董懷懷 王元花 廖澤彬 姜遠(yuǎn)英 曹穎瑛

(中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433)

·論著·

芒果苷協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌作用研究

董懷懷 王元花 廖澤彬 姜遠(yuǎn)英 曹穎瑛

(中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院新藥研究中心，上海 200433)

目的 研究芒果苷與氟康唑合用對(duì)唑類耐藥白念珠菌協(xié)同抗真菌的作用和機(jī)制。方法 采用棋盤式微量稀釋法測(cè)試芒果苷協(xié)同氟康唑?qū)?2株耐藥白念珠菌的最小抑菌濃度MIC80；時(shí)間-殺菌曲線探究?jī)伤幝?lián)用對(duì)4株耐藥白念珠菌生長(zhǎng)的抑制作用；藥物生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)探究不同濃度芒果苷和不同濃度氟康唑協(xié)同抗耐藥白念珠菌藥效；通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)兩藥聯(lián)用時(shí)耐藥基因CDR1、CDR2、MDR1表達(dá)水平。結(jié)果 芒果苷聯(lián)合氟康唑可產(chǎn)生協(xié)同抗唑類白念珠菌作用，協(xié)同指數(shù) (FICI)<0.5；兩藥合用對(duì)白念珠菌生長(zhǎng)可產(chǎn)生抑制作用；兩藥合用降低耐藥基因CDR1表達(dá)水平。結(jié)論 芒果苷與氟康唑合用可產(chǎn)生協(xié)同抗唑類耐藥白念珠菌作用。

耐藥白念珠菌；芒果苷；氟康唑

近年來(lái)，由于抗生素和免疫抑制劑的廣泛使用，免疫缺陷患者 (艾滋病患者、器官移植患者和放、化療癌癥患者)不斷增多，深部真菌感染發(fā)生率逐年增加，尤其白念珠菌 (Candidaalbicans)感染最為常見(jiàn)[1]。白念珠菌作為一種條件致病真菌，會(huì)引起人類淺表性和系統(tǒng)性感染，導(dǎo)致陰道炎、菌血癥等疾病。氟康唑等唑類藥物是臨床上治療和預(yù)防白念珠菌感染的常用藥物，但隨著藥物長(zhǎng)期使用，耐藥現(xiàn)象非常普遍[2]。目前對(duì)白念珠菌耐藥性機(jī)制研究包括細(xì)胞膜通透性降低、外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)、藥物靶點(diǎn)基因變異或過(guò)度表達(dá)、生物被膜的形成等[3-6]。為解決真菌耐藥難題，小檗堿、黃芩素和光甘草定等抗真菌藥物增效劑研究受到廣泛關(guān)注[7-9]。

芒果苷 (mangiferin)是一種雙苯吡酮類黃酮類化合物，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。研究表明，芒果苷具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、抗細(xì)菌等多方面藥理活性，但對(duì)于芒果苷抗耐藥白念珠菌藥理作用尚未有報(bào)導(dǎo)[10-12]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)試22株臨床耐藥白念珠菌MIC80、藥物生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)、殺菌曲線和RT-PCR研究芒果苷協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌的作用機(jī)制，為臨床治療耐藥白念珠菌感染提供新思路、提供安全有效的給藥方案。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 臨床耐藥白念珠菌 (Candidaalbicans,C.albicans)22株，由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬上海市長(zhǎng)海醫(yī)院真菌室提供，并且經(jīng)形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定。

藥物 氟康唑 (fluconazole,FLC，批號(hào)F8929)和芒果苷 (mangiferin,MG,批號(hào)M3547)從sigma公司購(gòu)買，二甲亞砜 (Dimethyl sulfoxide，DMSO)購(gòu)自國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司。氟康唑和芒果苷分別用二甲亞砜溶解，配制使用。

培養(yǎng)基 YPD液體培養(yǎng)基 (2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母浸膏)。SDA固體培養(yǎng)基 (4%葡萄糖，2%瓊脂，1%蛋白胨)。RPMI1640培養(yǎng)基 (3.45%嗎啡啉丙磺酸，1%RPMI1640，0.2%NaHCO3，NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾除菌，與4℃保存[13])。

儀器 HZQ-F160恒溫振蕩培養(yǎng)箱 (江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)，Eppendorf 5417高速冷凍離心機(jī) (Eppendorf)，SW-CT-IF型超凈化工作臺(tái) (蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 (Becton,Dickinson and Company)。

1.2 方法

菌株培養(yǎng) 從SDA固體培養(yǎng)基上挑取單克隆菌株與YPD液體培養(yǎng)基，30℃，200 r/min活化培養(yǎng)16 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

棋盤式微量稀釋法 藥物最小抑菌濃度MIC80測(cè)定：取16 h活化后菌液，用新鮮的RPMI1640培養(yǎng)基稀釋重懸，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整菌液濃度至1×103～5×103CFU/mL。按照CLSI推薦RPMI1640培養(yǎng)基倍比稀釋法[14-15]，在24、48 h分別測(cè)定藥物MIC80值(與空白對(duì)照組相比，以O(shè)D600下降80%以上的最低藥物濃度為MIC80值)。

協(xié)同藥效判定 采用聯(lián)合抑菌分?jǐn)?shù)考察協(xié)同藥效，聯(lián)合抑菌分?jǐn)?shù)分別為每種藥物合用時(shí)抑菌時(shí)所需最低抑菌濃度(MIC)分別除以單用時(shí)MIC商的和，F(xiàn)ICI≤0.5時(shí)兩藥的相互作用確定為協(xié)同作用[16]。

生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn) 將過(guò)夜培養(yǎng)16h后菌液PBS漂洗兩次，再用RPMI1640培養(yǎng)基重懸，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整菌濃度至5×103，稀釋菌液分裝與高壓滅菌玻璃管中。各組加入單用及聯(lián)用藥物，30℃，200 r/min恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后拍照，用血球計(jì)數(shù)板記錄各組單克隆菌數(shù)目[9]。

殺菌曲線實(shí)驗(yàn) 將過(guò)夜菌液用PBS漂洗兩次后再用RPMI1640培養(yǎng)基重懸，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整菌濃度至1×103～5×103CFU/mL，分別加入單用及合用藥物。在0、12、24、36、48 h從不同稀釋倍數(shù)的菌液中各取適量，均勻涂鋪于含SDA固體培養(yǎng)基表面。平皿于30℃真菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)菌落數(shù)目，以log10 CFU/mL對(duì)時(shí)間作曲線。

提取總RNA及Real-Time PCR 白念珠菌耐藥菌103于YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 (OD600=0.5),分別加入氟康唑 (4 μg/mL)、芒果苷 (32 μg/mL)、氟康唑芒果苷合用 (8 μg/mL氟康唑+32 μg/mL芒果苷)，30℃，200 r/min培養(yǎng)12 h后，參照北京天恩澤公司試劑盒提取RNA。314 nm處檢測(cè)RNA濃度，并檢測(cè)OD260/OD280和OD260/OD230數(shù)值，考察RNA提取的質(zhì)量，然后各組取相同量RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR (Real Time PCR)循環(huán)參數(shù)如下：95℃ (變性)5 s,55℃ 30 s (退火),72℃ 1 min (延伸)，重復(fù)45個(gè)循環(huán)。以18S rRNA為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法分析基因表達(dá)水平差異。本實(shí)驗(yàn)選取所用引物見(jiàn)表1。

表1 本實(shí)驗(yàn)RT-PCR引物序列

注：F.正向引物,R.反向引物

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)所有結(jié)果均進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)，采用GraphPad Prism 5分析及作圖，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 芒果苷協(xié)同氟康唑MIC80

應(yīng)用棋盤式微量稀釋法，檢測(cè)芒果苷和氟康唑合用對(duì)22株臨床耐藥菌的最低抑菌濃度。結(jié)果顯示：兩個(gè)藥物單用MIC80>64 μg/mL，4～8 μg/mL芒果苷聯(lián)用可以降低氟康唑的最低抑菌濃度至1～4 μg/mL (見(jiàn)表2)。部分協(xié)同指數(shù) (fractional inhibitory concentration index，F(xiàn)ICI，分別為每種藥物合用時(shí)抑菌時(shí)所需最低抑菌濃度MIC與單用時(shí)MIC的比值，F(xiàn)ICI≤0.5時(shí)兩藥的相互作用確定為協(xié)同作用，且FICI數(shù)值越小，協(xié)同作用越強(qiáng))小于0.2 (見(jiàn)表2)，說(shuō)明芒果苷與氟康唑具有明顯的協(xié)同抗菌藥效。

表2 芒果苷協(xié)同氟康唑抗臨床耐藥白念珠菌MIC80

Tab.2 MIC80of the combination of mangiferin and fluconazole against fluconazole-resistantC.albicansby microdilution assay

菌株MIC80單獨(dú)(μg/mL)MIC80結(jié)合24h(μg/mL)FLCMGFLCMGFICI綜合指數(shù)MIC80結(jié)合48h(μg/mL)FLCMGFICI綜合指數(shù)模式18#>64>64440.13480.19協(xié)同25#>64>64240.09440.13協(xié)同J18>64>64440.13440.13協(xié)同J28>64>64180.14280.16協(xié)同J38>64>64180.14280.16協(xié)同7>64>64280.16280.16協(xié)同17>64>64180.14280.16協(xié)同18>64>64240.09440.13協(xié)同032>64>64480.19480.19協(xié)同100>64>64180.14280.16協(xié)同103>64>64180.14180.14協(xié)同162>64>64140.08240.09協(xié)同215>64>64240.09440.13協(xié)同271>64>64180.14280.16協(xié)同305>64>64240.09280.16協(xié)同385>64>64140.19140.19協(xié)同502>64>64140.08180.14協(xié)同557>64>64240.09280.16協(xié)同842>64>64280.16280.16協(xié)同876>64>64180.14280.16協(xié)同901>64>64280.16480.19協(xié)同940>64>64180.14280.16協(xié)同

注：MG.芒果苷,FLC.氟康唑

2.2 生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)

生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究氟康唑和芒果苷不同濃度下合用對(duì)耐藥白念珠菌的抑制作用，將實(shí)驗(yàn)室前期經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)和生化學(xué)鑒定的103耐藥菌株為研究對(duì)象，藥物作用48 h后通過(guò)拍照記錄各組菌液渾濁情況和對(duì)各組細(xì)胞濃度計(jì)數(shù)反應(yīng)藥物對(duì)菌的抑制作用。由圖2a分析可看出，空白組2～4 μg/mL氟康唑和4～64 μg/mL芒果苷單用組溶液渾濁，表明兩個(gè)藥物單用不能抑制103耐藥菌的生長(zhǎng)。而1 μg/mL氟康唑與8 μg/mL芒果苷合用組，溶液顯澄清，說(shuō)明該濃度藥物明顯抑制了103菌的生長(zhǎng)，這與棋盤式鋪板實(shí)驗(yàn)MIC80數(shù)據(jù)相符合 (見(jiàn)表2)。對(duì)各組細(xì)胞分別計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)分析可以得出，氟康唑和芒果苷單獨(dú)加入后，耐藥菌103最終都生長(zhǎng)至108左右，與空白組相比沒(méi)有明顯差異。當(dāng)氟康唑與不同濃度芒果苷聯(lián)用后，菌的生長(zhǎng)受到了明顯抑制。并且隨藥物濃度增加，菌生長(zhǎng)抑制作用更加明顯，呈現(xiàn)一定量效關(guān)系 (見(jiàn)圖2b)。

2.3 時(shí)間-殺菌曲線

時(shí)間-殺菌曲線可以反應(yīng)各時(shí)間點(diǎn)藥物的抑菌或殺菌作用，本實(shí)驗(yàn)采用時(shí)間-殺菌曲線研究芒果苷和氟康唑聯(lián)用對(duì)四株臨床耐藥白念珠菌103、385、876、940抑制作用。菌液起始濃度參照棋盤式稀釋法1～5×103CFU/mL，倍比稀釋涂板分析0、12、24、36、48 h兩藥聯(lián)用的作用。結(jié)果表明：32 μg/mL芒果苷 (MG)對(duì)四株耐藥白念珠菌未顯示抑制作用，這與棋盤式結(jié)果相符 (芒果苷單用MIC80>64 μg/mL)；8 μg/mL氟康唑 (FLC)前期對(duì)菌生長(zhǎng)有一定抑制作用，在48 h后差異不明顯；32 μg/mL芒果苷 (MG)與8 μg/mL氟康唑 (FLC)聯(lián)用后，24 h就可顯示差異，作用36、48 h與單用組和空白組相比差異更加明顯 (見(jiàn)圖3)。

2.4 芒果苷和氟康唑聯(lián)用對(duì)耐藥基因表達(dá)影響

白念珠菌103經(jīng)氟康唑、芒果苷及兩藥聯(lián)合作用10 h后，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR測(cè)定白念珠菌耐藥基因CDR1、CDR2、MDR1的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，兩藥聯(lián)用組耐藥基因表達(dá)水平明顯低于氟康唑單用組，氟康唑單用組CDR2、MDR1明顯上調(diào)2.5倍左右。在聯(lián)用組基因表達(dá)水平中，CDR1下調(diào)最為明顯，CDR2、MDR2較氟康唑單用組下調(diào)1～1.5倍 (見(jiàn)圖4)。

3 討 論

目前，應(yīng)用于臨床的抗真菌藥物數(shù)量有限，主要包括唑類抗真菌藥物，如氟康唑；多烯類抗生素，

Fig.1 Structure of mangiferin Fig.2 Growth condition of fluconazole-resistantCandidaalbicans103 treated with different concentrations of fluconazole (FLC) and mangiferin (MG).Fluconazole-resistantCandidaalbicans103 were suspended to 5×103CFU/mL in glass tubes.Different concentrations of fluconazole (16,8,4,2,1 μg/mL) and mangiferin (64,32,16,8,4 μg/mL) alone or the combiantion were added into tubes.After incubation at 30℃,200 r/min for 48 h,pictures were taken.Colony were determined by Hemocytometer Measurement (a.Pictures of growth condition ofCandidaalbicans103 after 48 h incubation,b.Number ofCandidaalbicansin each tube detemined by Hemocytometer Measurement).Each experimental condition was independently repeated three times (MG.mangiferin,FLC.fluconazole)

如兩性霉素B；棘白菌素類抗真菌藥物，如卡泊芬凈；丙烯胺類，如特比萘芬。其中，氟康唑由于溶解

Fig.3 Time-kill curves of 8 μg/mL fluconazole and 32 μg/mL mangiferin against fluconazole-resistantCandidaalbicans103,385,876 and 940.Each experimental condition was independently repeated for three times (MG.mangiferin,FLC.fluconazole) Fig.4 Effects of 32 μg/mL mangiferin in combination with 8 μg/mL fluconazole on the expression of CDR1,CDR2,MDR1 inCandidaalbicans.Each experimental condition was independently repeated for three times (MG.mangiferin,FLC.fluconazole)

性好、不良反應(yīng)較少、生物利用度高等優(yōu)點(diǎn)，受到廣泛應(yīng)用。但由于多次重復(fù)給藥和長(zhǎng)期治療，導(dǎo)致耐藥性越來(lái)越普遍。而且，對(duì)氟康唑耐藥的臨床菌株通常對(duì)其他唑類藥物 (如伏立康唑、酮康唑、伊曲康唑等)能夠產(chǎn)生交叉耐藥現(xiàn)象。其中，白念珠菌 (Candidaalbicans)是臨床最常見(jiàn)的條件致病性真菌，能夠引起皮膚感染、黏膜感染以及侵入性深部真菌感染等多種疾病。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道白念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥性不斷增強(qiáng)，成為臨床上治療失敗的主要原因。

研究表明白念珠菌耐藥的主要機(jī)制包括藥物靶點(diǎn)基因 (Erg11)突變或高度表達(dá)、細(xì)胞對(duì)藥物外排能力增強(qiáng)、形成生物被膜。其中，對(duì)藥物外排能力增強(qiáng)，減少抗真菌藥物胞內(nèi)積累，是白念珠菌對(duì)唑類藥物最主要的耐藥機(jī)制。藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要包括ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 (ATP-biding cassette)和易化擴(kuò)散載體超家族蛋白 (major facilitator superfamily)，但只有Cdr1p、Cdr2p、Mdr1p與白念珠菌耐藥性相關(guān)。

芒果苷作為一種從植物中提取的天然化合物，資源豐富，毒副作用低，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多方面藥理作用。此外，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)芒果苷具有抑制病原微生物作用，例如芒果苷可以協(xié)同紅霉素抗痤瘡丙酸桿菌及金黃色葡萄球菌，芒果苷泡騰片體外可以抑制銅綠假單胞菌、大腸埃希菌生長(zhǎng)，但對(duì)于抗耐藥白念珠菌作用未有研究報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，芒果苷作為一種抗真菌增效劑，可以恢復(fù)耐藥菌對(duì)藥物的敏感性，降低氟康唑MIC80至1～4 μg/mL。藥物敏感實(shí)驗(yàn)分析對(duì)比藥物作用48 h后菌液渾濁度、涂板計(jì)數(shù)每個(gè)藥物濃度作用48 h后菌的克隆數(shù)目進(jìn)一步確認(rèn)了兩藥合用對(duì)耐藥白念珠菌的抑制作用。隨機(jī)選取103、385、876、940四株耐藥菌進(jìn)行殺菌曲線實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明32 μg/mL芒果苷和8 μg/mL氟康唑聯(lián)用可明顯抑制菌的生長(zhǎng)，并表明兩藥聯(lián)用對(duì)耐藥白念珠菌抑制作用的普遍性。

白念珠菌的主要耐藥蛋白包括Cdr1p、Cdr2p、Mdr1p，Cdr1p蛋白是最先從白念珠菌中表達(dá)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[17]，直接參與白念珠菌對(duì)氮唑類藥物耐藥性的產(chǎn)生[18]，大量研究發(fā)現(xiàn)Cdr1p蛋白的高表達(dá)是臨床耐藥白念珠菌耐藥的主要機(jī)制[19-20]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR分析耐藥基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示氟康唑處理組CDR1、CDR2、MDR1基因表達(dá)水平升高，這可能與白念珠菌103在藥物刺激下外排泵能力增強(qiáng)有關(guān)；相對(duì)8 μg/mL氟康唑處理組，聯(lián)合用藥組耐藥基因CDR1、CDR2、MDR1基因表達(dá)水平明顯下調(diào)，CDR1下調(diào)幅度最大。結(jié)果提示 芒果苷協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌分子機(jī)制可能是由于Cdr1p、Cdr2p、Mdr1p耐藥蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能受到抑制，從而恢復(fù)了菌株對(duì)氟康唑的敏感性。其中，聯(lián)合用藥處理組CDR1基因表達(dá)水平下調(diào)最明顯，表明MG與FLC協(xié)同抗耐藥白念珠菌的主要分子機(jī)制與Cdr1p蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能受到抑制有關(guān)。

綜上所述，本次研究首次報(bào)道了芒果苷具有協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌作用。通過(guò)對(duì)多株耐藥菌測(cè)試MIC80，生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)和殺菌曲線證實(shí)了兩藥聯(lián)用抗耐藥白念珠菌作用的普遍性。應(yīng)用RT-PCR提示兩藥合用機(jī)制與耐藥基因CDR1、CDR2、MDR1表達(dá)水平下調(diào)及外排泵能力減弱有關(guān)。芒果苷毒副作用低，提取方便，芒果苷和氟康唑聯(lián)用抗耐藥白念珠菌可以為臨床耐藥菌治療提供安全、有效的新思路和新方案。

[1] Crunkhorn S.Fungal infection:Protecting fromCandidaalbicans[J].Nat Rev Drug Discov,2016,15(9):604.

[2] Liao X,Qiu H,Li R,et al.Risk factors for fluconazole-resistant invasive candidiasis in intensive care unit patients:An analysis from the China Survey of Candidiasis study[J].J Crit Care,2015,30(5):1154.

[3] White T C,Holleman S,Dy F,et al.Resistance mechanisms in clinical isolates ofCandidaalbicans[J].Antimicrob Agents Chemother,2002,46(6):1704-1713.

[4] Xu Y,Sheng F,Zhao J,et al.ERG11 mutations and expression of resistance genes in fluconazole-resistantCandidaalbicansisolates[J].Arch Microbiol,2015,197(9):1087-1093.

[5] Nobile CJ,Johnson AD.CandidaalbicansBiofilms and Human Disease[J].Annu Rev Microbiol,2015,69(1):71-92.

[6] Mane A,Vidhate P,Kusro C,et al.Molecular mechanisms associated with Fluconazole resistance in clinicalCandidaalbicansisolates from India[J].Mycoses,2016,59(2):93-100.

[7] Li DD.Fluconazole assists berberine to kill fluconazole-resistantCandidaalbicans[J].Antimicrob Agents Chemother,2013,57(12):6016-6027.

[8] Cao YY,Daib BD,Yan W,et al.Invitroactivity of baicalein againstCandidaalbicansbiofilms[J].Int J Antimicrob Agents,2008,32(1):73-77.

[9] Liu W,Li LP,Zhang JD,et al.Synergistic antifungal effect of glabridin and fluconazole[J].Plos One,2014,9(7):e103442-e103442.

[10] Morais TC,Arruda BR,de Sousa Magalh?es H,et al.Mangiferin ameliorates the intestinal inflammatory response and the impaired gastrointestinal motility in mouse model of postoperative ileus[J].Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,2015,388(5):531-538.

[11] Bhatia HS,Candelario-Jalil E,Oliveira A,et al.Mangiferin inhibits cyclooxygenase-2 expression and prostaglandin E 2,production in activated rat microglial cells[J].Arch Biochem Biophys,2008,477(2):253-258.

[12] Stoilova I,Ho L.Antimicrobial and antioxidant activity of the polyphenol mangiferin[J].Herba Polonica,2005,48(211):33-40.

[13] Kuykendall RJ,Lockhart SR.Microbroth dilution susceptibility testing ofCandidaspecies[J].Methods Mol Biol,2016,1356：173-181.

[14] Rex J H.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts:Third informational supplement[M].Clinical and Laboratory Standards Institute,2008.

[15] Perea S,Gonzalez G,Fothergill AW,et al.Invitroactivities of terbinafine in combination with fluconazole,itraconazole,voriconazole,and posaconazole against clinical isolates ofCandidaglabratawith decreased susceptibility to azoles[J].J Clin Microbiol,2002,40(5):1831-1833.

[16] Gil-Lamaignere C,Müller FM.Differential effects of the combination of caspofungin and terbinafine againstCandidaalbicans,Candidadubliniensis,andCandidakefyr[J].Int J Antimicrob Agents,2004,23(5):520-523.

[17] Prasad R,De Wergifosse P,Goffeau A，et al.Molecular cloning and characterization of a novel gene ofCandidaalbicans,cdr1,conferring multiple resistance to drugs and antifungals[J].Curr Genet,1995,27(4):320-329.

[18] Krishnamurthy S,Gupta V,Snehlata P,et al.Characterisation of human steroid hormone transport mediated by Cdr1p,a multidrug transporter ofCandidaalbicans,belonging to the ATP binding cassette super family[J].FEMS Microbiol Lett,1998,158(1):69-74.

[19] Sanglard D,Ischer F,Calabrese D,et al.The ATP binding cassette transporter geneCgCDR1 fromCandidaglabratais involved in the resistance of clinical isolates to azole antifungal agents[J].Antimicrob Agents Chemother,1999,43(11):2753-2765.

[20] Manoharlal R,Gaur NS,Morschhauser J,et al.Transcriptional activation and increased mRNA stability contribute to overexpression ofCDR1 in azole-resistantCandidaalbicans[J].Antimicrob Agents Chemother,2008,52(4):1481-1492.

Synergistic effect of mangiferin in combination with fluconazole against fluconazole-resistantCandidaalbicans

DONG Huai-huai,WANG Yuan-hua,LIAO Ze-bin,JIANG Yuan-ying,CAO Ying-ying

(NewDrugRearchandDevelopmentCenter,SchoolofPharmacy,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China)

Objective To explore the synergistic effect of mangiferin in combination with fluconazole against fluconazole-resistantCandidaalbicans.Methods The minimal inhibitory concentrations (MIC80) of 22 fluconazole-resistantCandidaalbicansstrains by mangiferin in combination with fluconazole were determined by checkerboard microdilution assay.Time-kill curves and cell growth test were used to investigate the synergistic effect onCandidaalbciansgrowth process.The expression of CDR1,CDR2,MDR1 were measured by Real time RT-PCR.Results Mangiferin in combination with fluconazole could inhibit the growth ofCandidaalbicansobviously (FICI<0.5).Mangiferin and fluconazole-treated cells expressed lower level of CDR1 mRNA than the cells grown in the presence of fluconazole or mangiferin alone.Conclusions Mangiferin possessed a synergistic effect with fluconazole against fluconazole-resistantCandidaalbcians.

fluconazole-resistantCandidaalbicans；mangiferin；fluconazole

78-82]

國(guó)家973項(xiàng)目 (2013CB531602)；國(guó)家自然科學(xué)基金 (81271798,81671991)

董懷懷，男 (漢族)，碩士研究生在讀.E-mail:13917511681@163.com

姜遠(yuǎn)英,E-mail:13761571578@163.com;曹穎瑛,E-mail:caoyingying608@163.com

R 379.4

A

1673-3827(2017)12-0078-05

2016-10-15 [本文編輯] 衛(wèi)鳳蓮