its use in dye decolorization. Biol Environ, 2012, 113: 1–13.

[22] Baldrian P. Fungal laccases-occurrence and properties. FEMS Microbiol Rev, 2006, 30(2): 215–242．

[23] Hildén K, Hakala TK, Lundell T. Thermotolerant and thermostable laccases. Biotechnol Lett, 2009, 31(8): 1117–1128.

[24] Vrsanska M, Voberkova S, Langer V, et al. Induction of laccase, lignin peroxidase and manganese peroxidase activities in white-rot fungi using copper complexes. Molecules, 2016, 21(11): 1553.

[25] Majeau JA, Brar SK, Tyagi RD. Laccases for removal of recalcitrant and emerging pollutants. Bioresource Technol, 2010, 101(7): 2331–2350.

[26] Beloqui A, Pita M, Polaina J, et al. Novel polyphenol oxidase mined from a metagenome expression library of bovine rumen: biochemical properties, structural analysis, and phylogenetic relationships. J Biol Chem, 2006, 281(32): 22933–22942.

[27] Su JM, Bao P, Bai TL, et al. CotA, a multicopper oxidase fromWH4, exhibits manganese-oxidase activity. PLoS ONE, 2013, 8(4): e60573.

(本文責編 陳宏宇)

Bioinformatic analysis and characterization of myxobacteria laccase-like multicopper oxidases

Xiuyan Zhao1,2, Fei Chang1,2, Zemin Fang1,2, Yinliang Zhang1,2, and Yazhong Xiao1,2

1 School of Life Sciences, Anhui University, Hefei 230601, Anhui, China 2 Anhui Provincial Engineering Technology Research Center of Microorganisms and Biocatalysis, Hefei 230601, Anhui, China

Laccase is a widely-used environment-friendly copper-containing oxidase found in many plants, insects and fungi. Recently, more and more laccases are also found in bacteria. Myxobacteria are an important bacteria resource. However, myxobacteria are much more difficult to isolate and purify than other bacteria. We used bioinformatic approach to screen myxobacteria proteomes available in NCBI. Based on conserved sequences of four copper binding sites in multicopper oxidase, 30 potential laccase sequences were obtained. Among them, nine genes were synthesized and expressed inBL21 (DE3). Seven proteins showed laccase activity when tested with traditional laccase substrates. One protein, named rSC-2, was chosen for further research because it exhibited the highest activity towards 2,6-dimethyl phenol (DMP). The molecular weight of rSC-2 was 57 kDa. Its specific activity to DMP was 0.27 U/mg. The optimal temperature and the optimal pH were 60 ℃ and 7.0, respectively. About 50% of the original activity was retained after incubation at 60 ℃ and pH 7.0?8.0 for 1 h. Metals showed different effects on rSC-2. rSC-2 activity was enhanced by several metalsat concentration of 1 mmol/L, such as Ca2+and Mn2+. With a higher concentration of 5 mmol/L, the activity of rSC-2 was apparently inhibited. This is the first report of bioinformatics screening myxobacteria laccases in combination with expression in

bioinformatics, myxobacteria laccase, recombinant expression, separation and purification, enzymology characterization

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31600078).

國家自然科學基金(No. 31600078) 資助。

September 23, 2016; Accepted: January 3, 2017

Yinliang Zhang. Tel/Fax: +86-551-63861929; E-mail: ylzhang@ahu.edu.cn Yazhong Xiao. Tel/Fax: +86-551-63861929; E-mail: yzxiao@ahu.edu.cn