王敏捷 胡衛(wèi)列 王尉 朱沂 趙旭

·基礎(chǔ)研究·

氯硝柳胺聯(lián)合順鉑對裸鼠腎上腺皮質(zhì)癌移植瘤的抑制作用

王敏捷①胡衛(wèi)列②王尉②朱沂②趙旭②

目的：研究氯硝柳胺聯(lián)合低劑量順鉑對裸鼠腎上腺皮質(zhì)癌移植瘤的抑制作用，并探討其機(jī)制。方法：建立SW-13細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，設(shè)對照組、氯硝柳胺組、順鉑組、聯(lián)合用藥組，比較各組終末腫瘤體積、瘤重、生化指標(biāo)。TUNEL檢測移植瘤組織的細(xì)胞凋亡率，免疫組織化學(xué)法和Western blot檢測移植瘤組織Bcl-2、caspase-3的表達(dá)。結(jié)果：聯(lián)合用藥組的終末腫瘤體積、瘤重低于氯硝柳胺組、順鉑組（均P＜0.001）；順鉑組、聯(lián)合用藥組的白細(xì)胞低于對照組（均P＜0.001），順鉑組與聯(lián)合用藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.29）；順鉑組、聯(lián)合用藥組的肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶高于對照組（均P＜0.001），順鉑組與聯(lián)合用藥組的肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。TUNEL檢測顯示聯(lián)合用藥組的細(xì)胞凋亡率高于氯硝柳胺組（P=0.004）、順鉑組（P=0.005），免疫組織化學(xué)法、Western blot檢測顯示聯(lián)合用藥組中Bcl-2表達(dá)較氯硝柳胺組、順鉑組降低（均P＜0.001），caspase-3的表達(dá)升高（均P＜0.001）。結(jié)論：氯硝柳胺能夠增強(qiáng)低劑量順鉑對腎上腺皮質(zhì)癌生長的抑制作用且不增加毒副作用，可能與影響B(tài)cl-2、cas?pase-3表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)。

氯硝柳胺 順鉑 SW-13 Bcl-2 caspase-3

腎上腺皮質(zhì)癌（adrenocortical carcinoma，ACC）源于腎上腺皮質(zhì)［1］，惡性程度高，缺乏有效治療手段，預(yù)后差［2］。順鉑（cisplatin，CDDP）是治療ACC的常用藥物，大劑量應(yīng)用會誘發(fā)骨髓抑制和腎功能損害，并產(chǎn)生耐藥性［3］。氯硝柳胺（niclosamide）的分子式為C13H8Cl2N2O4，用于治療腸道寄生蟲病。近年研究發(fā)現(xiàn)氯硝柳胺還具有抗腫瘤作用，能夠增加腫瘤細(xì)胞對化療和放療的敏感性［4-5］。本課題組已在體外細(xì)胞實驗證實氯硝柳胺可以抑制SW-13細(xì)胞的增殖，且與順鉑聯(lián)合應(yīng)用可增強(qiáng)順鉑對SW-13細(xì)胞的毒性作用［6］，為進(jìn)一步研究氯硝柳胺聯(lián)和順鉑對ACC的療效、毒性作用以及作用機(jī)制，本研究利用動物模型探討氯硝柳胺能否在增強(qiáng)順鉑抗腫瘤作用的同時，減少其毒副作用和耐藥性，為尋求ACC新的治療途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 SW-l3細(xì)胞購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫，于37℃無CO2恒溫孵箱常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的SW-13細(xì)胞制備濃度為1×107/mL的單細(xì)胞懸液。1.1.2 實驗動物 BAL B/c-nu/nu雌性裸鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心，SPF級環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后，于右腋下接種SW-13細(xì)胞。待移植瘤達(dá)腫瘤標(biāo)準(zhǔn)后，去除未成瘤以及瘤體或體質(zhì)量最小的裸鼠，用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行隨機(jī)區(qū)組分配，分為對照組、氯硝柳胺組、順鉑組、氯硝柳胺+順鉑組（聯(lián)合用藥組），每組裸鼠5只。本研究經(jīng)廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，嚴(yán)格遵循動物實驗操作規(guī)范和倫理學(xué)規(guī)范。

1.1.3 試劑 β-actin抗體、Bcl-2抗體、capsase-3抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。TUNEL試劑盒、免疫組織化學(xué)試劑盒、DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤體積、瘤重、血細(xì)胞、生化檢測 裸鼠隨機(jī)區(qū)組分配后，予腹腔注射藥物。氯硝柳胺組藥物濃度為1 mg/kg，順鉑組為6.25 mg/kg，聯(lián)合用藥組中氯硝柳胺1 mg/kg+順鉑6.25 mg/kg，對照組予以等量生理鹽水，注射量0.5 mL，1次/天，連續(xù)30天。每天觀察裸鼠生長情況，每3天測量1次腫瘤體積。給藥30天后，斷頸處死裸鼠，剝離瘤體拍照并稱重，部分瘤體采用HE染色，顯微鏡下觀察組織形態(tài)。在處死前通過眼球內(nèi)眥靜脈采血，對裸鼠的血液樣本進(jìn)行血細(xì)胞生化分析。

1.2.2 TUNEL檢測 部分剝離的瘤體使用4%多聚甲醛內(nèi)固定，石蠟包埋、切片，常規(guī)脫蠟水化后按TU?NEL試劑盒操作步驟檢測移植瘤細(xì)胞凋亡，室溫鏡下行DAB染色，直至樣本出現(xiàn)棕褐色。每張切片觀察6個視野，光鏡下觀察（×400），結(jié)果以6個視野下細(xì)胞凋亡率的平均值表示，實驗均重復(fù)3次。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法檢測 制備石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化，微波抗原修復(fù)，按免疫組織化學(xué)試劑盒操作指導(dǎo)進(jìn)行孵育，室溫鏡下行DAB染色，直至樣本出現(xiàn)棕褐色，封片，檢測移植瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、caspase-3的相對表達(dá)率。結(jié)果以隨機(jī)6個視野下平均光密度（OD）表示，平均光密度=累積光密度/測量區(qū)域，實驗均重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot檢測 取適量腫瘤組織，裂解、12 000 r/min離心5 min。取各組腫瘤組織總蛋白，48 h后使用BCA蛋白檢測試劑盒檢測移植瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、caspase-3的相對表達(dá)率，結(jié)果條帶使用Image-Pro分析灰度值，β-actin作為內(nèi)參蛋白，實驗均重復(fù)3次。。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，實驗組間差異比較采用單因素方差分析或重復(fù)測量資料的方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠移植瘤的生長曲線及組織形態(tài)

SW-13細(xì)胞皮下接種后第8天共22只裸鼠接種部位出現(xiàn)結(jié)節(jié)，行隨機(jī)區(qū)組分配。氯硝柳胺、順鉑藥物干預(yù)前各組腫瘤體積無顯著性差異（F=1.436，P= 0.269），藥物干預(yù)后對照組的腫瘤生長最快，聯(lián)合用藥組生長最慢，各生長曲線之間具有顯著性差異（F= 45.198，P＜0.001，圖1A）。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)不一，排列紊亂，核大深染，異型性明顯，符合惡性腫瘤特征（圖1B）。

圖1 各組裸鼠移植瘤腫瘤生長情況及組織形態(tài)Figure 1 Xenograft tumor growth and tissue morphology of nude mice in each group

2.2 各組裸鼠移植瘤體積、瘤重、抑瘤率

氯硝柳胺組、順鉑組和聯(lián)合用藥組的終末腫瘤體積和瘤重均小于對照組，氯硝柳胺組、順鉑組和聯(lián)合用藥組的終末腫瘤體積和瘤重與對照組之間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）。聯(lián)合用藥組終末腫瘤體積和瘤重均小于氯硝柳胺組和順鉑組，氯硝柳胺組和順鉑組終末腫瘤體積和瘤重與聯(lián)合用藥組之間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）。氯硝柳胺組的終末腫瘤體積和瘤重與順鉑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05，表1）。

表1 各組裸鼠移植瘤的體積、重量、抑瘤率比較 （±s）Table 1 Comparison of xenograft tumor volume,weight and tumor inhibition rate(±s)

表1 各組裸鼠移植瘤的體積、重量、抑瘤率比較 （±s）Table 1 Comparison of xenograft tumor volume,weight and tumor inhibition rate(±s)

acompared with the control group,bcompared with the combined drug group

Group Control Niclosamide Cisplatin Combined drug group Tumor volume(mm3) 3 808.0±1 048.69 1 905.8±569.08ab2 099.6±513.30ab652.0±291.13aTumor weight(g) 3.89±1.07 2.03±0.61ab2.32±0.56ab0.69±0.31aInhibitory rate(%) -50.66 45.90 84.04 Inhibitory rate of tumor weight(%) -47.65 40.21 82.14

表2 各組裸鼠的血細(xì)胞、生化指標(biāo)比較 （±s）Table 2 Comparison of blood cell count and biochemical indexes±s)

表2 各組裸鼠的血細(xì)胞、生化指標(biāo)比較 （±s）Table 2 Comparison of blood cell count and biochemical indexes±s)

acompared with the control group,b,c,d,e,fcompared with the combined drug group

Group Control Niclosamide Cisplatin Combined drug group RBC(×1012/L) 41.26±0.13 41.60±0.12 41.55±0.15 40.96±0.13 WBC(×109/L) 10.240±0.24 9.700±0.38 8.464±0.32ab8.268±0.07aPLT(×109/L) 235.4±5.22 233.2±11.3 232.0±9.62 229.0±5.92 BUN(mmol/L) 3.10±0.97 2.94±0.74 8.16±0.65ac8.36±0.99aCr(umol/L) 77.0±6.59 73.4±11.50 116.6±7.43ad114.2±4.76aSTB(umol/L) 13.88±1.78 14.14±2.66 23.74±2.48ae22.78±1.56aALT(U/L) 21.4±7.36 22.4±8.04 53.0±3.16af57.4±2.07a

圖2 TUNEL檢測轉(zhuǎn)移瘤細(xì)胞凋亡（DAB染色×400）Figure 2 TUMEL was used to detect apoptosis morphology in xenograft tumor(DAB staining×400)

2.3 對各組裸鼠的血細(xì)胞生化指標(biāo)的影響

順鉑組、聯(lián)合用藥組的白細(xì)胞計數(shù)較對照組減低，順鉑組、聯(lián)合用藥組的白細(xì)胞計數(shù)與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001），順鉑組與聯(lián)合用藥組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。氯硝柳胺組、順鉑組、聯(lián)合用藥組的紅細(xì)胞計數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），氯硝柳胺組、順鉑組、聯(lián)合用藥組的血小板計數(shù)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。順鉑組、聯(lián)合用藥組的尿素氮、肌酐、總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平均高于對照組，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001），順鉑組的尿素氮、肌酐、總膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平與聯(lián)合組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05，表2）。

2.4 各組裸鼠移植瘤組織中細(xì)胞凋亡情況

TUNEL檢測結(jié)果顯示對照組、氯硝柳胺組、順鉑組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞總凋亡率分別為（5.97±1.92）%、（32.32±2.45）%、（33.19±2.54）%、（55.70±5.68）%，氯硝柳胺、順鉑組的細(xì)胞總凋亡率均低于聯(lián)合用藥組，氯硝柳胺組、順鉑組的細(xì)胞總凋亡率與聯(lián)合用藥組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001，圖2）。

2.5 各組裸鼠移植瘤組織Bcl-2、caspase-3表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示Bcl-2、caspase-3陽性表達(dá)呈棕黃色。聯(lián)合用藥組Bcl-2的相對表達(dá)率較氯硝柳胺組、順鉑組降低，氯硝柳胺組、順鉑組的Bcl-2的相對表達(dá)率與聯(lián)合用藥組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）；聯(lián)合用藥組caspase-3的相對表達(dá)率較氯硝柳胺組、順鉑組升高，氯硝柳胺組、順鉑組的caspase-3的相對表達(dá)率與聯(lián)合用藥組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001，圖3）。

圖3 免疫組織化學(xué)染色檢測裸鼠移植瘤組織中Bcl-2、caspase-3的表達(dá)（DAB染色×400）Figure 3 Immunohistochemical staining was used to detect the expression of Bcl-2 and caspase-3 in xenograft tumor of nude mice(DAB staining x400)

Western blot檢測結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組Bcl-2的相對表達(dá)率較氯硝柳胺組、順鉑組降低，氯硝柳胺組、順鉑組的Bcl-2的相對表達(dá)率與聯(lián)合用藥組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）；聯(lián)合用藥組的caspase-3的相對表達(dá)率較氯硝柳胺組、順鉑組升高，氯硝柳胺組、順鉑組的caspase-3的相對表達(dá)率與聯(lián)合用藥組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001，圖4）。

圖4 Western blot檢測裸鼠移植瘤組織中Bcl-2、caspase-3的表達(dá)Figure 4 Expression of Bcl-2 and caspase-3 in xenograft tumor of nude mice detected by Western blot

3 討論

順鉑被廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤，可通過多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，同時也是腎上腺皮質(zhì)癌的化療藥物之一，但大劑量順鉑誘發(fā)的不良反應(yīng)影響其臨床應(yīng)用［3］。氯硝柳胺通過多個信號通路影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)形為［7-9］。有研究報道［5］氯硝柳胺可以阻斷埃羅替尼激活的STAT3/Bcl-2/Bcl-X信號通路，抑制埃羅替尼誘導(dǎo)的STAT3磷酸化，逆轉(zhuǎn)頭頸癌和非小細(xì)胞肺癌對埃羅替尼的耐藥性。在三陰性乳腺癌對順鉑耐受的細(xì)胞實驗中，氯硝柳胺同樣可以阻斷由放療激活的STAT3/Bcl-2/Bcl-X信號通路，恢復(fù)放療耐受的三陰性乳腺癌細(xì)胞對放療的敏感性［10］。

本研究通過對裸鼠移植瘤的動態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，各組的生長曲線和終末瘤體積、瘤重的差異均說明聯(lián)合用藥組的抑瘤效果優(yōu)于單獨(dú)用藥，各藥物處理組對紅細(xì)胞、血小板影響甚微。順鉑組、聯(lián)合用藥組的白細(xì)胞、膽紅素、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酐、尿素氮水平與對照組之間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，而順鉑組與聯(lián)合用藥組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果亦顯示氯硝柳胺聯(lián)合低劑量順鉑不僅增強(qiáng)順鉑對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，也無明顯加重順鉑誘導(dǎo)的肝腎功能等毒副作用，兩者的聯(lián)合應(yīng)用不是簡單抗腫瘤作用的疊加，而是一種協(xié)同作用。聯(lián)合用藥組腫瘤細(xì)胞凋亡率較氯硝柳胺組和順鉑組升高，表明聯(lián)合用藥的抑瘤作用可能與腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。Bcl-2家族成員在細(xì)胞凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用，是細(xì)胞凋亡的負(fù)調(diào)節(jié)因子，保護(hù)細(xì)胞免于凋亡［11］。caspase家族是凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路，caspase-3活化是啟動細(xì)胞凋亡的標(biāo)志。本研究中的免疫組織化學(xué)法和Western blot檢測結(jié)果均顯示聯(lián)合用藥組的Bcl-2蛋白表達(dá)水平與單獨(dú)用藥組相比明顯下降，而cas?pase-3表達(dá)較單獨(dú)用藥組增強(qiáng)，說明氯硝柳胺聯(lián)合順鉑通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)和促進(jìn)凋亡啟動蛋白caspase-3的表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，從而抑制裸鼠SW-13細(xì)胞的移植瘤增長。

氯硝柳胺可通過Wnt/β-catenin、mTORC1、STAT3、NF-κB、Notch、Hedgehog等信號通路產(chǎn)生抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用［12-13］，也可以通過影響EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲［14］。因此，仍需進(jìn)一步研究以明確氯硝柳胺聯(lián)合順鉑抗腫瘤機(jī)制。

綜上所述，本研究通過動物模型證實氯硝柳胺可以增強(qiáng)低劑量順鉑對腎上腺皮質(zhì)癌的抑瘤效果，可能與其影響B(tài)cl-2和caspase-3表達(dá)相關(guān)。氯硝柳胺聯(lián)合低劑量順鉑避免了單獨(dú)使用大劑量順鉑而造成的毒副作用，同時也降低了腎上腺皮質(zhì)癌對順鉑耐藥的概率，因此氯硝柳胺聯(lián)合順鉑有望成為腎上腺皮質(zhì)癌新的用藥方案。

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（2016-12-29收稿）

（2017-03-02修回）

（編輯：張亻 抿 校對：武斌）

Inhibitory effect of combined niclosamide and cisplatin on adrenocortical carcinoma xenografts in nude mice

Minjie WANG1,Weilie HU2,Wei WANG2,Yi ZHU2,Xu ZHAO2

Weilie HU;E-mail:huwl-mr@vip.sina.com
1Department of Urology,No.422 Hospital of PLA,Zhanjiang 524009,China;2Department of Urology,Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command,Guangzhou 510010,China

Objective:To examine the inhibitory effect and mechanism of niclosamide combined with low-dose cisplatin on adrenocortical carcinoma xenografts in nude mice.Methods:A SW-13 cell transplanted tumor model was first established in nude mice.The nude mice were then divided into the control group,niclosamide group,cisplatin group,and combined drug group.The groups were compared in terms of tumor body volume,tumor weight,and biochemical index.The cell apoptosis rate of the transplanted tumor tissue was detected by TUNEL assay,while Bcl-2 and caspase-3 protein expression in the transplanted tumor tissue was detected by immunohistochemistry and Western blot.Results:The terminal tumor volume and weight of the combined drug group were lower than those of the niclosamide and cisplatin groups(all P＜0.001).The white blood cell count of the cisplatin and combined drug groups were lower than that of the control group(all P＜0.001).Meanwhile,no difference was observed between the cisplatin and combined drug groups(P=0.29).The creatinine and glutamic pyruvic transaminase of the cisplatin and combined drug groups were higher than those of the control group(all P＜0.001),whereas no significant difference was observed in the levels of creatinine and alanine aminotransferase between cisplatin and combined drug groups(all P＞0.05).TUNEL test results showed that the cell apoptotic rate of the combined drug group was higher than that of the niclosamide group(P=0.004)and cisplatin group(P=0.005).Immunohistochemistry and Western blot test results showed that Bcl-2 expression in the combined drug group was lower than those of the niclosamide and cisplatin groups(all P＜0.001),while caspase-3 expression in the combined drug group was the highest among those of other groups(all P＜0.001).Conclusion:Niclosamide can enhance the inhibitory effect of low-dose cisplatin on the growth of adrenocortical carcinoma and has no additional side effects.This enhancement is probably related to the influence of niclosamide on Bcl-2 and caspase-3 expression levels.Niclosamide promotes the apoptosis of the tumor cells by influencing Bcl-2 and caspase-3 expression.

niclosamide,cisplatin,SW-13,Bcl-2,caspase-3

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.07.482

①解放軍第422醫(yī)院泌尿外科（廣東省湛江市524009）；②廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院泌尿外科

胡衛(wèi)列 huwl-mr@vip.sina.com

王敏捷 專業(yè)方向為泌尿系腫瘤臨床治療及腫瘤信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制等基礎(chǔ)研究。

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