李信志，盧爭輝，周玉玲，李世宇，張桂敏

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枯草芽孢桿菌SCK6超級感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化

李信志，盧爭輝，周玉玲，李世宇，張桂敏

湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源綠色轉(zhuǎn)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430062

枯草芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性好氧細(xì)菌，因其安全性和高分泌特性，已被廣泛用作異源蛋白的表達(dá)宿主。然而，相比大腸桿菌，枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化效率低，限制了其作為宿主的異源蛋白的定向進(jìn)化。本文通過改變培養(yǎng)基、誘導(dǎo)劑濃度、質(zhì)粒類型等參數(shù)優(yōu)化感受態(tài)制備的條件，利用常規(guī)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，用營養(yǎng)豐富的YN培養(yǎng)基替代常規(guī)LB培養(yǎng)基制備感受態(tài)，可以使轉(zhuǎn)化效率提高4倍左右；加入1.5%的木糖誘導(dǎo)2 h，感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率又提高2倍左右；用大腸桿菌GM272來源的質(zhì)粒又可進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化效率3倍左右。綜合最優(yōu)條件制備SCK6的感受態(tài)，轉(zhuǎn)化整合型質(zhì)粒pDG1730，效率可以達(dá)到106CFU/μg，相對未優(yōu)化的條件提高了2個數(shù)量級，為基于枯草芽孢桿菌的酶的定向進(jìn)化和代謝工程奠定了基礎(chǔ)。

枯草芽孢桿菌，基因，木糖，感受態(tài)，pDG1730

枯草芽孢桿菌是一種廣泛分布嗜溫、好氧并產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性桿狀細(xì)菌，已被美國食品藥品管理局(FDA) 認(rèn)定為GRAS (Generally recognized as safe) 菌株。枯草芽孢桿菌具有很強(qiáng)的抗逆性，并能分泌大量酶類和產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，因此，一方面作為活菌劑被廣泛應(yīng)用在飼料、生防、環(huán)保等領(lǐng)域，另一方面作為表達(dá)系統(tǒng)在外源蛋白和代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用[1]。

與我們常用的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比，枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有以下的優(yōu)勢：1) 它具有很強(qiáng)的分泌表達(dá)能力，能將表達(dá)的外源蛋白直接分泌到細(xì)胞外，避免了破菌的程序，簡化了蛋白純化的步驟，有利于下游操作；2) 屬于GRAS菌株，可安全用于生產(chǎn)食品、醫(yī)藥蛋白；3) 沒有明顯的密碼子偏愛性，避免了密碼子優(yōu)化[2-4]。然而，枯草芽孢桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)，其轉(zhuǎn)化效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于大腸桿菌，一方面限制了其在蛋白質(zhì)工程 (如定向進(jìn)化、蛋白質(zhì)突變體庫等) 的應(yīng)用；另一方面限制了枯草芽孢桿菌的代謝工程改造 (如多基因同時編輯，多基因協(xié)同表達(dá)等)。

因此很多科學(xué)家致力于提高枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化效率，以便于在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行酶定向進(jìn)化和代謝工程改造。目前報道的提高枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化效率的方法主要有3種：一是利用多聚體質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，該方法需要構(gòu)建多聚體的質(zhì)粒[5]；二是電穿孔法，該方法需要用高濃度的甘露醇和山梨醇去創(chuàng)造細(xì)胞高滲透壓的環(huán)境[6]；三是原生質(zhì)法，由于原生質(zhì)體脆弱，使得制備枯草芽孢桿菌原生質(zhì)體困難且十分繁瑣，同時還需要用聚乙二醇去促進(jìn)DNA進(jìn)入[7]。這3種方法雖然可以提高枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化效率，但這些方法工作量大、復(fù)雜、耗時且不易掌握。因此需要發(fā)展一種簡單、易于操作的高效轉(zhuǎn)化普通質(zhì)粒的方法。早在1958年，Spizizen等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌168菌株具有形成自然感受態(tài)的能力[8]，王樹香等研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌感受態(tài)的形成是生長后期高度有序的遺傳調(diào)控的結(jié)果[9]。因此許多研究者從枯草芽孢桿菌后期生長的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)出發(fā)，分析細(xì)胞感受態(tài)形成與芽孢形成的遺傳通路，及細(xì)胞在感受態(tài)形成與芽孢形成中的遺傳決定機(jī)制，發(fā)現(xiàn)ComK是枯草芽孢桿菌中調(diào)控感受態(tài)形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，其濃度的改變會調(diào)控細(xì)胞形態(tài)變化、外源DNA吸收等相關(guān)的感受態(tài)發(fā)育后期基因的表達(dá)，并容易使細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)狀態(tài)[10-13]。因此，張曉舟等[14]在枯草芽孢桿菌1A751基因組中整合了基因獲得菌株SCK6，通過木糖誘導(dǎo)的啟動子誘導(dǎo)ComK的表達(dá)，從而制備出SCK6的高效感受態(tài)，通過轉(zhuǎn)化多聚體質(zhì)粒，其轉(zhuǎn)化效率可以達(dá)到107CFU/μg，同時其感受態(tài)制備過程也十分簡單、易于操作。然而，該研究并沒有對SCK6的感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行優(yōu)化，也沒有研究該方法對轉(zhuǎn)化普通質(zhì)粒的效果。

本研究在此基礎(chǔ)上，通過改變培養(yǎng)基、誘導(dǎo)劑濃度和質(zhì)粒類型等參數(shù)優(yōu)化了感受態(tài)制備和轉(zhuǎn)化的條件，最終使優(yōu)化后SCK6感受態(tài)轉(zhuǎn)化普通質(zhì)粒的效率整體提高了2個數(shù)量級，其中最高達(dá)到106CFU/μg。

1 材料與方法

1.1 材料與配方

菌株：SCK6[14]由俄亥俄州Genetic Stock Center (BGSC) 饋贈。GM272 (?，?，?)[15]菌株(后面簡稱GM272) 由美國佛羅里達(dá)大學(xué)Shanmugam教授饋贈。大腸桿菌甲基化宿主Trans5α菌株購于Transgen公司。

質(zhì)粒：質(zhì)粒pDG1730由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)孫明教授饋贈。質(zhì)粒pBS1C、pBE980b和pHY300plk由中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所王欽宏研究員饋贈。游離型質(zhì)粒pHT01由美國佛羅里達(dá)大學(xué)Shanmugam教授饋贈。

試劑：木糖購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌RNA抽取試劑盒購自

培養(yǎng)基：LB：10 g/L氯化鈉，5 g/L酵母抽提物，10 g/L蛋白胨。YN：7 g/L酵母抽提物，18 g/L營養(yǎng)肉湯。MD：7.5 g/L酵母抽提物，8 g/L營養(yǎng)肉湯。

CDM(MOPS-based chemically defined medium)[16](100 mL)：10×MOPS溶液10 mL，色氨酸 (5 mg/mL) 1 mL，檸檬酸鐵銨(2.2 mg/mL) 1 mL，III’-salts 1 mL，谷氨酸鉀(40%) 2 mL，琥珀酸鈉(30%) 2 mL，果糖(20%) 1 mL；

10×MOPS溶液：83.72 g/L MOPS，33 g/L硫酸銨，3.85 mL/L磷酸二氫鉀(1 mol/L)，6.15 mL/L磷酸氫二鉀(1 mol/L)；III’-salts：0.232 g/L硫酸錳，12.3 g/L 硫酸鎂。

1.2SCK6超級感受態(tài)的常規(guī)制備方法

將–80 ℃保存的枯草芽孢桿菌SCK6在LB平板上劃線活化，取劃線得到的單菌落接種于LB新鮮培養(yǎng)基中，在37 ℃、220 r/min過夜培養(yǎng)12 h，轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)物到含有1%木糖的LB新鮮培養(yǎng)基中，起始600=1.0，繼續(xù)放在37 ℃、220 r/min中培養(yǎng)2 h，所得菌液即為感受態(tài)細(xì)胞，將制備好的感受態(tài)分裝后加10%甘油保存在–80 ℃[14]。

1.3 枯草芽孢桿菌感受態(tài)效率檢測方法

取1 μL已知濃度的質(zhì)粒，加入100 μL枯草芽孢桿菌感受態(tài)中混合均勻，37 ℃、220 r/min孵育90 min，稀釋一定倍數(shù)后將其涂布在抗性平板上，37 ℃倒置過夜培養(yǎng)，計數(shù)轉(zhuǎn)化子，計算出感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率 (CFU/μg)。

1.4 優(yōu)化SCK6感受態(tài)制備方法

1.4.1 不同培養(yǎng)基對感受態(tài)效率的影響

不同培養(yǎng)基含有不同的營養(yǎng)物質(zhì)，所以對菌體生長的影響也不一樣。選用了4種常見的芽孢桿菌培養(yǎng)基來制備感受態(tài)，這4種培養(yǎng)基分別為LB、YN、MD和CDM (合成培養(yǎng)基)，在其他條件與步驟不改變的情況下，進(jìn)行感受態(tài)制備，比較轉(zhuǎn)化效率，尋找最適培養(yǎng)基。

1.4.2 不同木糖濃度對感受態(tài)效率的影響

SCK6中含有木糖誘導(dǎo)表達(dá)的感受態(tài)形成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因，它的濃度會調(diào)控相關(guān)的感受態(tài)發(fā)育后期基因的表達(dá)。在獲得最優(yōu)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%的木糖[17]去誘導(dǎo)SCK6感受態(tài)的形成，誘導(dǎo)2 h后獲得感受態(tài)，通過轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pDG1730檢測感受態(tài)效率，觀察不同木糖濃度對感受態(tài)制備的影響，找到最適的木糖誘導(dǎo)濃度。

同時，抽取不同濃度木糖誘導(dǎo)后SCK6的總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自)得到相應(yīng)的cDNA第一條鏈，然后以其為模板進(jìn)行相對熒光定量PCR。熒光定量PCR儀和熒光定量PCRiTaqUniversal SYBR Green supermix購自以16S rRNA作為內(nèi)參基因[18]，以不加木糖誘導(dǎo)的SCK6的總RNA作為對照，每個反應(yīng)做3次重復(fù)，用2–△△Ct法[19]分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，檢測不同濃度木糖誘導(dǎo)下基因的表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平。熒光定量PCR用的ComK引物是ComKq-F和ComKq-R、內(nèi)參基因16S rRNA的引物是16S rRNA-F和16S rRNA-R (表1)。

1.4.3 質(zhì)粒是否甲基化對轉(zhuǎn)化效率的影響

Russell和Zinder[20]報道大腸桿菌?宿主中抽提的質(zhì)粒其轉(zhuǎn)化效率要比來自+宿主的質(zhì)粒高很多 (在大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化效率)。GM272(?，?，?)是甲基化酶缺失菌株，其不能對轉(zhuǎn)入其中的質(zhì)?；蚧蚱芜M(jìn)行甲基化修飾，Trans5α是常用的克隆菌株，是+宿主，可以對轉(zhuǎn)入其中的質(zhì)?；蚧蚱渭谆DG1730、pHT01和pBS1C 3種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入到GM272和Trans5α菌株中，分別獲得未甲基化和甲基化修飾的質(zhì)粒。通過濃度測定、稀釋調(diào)節(jié)質(zhì)粒為相同濃度后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到SCK6感受態(tài)細(xì)胞中，比較3種不同來源質(zhì)粒的感受態(tài)效率。

1.4.4 不同抗生素抗性對轉(zhuǎn)化的影響

在1.4.3實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)帶有不同抗生素抗性的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化效率也有很大的差別，即使是非常相似僅抗性基因不同的pBS1C與pDG1730質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化效率也相差很大。為了進(jìn)一步探究不同抗生素抗性對轉(zhuǎn)化的影響，將游離型質(zhì)粒pHT01進(jìn)行抗性基因替換，即用壯觀霉素抗性基因替換氯霉素抗性基因。以質(zhì)粒pDG1730為模板，設(shè)計引物Spc-F和Spc-R (表1) 擴(kuò)增壯觀霉素抗性基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后，用Ⅱ和Ⅰ進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物和經(jīng)Ⅱ和Ⅰ酶切的質(zhì)粒pHT01連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α感受態(tài)細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒pHTL01。在相同條件下，轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞，觀察pHT01質(zhì)?？剐愿淖兦昂筠D(zhuǎn)化效率的變化。

1.5 優(yōu)化條件與原始條件下制備感受態(tài)效率

綜合單因素改變的最優(yōu)方法進(jìn)行組合，在優(yōu)化條件下進(jìn)行感受態(tài)制備，即用YN作為培養(yǎng)基、1.5%木糖誘導(dǎo)2 h、轉(zhuǎn)化時用GM272來源未甲基化的質(zhì)粒，以1.2的原始條件作為對照，用質(zhì)粒pDG1730、pHT01、pBS1C、pBE980b和pHY300plk檢測優(yōu)化后的轉(zhuǎn)化效果。

1.6 統(tǒng)計分析

對于實(shí)驗(yàn)中感受態(tài)效率的統(tǒng)計分析，采用多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，去掉相差較大的數(shù)據(jù)，對剩下相近的數(shù)據(jù)取平均值的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對感受態(tài)效率的影響

常規(guī)制備枯草芽孢桿菌感受態(tài)使用的培養(yǎng)基是LB培養(yǎng)基，然而枯草芽孢桿菌在營養(yǎng)貧乏環(huán)境中容易產(chǎn)生芽孢，因此，不同的培養(yǎng)基會影響枯草芽孢桿菌感受態(tài)的形成。培養(yǎng)基YN和MD是實(shí)驗(yàn)室中常用的培養(yǎng)基，其營養(yǎng)成分比LB豐富，而CDM培養(yǎng)基是文獻(xiàn)報道[16]可用來培養(yǎng)枯草芽孢桿菌的合成培養(yǎng)基，主要由無機(jī)鹽組成，營養(yǎng)貧瘠。按方法1.2的條件，選用這4種培養(yǎng)基制備菌株SCK6的感受態(tài)，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pDG1730的濃度為20 ng/μL，轉(zhuǎn)化結(jié)果見圖1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)用YN培養(yǎng)基制備的感受態(tài)效率是LB培養(yǎng)基的4倍左右，是MD培養(yǎng)基的3–4倍，而在CDM培養(yǎng)基的轉(zhuǎn)化效率最低，說明制備枯草芽孢桿菌的感受態(tài)需要營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基。

通過監(jiān)測制備過程中菌體的密度 (表2)，發(fā)現(xiàn)SCK6在營養(yǎng)豐富的YN培養(yǎng)基和MD培養(yǎng)基中的菌體密度比LB培養(yǎng)基中高30%，推測用YN培養(yǎng)基制備的感受態(tài)效率高是因?yàn)閅N培養(yǎng)基比LB培養(yǎng)基營養(yǎng)更豐富，更有利于細(xì)胞生長，感受態(tài)細(xì)胞數(shù)目更多所致。因此，選用YN培養(yǎng)基作為制備SCK6感受態(tài)的最適培養(yǎng)基。

2.2 不同木糖濃度對感受態(tài)效率的影響

ComK是枯草芽孢桿菌形成感受態(tài)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它參與調(diào)控細(xì)胞形態(tài)變化、外源DNA吸收等相關(guān)的感受態(tài)發(fā)育后期基因的表達(dá)，使細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)通路。SCK6是在菌株1A751的染色體上整合了基因，利用木糖誘導(dǎo)的啟動子PxylA進(jìn)行調(diào)控，可以誘導(dǎo)SCK6形成感受態(tài)細(xì)胞。添加不同濃度的木糖誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物的多少可能會對感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生影響。因此，按方法1.2的條件，在YN培養(yǎng)基中加入不同濃度的木糖，分別制備SCK6的感受態(tài)，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pDG1730的濃度為2 ng/μL，轉(zhuǎn)化結(jié)果如圖2所示，可以看出1.5%木糖誘導(dǎo)所制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率最高。

表1 本研究中所用的引物序列

圖1 不同培養(yǎng)基制備B. subtilis SCK6感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效果圖

表2 不同培養(yǎng)基對B. subtilis SCK6感受態(tài)效率的影響

圖2 不同木糖濃度誘導(dǎo)培養(yǎng)B. subtilis SCK6感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效果圖

通過監(jiān)測感受態(tài)制備過程中菌體的密度 (表3)，發(fā)現(xiàn)木糖濃度低時，菌體生長快，但是轉(zhuǎn)化效率偏低；木糖濃度升高，菌體生長變慢，在木糖濃度為1.5%的時候，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高。為了驗(yàn)證ComK表達(dá)產(chǎn)物和轉(zhuǎn)化效率的關(guān)系，通過定量熒光PCR檢測了不同木糖誘導(dǎo)條件下基因的表達(dá)水平。圖3顯示了不同濃度木糖誘導(dǎo)基因表達(dá)的相對定量情況，可以看出用1.5%木糖誘導(dǎo)2 h時，的轉(zhuǎn)錄水平是最高的，和最高的轉(zhuǎn)化效率保持一致，在其他木糖濃度的時候，的轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)化效率之間也是正相關(guān)，說明感受態(tài)的效率受ComK表達(dá)量的影響。

2.3 質(zhì)粒甲基化與否對轉(zhuǎn)化效率的影響

Russell 和 Zinder[20]的文獻(xiàn)報道，非甲基化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率最高。將枯草桿菌的3種質(zhì)粒，pDG1730、pHT01和pBS1C分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌甲基化缺陷菌株GM272中，抽提獲得未甲基化的質(zhì)粒。然后，將20 ng/μL三種未甲基化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入用YN培養(yǎng)基培養(yǎng)、1.5%木糖誘導(dǎo)2 h的枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。同時以甲基化修飾的質(zhì)粒 (來自Trans5α) 為對照，轉(zhuǎn)化結(jié)果見圖4。由圖可以看出，未甲基化修飾的3種質(zhì)粒比甲基化修飾質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率高3–4倍左右，說明非甲基化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化效率更高，具體數(shù)據(jù)見表4。

2.4 帶不同抗生素抗性基因的質(zhì)粒對轉(zhuǎn)化效率的影響

由2.3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在同一批感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化質(zhì)粒不同，感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率差別很大，尤其是質(zhì)粒pBS1C與pDG1730，同為整合型質(zhì)粒，但是它們的轉(zhuǎn)化效率相差50–100倍。在多次的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pDG1730的轉(zhuǎn)化效率相對枯草芽孢桿菌的其他質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化效率是相對較高的。通過質(zhì)粒圖譜分析發(fā)現(xiàn)，pBS1C與pDG1730這兩個質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)非常相似，有相同的和其他序列，但它們攜帶的抗性基因不同。pBS1C攜帶的是氯霉素抗性基因 (753 bp)，而pDG1730是壯觀霉素抗性基因 (726 bp)，初步認(rèn)為可能枯草芽孢桿菌SCK6中限制性酶在氯霉素抗性基因中有切割位點(diǎn)導(dǎo)致其轉(zhuǎn)化效率降低。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證抗生素抗性對轉(zhuǎn)化效率的影響，游離型質(zhì)粒pHT01中的氯霉素抗性基因被替換為壯觀霉素抗性基因得到質(zhì)粒pHTL01 (圖5)。

將pHT01和pHTL01分別轉(zhuǎn)化進(jìn)GM272中，抽提獲得未甲基化修飾的質(zhì)粒，然后在相同條件下轉(zhuǎn)化SCK6感受態(tài)細(xì)胞 (質(zhì)粒濃度20 ng/μL)，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明壯觀霉素抗性的pHTL01比帶氯霉抗性的pHT01質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率高出2–3倍，其中帶壯觀霉素抗性的pHTL01轉(zhuǎn)化效率為4.50×104CFU/μg，而帶氯霉素抗性的pHT01轉(zhuǎn)化效率為2.12×104CFU/μg。這說明SCK6中存在能對氯霉素抗性基因進(jìn)行編輯的酶，但是對轉(zhuǎn)化效率的影響可能不僅是這個原因，因?yàn)橘|(zhì)粒pBS1C與pDG1730的轉(zhuǎn)化效率相差50–100倍。

表3 不同木糖濃度對B. subtilis SCK6感受態(tài)效率的影響

圖3 熒光定量PCR檢測不同濃度木糖誘導(dǎo)時comK基因轉(zhuǎn)錄水平

表4 不同質(zhì)粒甲基化與否轉(zhuǎn)化效率比較

圖4 不同甲基化來源質(zhì)粒轉(zhuǎn)化SCK6的轉(zhuǎn)化效果

圖5 改造質(zhì)粒pHT01的示意圖

圖6 帶不同抗生素抗性基因的質(zhì)粒對轉(zhuǎn)化效率的影響

2.5 綜合優(yōu)化條件與原條件下制備感受態(tài)效率比較

綜合之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別用優(yōu)化的條件和原條件去制備菌株SCK6的感受態(tài)，并用不同的枯草芽孢桿菌質(zhì)粒去檢驗(yàn)優(yōu)化條件的效果，優(yōu)化條件即：用YN培養(yǎng)基進(jìn)行菌體培養(yǎng)，用1.5%的木糖誘導(dǎo)2 h，轉(zhuǎn)化GM272來源未甲基化的質(zhì)粒；原始條件即：用LB培養(yǎng)基進(jìn)行菌體培養(yǎng)，用1.0%的木糖誘導(dǎo)2 h，轉(zhuǎn)化Trans5α來源甲基化的質(zhì)粒。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個平行，對照組用Trans5α來源的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原始條件下制備的感受態(tài)；實(shí)驗(yàn)組用GM272來源未甲基化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化優(yōu)化條件下制備的感受態(tài)。選用了5種不同的質(zhì)粒pDG1730、pHT01、pBS1C、pBE980b和pHY300plk進(jìn)行轉(zhuǎn)化，結(jié)果如圖7和表5所示，概數(shù)平板的菌落數(shù)，計算轉(zhuǎn)化效率，表中是多次試驗(yàn)的平均數(shù)據(jù)，可以看到優(yōu)化條件的轉(zhuǎn)化效率平均比原始條件的轉(zhuǎn)化效率高1–2個數(shù)量級，其中來源于GM272的質(zhì)粒pDG1730利用優(yōu)化條件轉(zhuǎn)化效率可達(dá)到106CFU/μg，這也說明優(yōu)化的轉(zhuǎn)化條件對枯草芽孢桿菌的質(zhì)粒具有普適性。

圖7 不同質(zhì)粒檢測優(yōu)化條件與原始條件下制備感受態(tài)轉(zhuǎn)化的效果圖

表5 不同質(zhì)粒在優(yōu)化條件與原條件下制備感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率

3 討論

枯草芽孢桿菌分布廣泛安全無毒，在工業(yè)酶表達(dá)、飼料添加和生物防治等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。目前基因技術(shù)的不斷發(fā)展，對于基因操作平臺的效率要求越來越高，為了消除枯草芽孢桿菌低轉(zhuǎn)化效率的限制，很多研究工作者進(jìn)行了大量的研究工作，從Canosi的多聚體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化法[5]、Chang的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法[7]，到Xue的高滲透壓電穿孔法[6]，再到張曉舟等[14]過量表達(dá)感受態(tài)轉(zhuǎn)錄因子ComK，轉(zhuǎn)化多聚體質(zhì)粒的方法，枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化效率逐漸被提高，轉(zhuǎn)化方法日趨簡便。2012年You等[21]在張曉舟的方法基礎(chǔ)上，用POE-PCR的方法優(yōu)化了構(gòu)建多聚體質(zhì)粒的過程，從結(jié)果可以看到用POE-PCR構(gòu)建的多聚體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)不及轉(zhuǎn)化完整的環(huán)狀質(zhì)粒，而轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌卻比轉(zhuǎn)化完整環(huán)狀質(zhì)粒高3個數(shù)量級，作者認(rèn)為主要是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌更容易轉(zhuǎn)化多聚體質(zhì)粒所致，通過本研究結(jié)果推測POE-PCR方法構(gòu)建的多聚體質(zhì)粒沒有甲基化修飾也是轉(zhuǎn)化效率提高的原因之一?？莶菅挎邨U菌轉(zhuǎn)化效率的提高可為蛋白質(zhì)工程 (如定向進(jìn)化、蛋白突變體庫) 等其他生物工程改造提供便利，這樣就可以將那些不能利用大腸桿菌進(jìn)行蛋白質(zhì)工程分子改造的工業(yè)酶，在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行分子改造，極大地發(fā)揮枯草芽孢桿菌作為表達(dá)宿主的優(yōu)勢。

感受態(tài)效率與細(xì)胞生長狀態(tài)、ComK表達(dá)情況以及轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒類型都有關(guān)，因此本研究在張曉舟的枯草芽孢桿菌SCK6的基礎(chǔ)上，對培養(yǎng)基類型、誘導(dǎo)劑木糖濃度以及質(zhì)粒類型進(jìn)行了優(yōu)化探究，最終優(yōu)化后枯草芽孢桿菌SCK6感受態(tài)轉(zhuǎn)化普通枯草芽孢桿菌質(zhì)粒的效率普遍提高了1–2個數(shù)量級，其中轉(zhuǎn)化pDG1730質(zhì)粒的效率可以達(dá)到106CFU/μg，這一結(jié)果使得枯草芽孢桿菌在蛋白質(zhì)工程等方面的應(yīng)用更為簡便。本研究嘗試用4種實(shí)驗(yàn)室常用的培養(yǎng)基進(jìn)行感受態(tài)制備比較，結(jié)果顯示用YN培養(yǎng)的細(xì)胞密度明顯比LB培養(yǎng)的高，感受態(tài)效率也相應(yīng)提高了4倍左右，說明營養(yǎng)貧瘠產(chǎn)生芽孢的條件不適合感受態(tài)的形成；用不同濃度木糖去誘導(dǎo)表達(dá)的時候，發(fā)現(xiàn)當(dāng)木糖濃度為1.5%時，SCK6感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平最高，轉(zhuǎn)化效率也達(dá)到最大。另外，不同質(zhì)粒類型及質(zhì)粒上所帶的抗生素抗性基因不同也會影響轉(zhuǎn)化效率，未經(jīng)甲基化修飾的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率明顯提高。壯觀霉素抗性質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率高于氯霉素抗性質(zhì)粒，分析認(rèn)為在氯霉素抗性基因中可能有SCK6的限制性切割或阻斷位點(diǎn)，但是分析已經(jīng)報道的枯草芽孢桿菌的限制酶，并沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的位點(diǎn)，也許是其他的DNA切割酶或者是新的限制性酶，尚需進(jìn)一步研究。

本文在原始條件的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化SCK6感受態(tài)的制備條件，利用簡單的方法獲得了枯草芽孢桿菌的超級感受態(tài)，提高了SCK6的轉(zhuǎn)化效率，為枯草芽孢桿菌的蛋白質(zhì)工程和代謝工程改造奠定了基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1] Wu SC, Wong SL. Development of improved pUB110-based vectors for expression and secretion studies in. J Biotechnol, 1999, 72(3): 185?195.

[2] Verma D, Satyanarayana T. Production of cellulase-free xylanase by the recombinantand its applicability in paper pulp bleaching. Biotechnol Progr, 2013, 29(6): 1441?1447.

[3] Pohl S, Bhavsar G, Hulme J, et al. Proteomic analysis ofstrains engineered for improved production of heterologous proteins. Proteomics, 2013, 13(22): 3298?3308.

[4] Liu L, Liu YF, Shin HD, et al. Developingspp. as a cell factory for production of microbial enzymes and industrially important biochemicals in the context of systems and synthetic biology. Appl Microbiol Biotechnol, 2013, 97(14): 6113?6127.

[5] Canosi U, Morelli G, Trautner TA. The relationship between molecular structure and transformation efficiency of someplasmids isolated from. Mol Gen Genet, 1978, 166(3): 259–267.

[6] Xue GP, Johnson JS, Dalrymple BP. High osmolarity improves the electro-transformation efficiency of the gram-positive bacteriaand. J Microbiol Methods, 1999, 34(3): 183–191.

[7] Chang S, Cohen SN. High frequency transformation ofprotoplasts by plasmid DNA. Mol Gen Genet, 1979, 168: 111–115.

[8] Spizizen J. Transformation of biochemically deficient strains ofby deoxyribonucleate. Proc Natl Acad Sci USA, 1958, 44(10): 1072–1078.

[9] Wang SX, Li SN, Li HY. Optimization of spore production conditions of strain of producing phytaseZX-29. Hubei Agricultural Sciences, 2014, 53(1): 160–163 (in Chinese).王樹香, 李術(shù)娜, 李紅亞. 產(chǎn)植酸酶枯草芽孢桿菌ZX-29產(chǎn)芽孢條件的優(yōu)化. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 53(1): 160?163.

[10] D'souza C, Nakano MM, Zuber P. Identification of, a gene of theA operon that regulates the establishment of genetic competence in. Proc Natl Acad Sci USA, 1994, 91(20): 9397?9401.

[11] Smits WK, Eschevins CC, Susanna KA, et al. Stripping: ComK auto-stimulation is responsible for the bistable response in competence development. Mol Microbiol, 2005, 56(3): 604?614.

[12] Van Sinderen D, Venema G. ComK acts as an autoregulatory control switch in the signal transduction route to competence in. J Bacteriol, 1994, 176(18): 5762?5770.

[13] Lu ZH, Zhou YL, Zhang XZ, et al. Sporulation or competence development? A genetic regulatory network smodel of cell-fate determination in. Chin J Biotechnol, 2015, 31(11): 1543–1552 (in Chinese).盧爭輝, 周玉玲, 張曉舟, 等. 感受態(tài)還是芽胞?細(xì)胞命運(yùn)決定的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò). 生物工程學(xué)報, 2015, 31(11): 1543–1552.

[14] Zhang XZ, Zhang YHP. Simple, fast and high-efficiency transformation system for directed evolution of cellulase in. Microb Biotechnol, 2011, 4(1): 98?105.

[15] Palmer BR, Marinus MG. Theandstrains of–a review. Gene, 1994, 143(1): 1–12.

[16] Hageman JH, Shankweiler GW, Wall PR, et al. Single, chemically defined sporulation medium for: growth, sporulation, and extracellular protease production. J Bacteriol, 1984, 160(1): 438–441.

[17] H?rtl B, Wehrl W, Wiegert T, et al. Development of a new integration site within thechromosome and construction of compatible expression cassettes. J Bacteriol, 2001, 183(8): 2696–2699.

[18] Kirk DG, Palonen E, Korkeala H, et al. Evaluation of normalization reference genes for RT-qPCR analysis ofand four sporulation sigma factor genes ingroup I strain ATCC 3502. Anaerobe, 2014, 26: 14–19.

[19] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△Ctmethod. Methods, 2001, 25(4): 402–408.

[20] Russell DW, Zinder ND. Hemimethylation prevents DNA replication in. Cell, 1987, 50(7): 1071–1079.

[21] You C, Zhang XZ, Zhang YHP. Simple cloningdirect transformation of PCR product (DNA multimer) toand. Appl Environ Microbiol, 2012, 78(5): 1593–1595.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Preparation and transformation optimization for supercompetentSCK6 cells

Xinzhi Li, Zhenghui Lu, Yuling Zhou, Shiyu Li, and Guimin Zhang

Bioresources Green Transformation Collaborative Innovation Center of Hubei Province, College of Life Sciences, Hubei University, Wuhan 430062, Hubei, China

is Gram-positive aerobic bacterium and widely used as a heterologous protein expression host because of its safety and high protein secretion property. However, comparing to, the low transformation efficiency limits the application ofas a host cell for directed evolution of heterologous enzymes. Therefore, we optimized the competent cell preparation conditions for conventional plasmid, including the alteration of the medium, the concentration of inducer, the plasmid type, and other parameters. Compared with the original LB medium, YN medium improved the transformation efficiency by about 4 folds. The transformation efficiency enhanced by about 2 folds under induction with 1.5% xylose for 2 h. In addition, with plasmids prepared fromGM272 strain the transformation efficiency increased by about 3 folds. Combining all these findings, the transformation efficiency of pDG1730 plasmid under the optimized conditions could reach 106CFU/μg, which was 2 orders of magnitude higher than that the original. Our findings provide references for directed evolution of enzymes and metabolic engineering in.

,gene, xylose, competent cells,pDG1730

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 31670069), National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (No. 2014AA021303-04).

國家自然科學(xué)基金 (No. 31670069)，國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 (863計劃) (No. 2014AA021303-04) 資助。

September 28, 2016; Accepted: December 15, 2016

Guimin Zhang. Tel: +86-27-88663882; E-mail: zhangguimin6@hotmail.com

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2017-02-13

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170213.1405.002.html