許璐 方玉松 王丹云 王宗明 許鵬

·基礎研究·

miR-200a抑制YAP1基因表達對肺癌細胞增殖的影響

許璐①方玉松②王丹云②王宗明②許鵬②

目的：研究微小RNA-200a（miR-200a）對肺癌細胞增殖的影響，并探討其分子機制。方法：采用Real-time PCR檢測15例非小細胞肺癌組織和對應癌旁組織、人肺癌細胞株（A549、NCI-H520、SK-MES-1）及人正常肺支氣管上皮細胞株16HBE中miR-200a的表達水平。用CCK-8法檢測miR-200a對A549肺癌細胞增殖活性的影響。通過生物信息學方法預測miR-200a可能的靶基因，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)合Real-time PCR和Western blot驗證miR-200a對靶基因YAP1的調(diào)控作用。CCK-8法檢測下調(diào)靶基因YAP1對A549肺癌細胞株增殖活性的影響。結(jié)果：miR-200a在非小細胞肺癌組織和肺癌細胞系中表達明顯降低（P＜0.01）。上調(diào)miR-200a表達后明顯抑制A549肺癌細胞的增殖活力（P＜0.01）。雙熒光素酶報告基因顯示miR-200a可以直接作用于靶基因YAP1的3′-UTR區(qū)域抑制熒光素酶活性（P＜0.01），Real-time PCR和Western blot檢測顯示上調(diào)miR-200a的表達能夠明顯下調(diào)A549肺癌細胞YAP1 mRNA和蛋白的表達水平（P＜0.01）。CCK-8法顯示下調(diào)YAP1的表達能夠明顯抑制A549肺癌細胞的增殖活性（P＜0.01）。結(jié)論：miR-200a通過靶向作用于YAP1基因來抑制肺癌細胞的增殖，從而在肺癌中發(fā)揮抑癌基因的功能。

miR-200a 肺癌 YAP1 增殖

肺癌已成為人類病死率最高的惡性腫瘤［1-2］，嚴重威脅著人類的生命及健康。近年來，隨著生物技術的發(fā)展和研究的深入，針對驅(qū)動基因的分子靶向治療作為新興的腫瘤治療方式已經(jīng)成為研究熱點，為肺癌的治療提供了一個有效的手段［3］。微小RNA（microRNA，miRNAs）是一類長度在17～25個核苷酸的內(nèi)源性、高度保守的單鏈非編碼小RNA，可以通過與下游靶基因mRNA的3′-非編碼區(qū)（3′-UTR）結(jié)合，降解mRNA或在轉(zhuǎn)錄后水平抑制其翻譯，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著“癌基因”或者“抑癌基因”的作用［4］。miR-200a屬于miR-200家族成員之一，其定位于人1號染色體（1p36.33）［5］，目前研究發(fā)現(xiàn)miR-200a表達異常與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著一定的關系，miR-200a在大部分惡性腫瘤如胰腺癌［6］、乳腺癌［7］、腎細胞癌［8］、肝癌［9］等惡性腫瘤中表達下調(diào)，起著類似“抑癌基因”的作用，但也有研究發(fā)現(xiàn)其在鼻咽癌［10］、卵巢癌［11］等惡性腫瘤中表達上調(diào)，起著類似“癌基因”的作用。目前有關miR-200a在肺癌中表達情況的研究較少，并且作用機制尚不明確。本研究旨在研究miR-200a在非小細胞肺癌組織及肺癌細胞系細胞中的表達情況以及對肺癌細胞增殖能力的影響，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本 收集2015年8月至2015年10月在山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院手術切除的15例非小細胞肺癌組織和對應的距離腫瘤邊緣＞5 cm的癌旁組織；組織離體30 min內(nèi)置入液氮中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?5例肺癌患者中男性10例，女性5例，年齡（54.8±7.9）歲。術后病理切片均經(jīng)證實。術后病理按WHO肺癌分類標準，其中腺癌8例，鱗癌6例，腺鱗癌1例。所有患者均簽署知情同意書，該研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.1.2 細胞與試劑 人肺腺癌細胞系A549、人肺鱗癌細胞系NCI-H520、SK-MES-1及人正常肺支氣管上皮細胞株16HBE均購自美國ATCC公司。Trizol試劑和LipofectamineTM2000均購自美國Invitrogen公司。RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Real-time PCR試劑盒、雙熒光素酶檢測試劑盒及pmirGLO載體均購自美國Promega公司。miR-200a、YAP1及內(nèi)參U6、GAPDH引物由上海吉瑪公司設計合成。YAP1 siRNA質(zhì)粒（siRNA-YAP1）和陰性對照siRNA-NC，miR-200a mimics和陰性對照mimics-NC均購自美國Santa Cruz公司。CCK-8試劑盒購自上海東仁化學科技公司。YPA1抗體以及β-actin抗體均購自美國Abcam公司。1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人肺癌細胞株A549、NCIH520、SK-MES-1及人正常肺支氣管上皮細胞株16HBE均置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3d按1:3傳代。取對數(shù)生長期的A549肺癌細胞接種于細胞培養(yǎng)板中，待細胞貼壁達70%～80%時進行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染操作嚴格按LipofectamineTM2000試劑盒說明書進行，分別轉(zhuǎn)染miR-200a mimics、mimics-NC以及siR?NA-YAP1、siRNA-NC。

1.2.2 Real-time PCR檢測miR-200a及YAP1 mRNA的表達 利用Trizol試劑提取組織或細胞總RNA，測RNA濃度，以1 μg總RNA按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。配置Real-PCR體系，PCR反應條件為：95℃3 min、95℃10 s、59℃30 s，共40個循環(huán)。實驗重復3次，以U6/GAPDH作為內(nèi)參，miR-200a和YAP1 mRNA的相對表達量以2-ΔΔCt法計算，［ΔΔCt=（待測組目的基因平均Ct值-待測組內(nèi)參基因平均Ct值）-（對照組目的基因平均Ct值-對照組內(nèi)參基因平均Ct值）］。

1.2.3 Western blot檢測YAP1蛋白的表達 收集轉(zhuǎn)染后48h的各組細胞，PBS洗滌細胞3遍，用蛋白裂解液提取細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。分別取40 μg蛋白上樣，SDS-PAGE上電泳30min，蛋白質(zhì)半干轉(zhuǎn)移至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉的封閉液，室溫封閉2 h后，加入適當濃度YPA1、β-actin一抗，4℃過夜，次日洗膜后，加入二抗室溫孵育2 h，洗膜后，加入ECL發(fā)光劑，凝膠成像系統(tǒng)顯影，以YPA1蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示YPA1蛋白的相對表達量。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞的增殖活力 細胞轉(zhuǎn)染24 h后細胞接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)，分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72、96 h 4個時點參照CCK-8試劑盒操作說明書操作向每孔加入10 μL CCK-8溶液，置于37℃、50 ml/L CO2的培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，用酶標儀測定450 nm處的吸光度，實驗重復3次。

1.2.5 miR-200a靶基因的預測及雙熒光素酶報告基因驗證 應用miRNA在線靶基因預測軟件miRanda（http：//www.microrna.org），并結(jié)合基因的功能分析，最終篩選出YAP1極有可能為miR-200a的直接靶基因。雙熒光素酶報告基因驗證miR-200a的靶基因。委托上海吉瑪公司構建帶有野生型結(jié)合位點的熒光報告載體pmirGLO-YAP1-wtUTR和帶有突變型結(jié)合位點的熒光報告載體pmirGLO-YAP1-mtUTR。轉(zhuǎn)染前1天，將肺癌細胞A549接種于24孔板中，轉(zhuǎn)染當天，將經(jīng)過測序驗證正確的pmirGLO-YAP1-wtUTR或pmirGLO-YAP1-mtUTR熒光報告載體與miR-200a mimics或mimics-NC共轉(zhuǎn)染入肺癌A549細胞。細胞共分為4組：miR-200a mimics+pmirGLO-YAP1-wtUTR組、miR-200a mimics+pmirGLO-YAP1-mtUTR組、mimics-NC+pmirGLO-YAP1-wtUTR組、mimics-NC+pmirGLO-YAP1-mtUTR組。轉(zhuǎn)染后48h收集細胞，按照雙熒光素酶活性檢測試劑盒說明書操作檢測螢火蟲熒光素酶及海腎熒光素酶活性。

熒光酶活性比值=螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 miR-200a在非小細胞肺癌組織和細胞中的表達Real-time PCR結(jié)果顯示miR-200a在非小細胞肺癌組織中的表達水平明顯低于癌旁組織，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖1A）。并且miR-200a在肺癌細胞株A549、NCI-H520、SK-MES-1中的表達水平明顯低于正常肺支氣管上皮細胞株16HBE，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖1B），其中miR-200a在肺癌細胞株A549中相對表達量最低，因此選擇肺癌細胞株A549作為后續(xù)研究對象。

圖1 miR-200a在非小細胞肺癌組織和肺癌細胞株中的表達水平明顯降低Figure 1 The expression of miR-200a in non-small cell lung cancer tissues and lung cancer cell lines was significantly decreased

2.2 上調(diào)miR-200a表達抑制A549肺癌細胞的增殖活力

A549肺癌細胞轉(zhuǎn)染miR-200a mimics或mimics-NC后，Real-time PCR顯示轉(zhuǎn)染后miR-200a mimics組細胞miR-200a表達水平明顯高于mimic-NC組（P＜0.01，圖2A），證明轉(zhuǎn)染效率較高。CCK-8法檢測細胞增殖活力顯示miR-200a mimics組A549肺癌細胞48、72、96 h時吸光度明顯低于mimics-NC組細胞，提示上調(diào)miR-200a表達能夠明顯抑制A549肺癌細胞的增殖活力（P＜0.01，圖2B）。

2.3 YAP1是miR-200a的直接調(diào)控靶基因

應用靶基因預測數(shù)據(jù)庫miRanda，并結(jié)合基因的功能分析，預測miR-200a的可能靶基因為YAP1，發(fā)現(xiàn)YAP1的3′UTR區(qū)存在與miR-200a的種子序列理論上互補的結(jié)合位點（圖3A）。為進一步驗證YAP1是否為miR-200a的直接調(diào)控靶基因，在A549肺癌細胞共轉(zhuǎn)染miR-200a mimics、mimics-NC和野生型pmirGLO-YAP1-wtUTR或突變型pmirGLO-YAP1-mtUTR后，雙熒光素酶報告基因顯示miR-200a mim?ics+pmirGLO-YAP1-wtUTR組細胞熒光素酶活性比mimics-NC+pmirGLO-YAP1-wtUTR組細胞熒光素酶活性明顯減低（P＜0.01）；而miR-200a mimics+pmir?GLO-YAP1-mtUTR組細胞熒光素酶活性與mimics-NC+pmirGLO-YAP1-mtUTR組細胞熒光素酶活性相近，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖3B）。證實miR-200a能夠特異性結(jié)合YAP1的3′UTR區(qū)，使熒光蛋白表達水平明顯降低，而YAP1的3′UTR區(qū)突變后則無此作用，說明YAP1是miR-200a的直接調(diào)控靶基因。

圖2 轉(zhuǎn)染后A549細胞miR-200a表達水平增高,增殖活力下降Figure 2 The expression level of miR-200a increased and the proliferation activity decreased after transfection in A549 cells

圖3 雙熒光素酶報告基因Figure 3 Dual luciferase reporter gene assay

2.4 上調(diào)miR-200a抑制YAP1 mRNA和蛋白的表達

Real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示miR-200a mimics組A549肺癌細胞中YAP1 mRNA和蛋白的表達水平明顯低于mimic-NC（P＜0.01，圖4A、B），提示miR-200a能夠負調(diào)控YAP1的表達。

2.5 下調(diào)YAP1能夠抑制A549肺癌細胞的增殖活力

A549肺癌細胞轉(zhuǎn)染siRNA-YAP1或siRNA-NC后，Real-time PCR和Western blot顯示轉(zhuǎn)染后siRNA-YAP1組A549細胞中YAP1 mRNA和蛋白表達水平明顯低于siRNA-NC組（P＜0.01，圖5A、B），證明轉(zhuǎn)染效率較高，成功下調(diào)A549肺癌細胞YAP1的表達。同時CCK-8法檢測細胞增殖活力顯示siRNA-YAP1組A549肺癌細胞48、72、96 h時吸光度明顯低于siRNA-NC組細胞，提示下調(diào)YAP1表達能夠明顯抑制A549肺癌細胞的增殖活力（P＜0.01，圖5C）。

圖4 miR-200a mimics組A549細胞YAP1 mRNA和蛋白的表達水平降低Figure 4 mRNA and protein expression of YAP1 in the miR-200a mimic group was lower than that in the mimic-NC group

圖5 下調(diào)YAP1能夠抑制A549肺癌細胞的增殖活力Figure 5 Downregulation of YAP1 could inhibit the proliferation of A549 lung cancer cells

3 討論

肺癌是一種高發(fā)性惡性腫瘤，肺癌的發(fā)生發(fā)展是多種基因改變、多步驟的復雜過程，其發(fā)生發(fā)展的具體分子機制尚不明確。近年來隨著表觀遺傳學的發(fā)展，miRNA在疾病中作用越來越受到重視。研究顯示在多數(shù)惡性腫瘤中存在miRNA的異常表達，miRNA在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用［12-13］。

miR-200a屬于miR-200家族成員之一，目前研究發(fā)現(xiàn)miR-200a表達異常與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切，Gao等［14］研究發(fā)現(xiàn)，miR-200a在神經(jīng)母細胞瘤中表達較癌旁組織明顯降低，上調(diào)miR-200a的表達可以通過靶向AP-2γ基因抑制腫瘤細胞的增殖和成瘤作用。Yao等［15］報道m(xù)iR-200a在乳腺癌中表達減低，上調(diào)miR-200a的表達可以通過靶向TFAM基因抑制腫瘤細胞的增殖。但目前有關miR-200a與肺癌發(fā)生發(fā)展關系方面的研究較少。Zhen等［16］和Chen等［17］均在研究中證實miR-200a在非小細胞肺癌細胞系中表達降低。本研究中通過Real-time PCR檢測了15例非小細胞肺癌組織及對應癌旁組織、人肺癌細胞株（A549、NCI-H520、SKMES-1）及人正常肺支氣管上皮細胞株16HBE中miR-200a的表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-200a在非小細胞肺癌組織和肺癌細胞系中表達均明顯降低，與其他研究結(jié)果一致。但miR-200a對肺癌細胞增殖影響及機制方面的研究國內(nèi)外尚缺乏研究報道。為了研究miR-200a對肺癌細胞增殖的影響，通過脂質(zhì)體介導法將miR-200a mimics成功轉(zhuǎn)染入A549肺癌細胞，成功在A549細胞過表達miR-200a。CCK-8法顯示過表達miR-200a能夠明顯抑制A549肺癌細胞的增殖活力，說明miR-200a能夠抑制肺癌細胞的增殖，屬于肺癌“抑癌基因”。

一個miRNA可以參與調(diào)控多個靶基因，并且每個靶基因又可以受到多個miRNA的同時調(diào)節(jié)。miRNA在腫瘤中的作用主要取決于其調(diào)控的下游靶基因的生物學效應。Zhen等［16］發(fā)現(xiàn)miR-200a可以通過靶向EGFR和c-Met抑制肺癌細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移。Chen等［17］報道m(xù)iR-200a可以通過靶向TSPAN1抑制肺癌細胞的侵襲。為了研究miR-200a對肺癌細胞增殖影響可能的機制，應用靶基因預測數(shù)據(jù)庫miRanda，并結(jié)合基因的功能分析，預測miR-200a的可能靶基因YAP1、YAP1的3′UTR區(qū)存在與miR-200a的種子序列理論上互補的結(jié)合位點，通過雙熒光素酶報告基因證實miR-200a能夠特異性結(jié)合YAP1的3′UTR區(qū)，使熒光蛋白表達水平明顯降低，為了進一步驗證YAP1是否為miR-200a的靶基因，本研究應用Real-time PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-200a能夠明顯下調(diào)YAP1 mRNA和蛋白表達的水平，說明miR-200a對YAP1基因存在負調(diào)控關系，從基因和蛋白兩個水平驗證兩者之間的靶向調(diào)控關系，結(jié)合雙熒光素酶報告基因證實YAP1是miR-200a的直接調(diào)控靶基因。

Yes相關蛋白1（yes-associated protein 1，YAP1）是Hippo信號通路（hippo pathway）的下游信號分子，在細胞生長發(fā)育、DNA修復、內(nèi)源性穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)正?；罨癄顟B(tài)的YAP1可以促進生物體的創(chuàng)傷修復，但是超激活狀態(tài)下的YAP1將過度促進細胞的增殖能力，從而促進了腫瘤的形成［18］。目前研究已經(jīng)證實YAP1在肺癌中表達上調(diào)，許多上游基因可以調(diào)控YAP1參與肺癌細胞的增殖、侵襲及遷移等生物學行為［19-21］。本研究通過干擾實驗，下調(diào)肺癌A549細胞中YAP1的表達，CCK-8法顯示下調(diào)YAP1表達能夠明顯抑制A549肺癌細胞的增殖活力，與上調(diào)miR-200a表達對A549肺癌細胞惡性表型的影響一致，進一步證實miR-200a通過對YAP1基因的調(diào)控影響肺癌細胞的增殖。

綜上所述，本研究證實miR-200a在肺癌組織和細胞中呈表達降低，YAP1是miR-200a的直接調(diào)控靶基因，miR-200a通過負性調(diào)節(jié)YAP1的表達從而抑制肺癌細胞的增殖，為肺癌的治療提供了新的研究思路，并且有可能成為未來肺癌基因治療的潛在靶點。

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（2016-12-14收稿）

（2017-03-09修回）

（編輯：楊紅欣 校對：武斌）

Effects of miR-200a on the proliferation of lung cancer cells by inhibiting YAP1

Lu XU1,Yusong FANG2,Danyun WANG2,Zongming WANG2,Peng XU2

Peng XU;E-mail:lwys002@163.com
1Department of Oncology,The Central Hospital of Xinwen Mining Group,Tai'an 271233,China;2Department of Thoracic Surgery,Ji'nan Central Hospital Affiliated to Shandong University,Ji'nan 250013,China

Objective:To investigate the effects of miR-200a on the proliferation of lung cancer cells and to identify its direct target genes.Methods:Real-time PCR was performed to analyze the miR-200a expression in 15 paired clinical specimens of non-small cell lung cancer and adjacent noncancerous tissues,human lung cancer cell lines(A549,NCI-H520,and SK-MES-1),and one human normal lung bronchial epithelial cell line(16HBE).The effects of miR-200a on the proliferation of A549 lung cancer cells were detected through CCK-8 method.The candidate target genes of miR-200a were identified by bioinformatics screening and then verified by dual luciferase reporter gene assay,real-time PCR,and Western blot.The effects of YAP1 downregulation on the proliferation of A549 lung cancer cell line were also observed through CCK-8 method.Results:The miR-200a expression in non-small cell lung cancer tissues and lung cancer cell lines was significantly decreased(P＜0.01).The upregulation of miR-200a expression could significantly inhibit the proliferation of A549 lung cancer cells(P＜0.01).Dual luciferase reporter gene indicated that miR-200a could directly affect the 3′‐untranslated region of the YAP1 gene to inhibit luciferase activity(P＜0.01).Real-time PCR and Western blot revealed that the upregulation of miR-200a expression could significantly reduce the mRNA and protein expression levels of YAP1 in A549 lung cancer cells(P＜0.01). CCK-8 method indicated that the downregulation of YAP1 could significantly prevent the proliferation of A549 lung cancer cells(P＜0.01).Conclusion:MiR-200a inhibits the proliferation of lung cancer cells by targeting YAP1.Thus,miR-200a elicits tumor suppression effects.

miR-200a,lung cancer,YAP1,proliferation

10.3969/j.issn.1000-8179.07.424

①新汶礦業(yè)集團中心醫(yī)院腫瘤科（山東省泰安市271233）；②山東大學附屬濟南市中心醫(yī)院胸外科

許鵬 lwys002@163.com

許璐 專業(yè)方向為惡性腫瘤內(nèi)科治療。

E-mail：xuluzlk@yeah.net