唐立紅，柴 圓，王博華，孫寶瑩，桂曉慧

（赤峰學院 生命科學學院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

植物葉制片技術的改進探討

唐立紅，柴 圓，王博華，孫寶瑩，桂曉慧

（赤峰學院 生命科學學院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000）

本研究基于傳統(tǒng)石蠟制片方法，以多種處于幼嫩、柔軟生長狀態(tài)的植物葉片為試材，針對固定、脫水與透明、浸蠟與包埋、展片及烤片等制片環(huán)節(jié)，從試劑的處理濃度、處理時間、處理溫度等方面進行改良，探索出適合幼嫩、柔軟植物葉的制片方法.

植物葉片；石蠟切片；改進；幼嫩；柔軟

石蠟制片是觀察植物組織結(jié)構(gòu)常用的技術之一，在研究植物形態(tài)建成、植物雜交育種、特殊植物的培育和鑒別等方面有著重要的應用[1].該技術運用石蠟與植物組織能夠很好地結(jié)合這一基本原理，經(jīng)過標本采集、固定、脫水（Ⅰ）、透明（Ⅰ）、浸蠟、包埋、切片、展片、烤片、脫蠟、復水、染色、脫水（Ⅱ）、透明（Ⅱ）和封片等一系列特殊處理步驟制作而成[2].在植物顯微觀察過程中，優(yōu)良切片應具備組織結(jié)構(gòu)完整、薄厚適當、組織面平整、染色清晰和反差強度大等特點.由于試材組織學和發(fā)育特征不同，其制片效果差異較大.幼嫩、柔軟的植物材料，運用傳統(tǒng)石蠟切片技術流程進行制片，常出現(xiàn)組織面破壞、結(jié)構(gòu)不完整、染色不良等問題.近年來有學者對其制作方法進行改進研究，但研究探索都只針對一種植物進行，實驗結(jié)論具有局限性.本課題以多種處于幼嫩、柔軟生長狀態(tài)的植物葉片為試材，通過大量試驗，對常規(guī)石蠟切片技術的一系列環(huán)節(jié)進行改良[3]，旨在探索出適合幼嫩、柔軟植物材料的石蠟切片方法，為植物形態(tài)解剖學研究提供一定的技術支持.

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

CS101-A型電熱鼓風干燥箱（重慶試驗設備廠）、YD-6D生物組織包埋機（金華市益迪醫(yī)療設備有限公司）、HM325石蠟切片機（德國MICROM）、YD-A生物組織攤片機（金華市益迪醫(yī)療設備有限公司）、YD-B生物組織烤片機（金華市益迪醫(yī)療設備有限公司）、CX41生物顯微鏡（日本OLYMPUS）.

1.2 試驗材料

試驗材料均采自赤峰學院校園或?qū)嶒炇覂?nèi).于2015年4月至2015年6月期間，分別選取暴馬丁香（Syring reticulata）、山杏（Prunus armeniaca）、蒙古櫟（Quercus mogolica）、文冠(Xanthoceras sorbifolium)、紫丁香（Syringa oblata）、花紅（Malus asiatica）、五葉地錦 (Parthenocissus quinquefolia)、龍爪槐 (Sophora japonica)、煙草 (Nicotiana tabacum)、高粱(Sorghum bicolor)幼嫩、柔軟且生長狀態(tài)良好的葉,在葉片1/2處切取1.2cm×0.5cm帶中脈的部分，放入FAA固定液中.

1.3 試驗方法

在傳統(tǒng)石蠟切片制作方法的基礎上，對固定、脫水與透明、浸蠟與包埋、展片及烤片等制片環(huán)節(jié)[4],從試劑的處理濃度、處理時間、處理溫度等方面進行改良試驗，篩選出適合幼嫩、柔軟植物葉片的石蠟制片方法.

1.3.1 固定 固定是取材后的第一個環(huán)節(jié)，主要目的是通過化學藥品的作用保存試驗材料組織、細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)，防止其變形、自溶和腐敗.植物制片常用的固定劑為FAA液，是用60%（或70%酒精）、冰醋酸、福爾馬林按18:1:1比例混勻制成.本試驗降低了酒精溶液濃度，將60%酒精溶液替換為50%酒精溶液.試驗材料切取后立即將其投入配置好的FAA固定液中固定.

1.3.2 脫水與透明 常規(guī)石蠟制片采用乙醇梯度脫水、二甲苯透明[5]，具體方式為50%乙醇（ALC）（1h）→70%ALC(1h)→85%ALC(1.5h)→95%ALC(2h)→100%ALC(2h)；1/2無水乙醇1/2二甲苯（2h）→二甲苯（2h）.本試驗增加了脫水梯度并縮短了每級脫水、透明時間.具體操作為將試驗材料從FAA固定液中取出分別裝到包埋盒中，經(jīng)各級乙醇、二甲苯溶液進行脫水、透明處理.乙醇濃度、脫水和透明時間依次為30% ALC(30min)→50%ALC(20min)→70%ALC(20min)→85%ALC (20min)→95%ALC(20min)→100%ALC（15min）→100%ALC（15min）；1/2無水乙醇 1/2二甲苯（20min）→二甲苯（20min）.

1.3.3 浸蠟與包埋 本試驗將透明后的材料取出后直接放入1:1的無水乙醇：蠟屑的飽和溶液中，并置于38℃恒溫箱中12h后移入62℃熔融的純蠟（熔點為56℃～58℃）中，每隔4h更換一次純蠟（共換兩次）.將滲透好石蠟的植物材料直接立于包埋盒內(nèi)的熔蠟中進行石蠟包埋.包埋時蠟臺、蠟嘴、蠟鍋溫度調(diào)整為60℃、68℃、62℃.改變了傳統(tǒng)的材料與蠟屑同時放入的方式，純蠟的透浸由3次改為2次，處理溫度在原操作基礎上也相應的做了下調(diào).

1.3.4 展片及烤片 展片在44℃水浴鍋中進行，將無破損的材料切片撈至載玻片中央，并置于37℃烤片機上進行干燥固定，24小時后進行染色處理.展片的溫度由原來的45℃調(diào)整為44℃；烤片溫度也由38℃改變?yōu)?7℃.

明確各環(huán)節(jié)對不同試驗材料最佳的處理方式，對各環(huán)節(jié)的處理方式進行優(yōu)化組合試驗.在傳統(tǒng)石蠟制片方法基礎上進行制片，觀察切片效果，篩選最佳方案.

2 結(jié)果與分析

幼嫩、柔軟的植物葉片，運用改良方法制得的永久切片，其形態(tài)結(jié)構(gòu)完整、細胞界限清晰、染色反差大、切片整潔，具有較好地觀察效果（圖1）.

柔軟幼嫩的植物組織，其含水量相對較大、質(zhì)地韌性低、結(jié)構(gòu)抗性差.低濃度的酒精固定液可緩和材料制片時的破碎反應.30%的酒精梯度脫水及脫水透明時間的縮短，減緩了脫水劑、透明劑引起的組織收縮反應，處理后的材料其硬度下降，制片不易破碎.

浸蠟時材料直接放入融好的無水乙醇、蠟屑的飽和溶液中，可使材料與石蠟更好的有機融浸，切片時材料韌性增加，不易破碎.純蠟透浸數(shù)減少及浸蠟、包埋時溫度的下調(diào)，緩解了高溫對幼嫩材料的破壞作用，從而降低了制片的破碎度.

3 結(jié)論及注意事項

本課題研究初步顯示，幼嫩、柔軟狀態(tài)的植物葉片，可利用改良方法進行制片.具體實驗流程為：（1）固定：用50%酒精溶液的FAA固定液固定24h以上.（2）脫水與透明：將固定液中的植物材料取出后依次放入30%ALC(30min)→50%ALC(20min)→70%ALC(20min)→85%ALC(20min)→95% ALC(20min)→100%ALC（15min）→100%ALC（15min）；1/2無水乙醇1/2二甲苯混合液（20min）→二甲苯（20min）.（3）浸蠟與包埋：1/2二甲苯1/2蠟屑飽和溶液（置38℃恒溫箱中12小時），次日換純蠟：每隔4h更換一次純蠟（共換兩次）[6].包埋溫度設置為62℃.（4）切片與干燥：展片在44℃水浴鍋中進行，在37℃烤片機上進行烤片（至少24h后可進行染色處理）.（5）染色與封片：按常規(guī)步驟進行.

制片過程還要注意以下事項：

3.1 幼嫩、柔軟狀態(tài)的植物試材比重輕，包埋時不易立穩(wěn)，故取材時可適當增加材料的切取寬度，以提高包埋環(huán)節(jié)的材料穩(wěn)固性.

3.2 包埋應一次完成，防止中間出現(xiàn)溫差，造成蠟塊包埋不均勻[7].包埋時蠟臺、蠟嘴溫度設置為60℃、68℃效果較好.包埋過程中所使用的鑷子在取材前應進行預熱，防止鑷子尖端使石蠟凝固，不利于操作.冷卻蠟塊時不要降溫的太快，容易使蠟塊變脆，不易進行切片.

3.3 切片成敗不僅與切片前的系列處理有關，而且與切片的操作也密切相關.包埋好的蠟塊要用刀片去掉周圍多余的蠟，將其修整，放在切片機相應位置.切片前要調(diào)整好刀片的角度，蠟塊切面要保持與刀片平行.在操作過程中，要不斷清理刀片及蠟塊周圍的殘蠟，避免蠟帶斷裂和彎曲.

3.4 展片時水浴鍋中最好用蒸餾水，避免雜質(zhì)浮于蠟帶上.

3.5 封片時要根據(jù)蓋玻片的大小來評估所需樹膠的滴數(shù)，樹膠過多，可在干燥后用刀刮去，并用紗布蘸二甲苯拭去其殘余的樹膠[8]；若樹膠過少，則用玻璃棒加滴樹膠在蓋玻片的邊緣補足.封片時要避免口、鼻對切片呼吸，以免產(chǎn)生霧氣，影響切片質(zhì)量.如果封片時產(chǎn)生氣泡，可快速掃過酒精燈火焰，能有效趕出氣泡.

圖1 十種幼嫩、柔軟植物葉橫切結(jié)構(gòu)

3.6 制片過程由多個環(huán)節(jié)組成，需要連續(xù)的時間來操作.因此，事先要制定好工作日程計劃，以保證制片工作的順利完成.

〔1〕潘葉,馮永慶,馬煥普.一種適用于植物組織的快速石蠟制片法[J].中國農(nóng)學通報,2008,24(3):112-115.

〔2〕楊虎彪,李曉霞,羅麗娟.植物石蠟制片中透明和脫蠟技術的改良[J].植物學報,2009,44(2):230-235.

〔3〕李素坤,張秋芝,郝玉蘭.玉米成熟期莖桿石蠟切片方法的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2010,38(8):3935-3937.

〔4〕田晨霞,張詠梅,馬暉玲.草地早熟禾胚胎結(jié)構(gòu)石蠟切片制作方法初探[J].草業(yè)科學,2013,30(12):1980-1986.

〔5〕田瓏,張衛(wèi)光.正丁醇脫水制作肝組織石蠟切片[J].解剖科學進展,2004,10(2):190.

〔6〕王靜,左幸,黃正文.常規(guī)植物石蠟制片技術的改進及應用[J].安徽農(nóng)學通報,2011,17(11):36-39.

〔7〕楊捷頻.常規(guī)石蠟切片方法的改良[J].生物學雜志,2006,23 (1):45-46.

〔8〕王金平,張俊梅.白頭翁花的石蠟切片制作[J].信陽師范學院學報,2008,21(4):573-576.

Q-34

A

1673-260X（2017）04-0006-02

2017-02-03