折紅兵 范桂彥 張合龍 王曉武 武 劍 錢 偉* 徐兆生*

〔1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2中蔬種業(yè)科技（北京）有限公司，北京 100081〕

菠菜NBS-LRR類抗病基因同源序列的克隆及分析

折紅兵1范桂彥1張合龍2王曉武1武 劍1錢 偉2*徐兆生2*

〔1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2中蔬種業(yè)科技（北京）有限公司，北京 100081〕

依據(jù)已知NBS-LRR類抗病基因的P-loop和GLPL兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，對(duì)抗菠菜霜霉病商業(yè)雜交種RZ51-147、自交系12S3和12S4的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、克隆和序列測(cè)定，共獲得23條具有完整開放閱讀框且含有NBS結(jié)構(gòu)的抗病基因同源序列（resistance gene analogs，RGAs），編號(hào)為SP1～SP17、SP19～SP24，其在NCBI中的登錄號(hào)為KX914865～KX914887。核苷酸比較分析結(jié)果表明，這23條RGAs大多與甜菜中推測(cè)的一些抗病蛋白基因或其他相關(guān)蛋白基因具有較高的同源性，其中SP1、SP2、SP5、SP6、SP10、SP11、SP12、SP13等8條序列均與甜菜RF45類抗病蛋白有著86%以上的同源性；SP3、SP4、SP8、SP9、SP24等5條序列與甜菜RPP13類抗病蛋白的同源性在85%以上，與向日葵抗霜霉病基因PI8相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列相似性為32.20%～33.52%，且在進(jìn)化樹上聚為一類，推測(cè)其可能與抗霜霉病相關(guān)。同源進(jìn)化分析結(jié)果表明，除SP7外，其余序列均為non-TIR-NBS-LRR類抗病基因，并與推導(dǎo)的氨基酸序列多重比較結(jié)果一致。

菠菜；抗病基因同源序列；NBS-LRR；菠菜霜霉病

菠菜（Spinacia oleraceaL.）別名波斯草、赤根菜，是黎科菠菜屬一年生草本植物，二倍體（2n=12）雌雄異株，栽培歷史悠久，抗寒性強(qiáng)，適應(yīng)性廣，復(fù)種指數(shù)高，經(jīng)濟(jì)效益好，在我國(guó)南北各地廣泛種植，是秋、冬、春三季重要的綠葉蔬菜之一（錢偉 等，2014）。菠菜霜霉病是一種主要為害葉部的真菌性病害，是菠菜生產(chǎn)上為害嚴(yán)重的常發(fā)性病害，不僅嚴(yán)重影響菠菜產(chǎn)量，而且直接影響菠菜的商品品質(zhì)和食用品質(zhì)（李金堂 等，2013）。

在自然界中，植物生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中易受到多種病原微生物的侵害，為抵抗這些病原微生物的侵襲，植物體內(nèi)會(huì)形成不同的抗病機(jī)制，其中之一便是抗病基因（R基因）介導(dǎo)的防御反應(yīng)（劉登全 等，2016），病原菌中能夠引起特定R蛋白介導(dǎo)響應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)是無(wú)毒因子（Avr），特異的R蛋白識(shí)別無(wú)毒因子后便可觸發(fā)免疫反應(yīng)（Soosaar et al.，2005）。據(jù)報(bào)道，R基因?qū)?xì)菌、病毒、真菌、卵菌甚至線蟲和昆蟲病原體都有抗性，目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)克隆了約70個(gè)植物R基因，氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)R基因的蛋白結(jié)構(gòu)極其保守，其中最大的一類R基因?yàn)镹BS-LRR類抗病基因，它由高度保守的核苷酸結(jié)合位點(diǎn)（Nucletide-binding site，NBS）和富含亮氨酸重復(fù)域（Leucine rich repeat，LRR）兩個(gè)主要部分組成，且含有P-loop、Kinase-2、Kinase-3和GLPL 4個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域（Dangl et al.，2001；丁國(guó)華，2004；Harris et al.，2013）。目前菠菜中抗病基因的報(bào)道較少，F(xiàn)eng等（2015）構(gòu)建了1個(gè)菠菜BCA文庫(kù)并鑒定出14個(gè)抗病相關(guān)基因，其中有9個(gè)抗病基因同源序列（resistance gene analogs，RGAs）編碼NBS-LRR結(jié)構(gòu)。與菠菜同科的甜菜中已報(bào)道了大量的NBS-LRR類抗病基因，Hunger等（2003）利用簡(jiǎn)并引物從甜菜基因組、甜菜葉和根cDNA以及EST序列中總共得到47個(gè)R相關(guān)基因，其中有21個(gè)RGAs屬于NSBLRR類基因；Tian等（2004）同樣根據(jù)保守域NBS-LRR設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物從甜菜基因組中克隆出12個(gè)NBS-LRR類抗病基因；Dohm等（2014）通過(guò)對(duì)甜菜轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)的分析，共預(yù)測(cè)出715個(gè)RGAs，其中僅含有33個(gè)NBS-LRR類抗病基因，占總基因數(shù)的12.1%。在其他植物基因組中也存在大量的NBS-LRR類抗病基因，Meyers等（2003）研究發(fā)現(xiàn)擬南芥基因組序列中包含149個(gè)NBS-LRR類抗病基因和58個(gè)缺少LRRs的相關(guān)基因；Huang等（2009）通過(guò)對(duì)黃瓜的基因組測(cè)序，大量黃瓜R基因也被鑒定出來(lái)，共發(fā)現(xiàn)61個(gè)含有NBS結(jié)構(gòu)的抗性基因且3/4的基因以11個(gè)簇分布在黃瓜染色體基因組上；此外，在水稻中也發(fā)現(xiàn)了600個(gè)NBSLRR類抗病基因，占總基因數(shù)（40 000個(gè)）的1.5%（Azhar et al.，2011）。根據(jù)NBS-LRR類抗病基因廣泛存在于植物基因組中且具有高度保守結(jié)構(gòu)域這一特點(diǎn)，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，進(jìn)行同源序列的擴(kuò)增，成為克隆該類抗病基因的有效途徑，目前這種方法已在辣椒（趙敬 等，2012）、小麥（謝歡 等，2016）、大豆（丁海 等，2003）、水稻（鄭先武 等，2001）、甜瓜（Zhao & Li，2004）等多種植物中廣泛應(yīng)用。

菠菜霜霉病是菠菜生產(chǎn)中最主要的病害之一，目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)菠菜抗霜霉病基因克隆的報(bào)道較少。本試驗(yàn)依據(jù)NBS-LRR類抗病基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，對(duì)不同菠菜材料的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得一定數(shù)量的RGAs；并對(duì)獲得的RGAs進(jìn)行序列分析和鑒定，旨在為進(jìn)一步研究菠菜抗霜霉病基因、培育抗病品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為菠菜商業(yè)雜交種RZ51-147〔抗菠菜霜霉病生理小種1～8，瑞克斯旺（中國(guó)）種子有限公司〕，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所菠菜課題組選育的菠菜自交系12S3和12S4。3份材料均于2016年春在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所廊坊基地種植。

PCR相關(guān)試劑購(gòu)于北京天根生化科技有限公司，pEASY-T1載體試劑盒和大腸桿菌（E．coli）菌株DH5α購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)已克隆的植物抗霜霉病基因PI8、RPP1、RPP4、RGC2、RPP8等（http：//prgdb.crg.eu/old.php）的NBS-LRR保守區(qū)域P-loop和GLPL的核苷酸序列特征，運(yùn)用Primer 5軟件和Codehop（Rose et al.，1998，2003）設(shè)計(jì)2對(duì)簡(jiǎn)并引物，引物序列見表1，并交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 用于擴(kuò)增菠菜中RGAs的簡(jiǎn)并引物

1.2.2 DNA的提取 5月3日、幼苗5～6葉期，各材料分別取幼嫩葉片2～3片，采用CTAB法（Doyle，1987）提取基因組DNA，通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量。

1.2.3 NBS-LRR序列的PCR擴(kuò)增 以提取的菠菜基因組DNA為模板，分別采用上述2對(duì)簡(jiǎn)并引物Ploop-1/GLPL-1和Ploop-2/GLPL-2進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：10×HIFI bufferⅠ3.2 μL， dNTP（2.5 mmol·L-1）1.6 μL，HIFI酶 0.2 μL，引 物（10 pmol·L-1）各1 μL，DNA模板（100 ng· μL-1）3 μL，加ddH2O補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃補(bǔ)平10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像分析系統(tǒng)上進(jìn)行拍照分析。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的回收與克隆 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，按照普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒的使用說(shuō)明書進(jìn)行操作。將回收的片段連接到pEASY-T1載體上，接著轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，而后均勻涂布于含有Kan/ IPTG/X-gal的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取白斑，利用M13引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)T1載體中是否成功插入目的片段，最后將含有目的片段的菌液送上海美吉生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 序列分析、比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將測(cè)序結(jié)果用NCBI上的Vecscreen程序去除pEASY-T1載體，獲得插入片段的核苷酸序列。然后利用NCBI中BLAST工具與GenBank中登記的序列進(jìn)行同源性比較，并利用ORF Finder搜索開放閱讀框；采用MEGA軟件進(jìn)行氨基酸同源性分析、序列比對(duì)并和已知NBS-LRR類抗病基因相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列一起構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。用于氨基酸序列參比的NBS-LRR類抗病基因有：擬南芥抗霜霉病基因RPP1、RPP4、RPP5、RPP8、RPP13，萵苣抗霜霉病基因RGC2B，向日葵抗霜霉病基因PI8，葡萄抗霜霉病基因MrRPV1，亞麻抗銹病基因M、L6，小麥抗葉銹病基因Lr1、Lr10，其中RPP1、RPP4、RPP5、MrRPV1、M、L6基因?qū)儆赥IR-NBS-LRR類抗病基因，而RPP8、RPP13、RGC2B、PI8、Lr1和Lr10基因?qū)儆趎on-TIR-NBS-LRR類抗病基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠菜RGAs的擴(kuò)增、克隆及序列測(cè)定

利用2對(duì)簡(jiǎn)并引物Ploop-1/GLPL-1和Ploop-2/ GLPL-2對(duì)菠菜材料RZ51-147、12S3、12S4的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得6條500 bp左右的片段（圖1），這些片段的大小與已知NBS-LRR類抗病基因中P-loop與GLPL區(qū)域之間的距離相一致。目的片段經(jīng)回收、克隆后得到大量的白斑重組子，從每份材料中隨機(jī)挑選60個(gè)重組子進(jìn)行PCR檢測(cè)，共獲得130個(gè)陽(yáng)性重組子，每份材料挑取40個(gè)陽(yáng)性重組子進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果比對(duì)顯示參試材料具有較高比例的重復(fù)序列，3份菠菜材料RZ51-147、12S3、12S4中雷同重組子的比例分別為57.5%、54.5%、42.1%。將重復(fù)序列合并整理后得到27條序列，初步確認(rèn)為RGAs；進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)27條RGAs中只有23條具有連續(xù)的開放閱讀框和NBS功能結(jié)構(gòu)域（表2），編號(hào)為SP1～SP17、SP19～SP24，GenBank登錄號(hào)為KX914865～KX914887；其余4條序列中2條在閱讀框內(nèi)存在終止密碼子，推測(cè)可能為無(wú)功能基因，編號(hào)為SP18和SP25，另外2條有開放的閱讀框但無(wú)NBS功能結(jié)構(gòu)域，編號(hào)為SP26和SP27。上述結(jié)果表明，利用簡(jiǎn)并引物對(duì)菠菜基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增是一種獲得RGAs的有效途徑。

圖1 菠菜NBS-LRR類抗病基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

表2 3份菠菜材料中擴(kuò)增出23條抗病基因同源序列（RGAs）

2.2 菠菜RGAs氨基酸保守結(jié)構(gòu)域分析

前人研究報(bào)道，NBS-LRR類抗病基因包括4個(gè)保守區(qū)域，依次為P-loop（GMGGVGKTT）、Kinase-2（VVLDDVW）、Kinase-3（GSR/ KILVTTR） 和 GLPL（GLPLALV）（Williamson，1999；丁國(guó)華，2004）。通過(guò)ORF Finder軟件分析，本試驗(yàn)獲得的23條RGAs結(jié)構(gòu)域相當(dāng)保守，除SP20沒有P-loop保守結(jié)構(gòu)域外，剩余序列均具有NBS-LRR保守結(jié)構(gòu)域（圖2）；少數(shù)序列保守結(jié)構(gòu)域中發(fā)生氨基酸突變，如序列SP12和SP13的GLPL結(jié)構(gòu)域由GLPLALV分別變?yōu)镚PTFSSR和GTSTSSR。上述結(jié)果表明，本試驗(yàn)獲得的23條序列均為NBS-LRR類RGAs。

圖2 菠菜RGAs氨基酸序列NBS-LRR區(qū)域多重比較結(jié)果

在 SpinachDB網(wǎng) 站 中（http：//222.73.98.124/ spinachdb/）運(yùn)用Blastn程序?qū)@23條RGAs進(jìn)行同源搜索，結(jié)果顯示除SP7、SP14和SP15外，其余RGAs都可以錨定在相應(yīng)的菠菜scaffold上。這些RGAs位于scaffold2266、scaffold8025、scaffold52304以及scaffold13200這4條scaffold上。其 中SP1、SP2、SP5、SP6、SP10、SP11、SP12、SP13位 于 scaffold2266上 33 000～33 530區(qū) 間內(nèi)；SP3、SP4、SP8、SP9、SP24位于scaffold8025上 17 937～18 458區(qū) 間 內(nèi)；SP16、SP17、SP19位 于 scaffold52304上 33 536～34 077區(qū) 間 內(nèi)；SP20、SP21、SP22、SP23位 于 scaffold13200上11 378～11 957區(qū)間內(nèi)。以上結(jié)果表明，菠菜NBS-LRR類抗病基因成簇出現(xiàn)，可能大量存在于 scaffold2266、scaffold8025、scaffold52304以 及scaffold13200這4條scaffold上。

研究表明，按N-端的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可以把NBSLRR類抗病基因細(xì)分為TIR-NBS-LRR和non-TIRNBS-LRR兩大類。保守結(jié)構(gòu)域Kinase-2末端的氨基酸是區(qū)分這兩類抗病基因的重要特征之一，若Kinase-2區(qū)域末端氨基酸為天冬氨酸（D），則是TIR-NBS-LRR類抗病基因；若Kinase-2區(qū)域末端氨基酸為色氨酸（W），則是non-TIR-NBSLRR類抗病基因（Meyers et al.，1999，2003）。從圖2可以看出，除SP7外，其余RGAs氨基酸序列中Kinase-2區(qū)域域末端的氨基酸均為色氨酸（W），表明菠菜RGAs主要屬于non-TIR-NBS-LRR類型。

2.3 菠菜RGAs核苷酸序列同源性分析

通過(guò)NCBI Blastn程序?qū)Λ@得的23條RGAs序列進(jìn)行同源搜索，除SP20、SP21、SP22、SP23序列在GenBank中沒有找到同源序列外，其余19條RGAs序列均匹配到與之具有高同源性的序列（表3）。這些基因序列大多來(lái)自與菠菜同科的甜菜，還有1個(gè)來(lái)自辣椒；大部分為假定的抗病蛋白，少部分為功能未知的蛋白。這19條RGAs序 列 中，SP1、SP2、SP5、SP6、SP10、SP11、SP12以及SP13之間核苷酸序列相似性高達(dá)95.81%～99.01%，且這8條序列均與甜菜RF45類（LOC104888057）抗病蛋白有著86%以上的同源性；SP3、SP4、SP8、SP9和SP24之間核苷酸序列相似性為96.39%～99.62%，這5條序列與甜菜RPP13類（LOC104902631）抗病蛋白的同源性在85%以上。

2.4 菠菜RGAs氨基酸序列聚類分析

應(yīng)用MEGA軟件將獲得的23條RGAs氨基酸序列與亞麻M、L6、擬南芥RPP1、RPP4、RPP5、RPP8、RPP13、萵苣RGC2B、向日葵PI8、葡萄MrRPV1以及小麥Lr1、Lr10基因的相應(yīng)區(qū)域氨基酸序列進(jìn)行相似性比較。結(jié)果顯示（圖3），供試序列共聚成兩大類，SP7與亞麻M、L6、葡萄MrRPV1和擬南芥RPP1、RPP4、RPP5基因聚成一大類，為TIR-NBS-LRR類抗病基因，SP7與葡萄抗霜霉病基因MrRPV1相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列相似性為41.44%；其余22條RGAs與擬南芥RPP8、RPP13、萵苣RGC2B、小麥Lr1、Lr10以及向日葵PI8基因聚成另一大類，為non-TIR-NBS-LRR類抗病基因，這與前面推導(dǎo)的氨基酸序列比較結(jié)果是一致的。其中non-TIR-NBS-LRR類型又可細(xì)分為5小類，SP1、SP2、SP5、SP6、SP10、SP11、SP12、SP13聚為一類（Ⅰ類），它們的氨基酸序列相似性高達(dá)98.83%，推測(cè)它們屬于同一基因簇；SP20、SP21、SP22、SP23、RPP8聚為一類（Ⅳ類），其中菠菜RGAs氨基酸序列的相似性高達(dá)99.12%，推測(cè)它們處于同一基因簇，并且與擬南芥RPP8的相似 性 為27.27%～29.21%；SP3、SP4、SP8、SP9、SP24與PI8、RGC2B和Lr1聚為一類（Ⅴ類），這

5條菠菜RGAs氨基酸序列相似性為99.08%，且與向日葵抗霜霉病基因PI8相應(yīng)區(qū)域氨基酸相似性為32.20%～33.52%，故推測(cè)這5條RGAs同樣屬于同一基因簇；菠菜23條RGAs大部分都聚在這3類中。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類沒有已知的抗病基因與其聚在一起，可能是用于聚類的抗病基因較少，也可能是它們屬于新的抗病基因類型。

表3 GenBank中與菠菜RGAs具有高同源性的基因序列

圖3 菠菜RGAs氨基酸序列聚類分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

目前關(guān)于菠菜抗病基因克隆的報(bào)道僅有一例（Feng et al.，2015），本試驗(yàn)依據(jù)NBS-LRR類抗病基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)2對(duì)簡(jiǎn)并引物Ploop-1/ GLPL-1和Ploop-2/GLPL-2，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序等步驟，從菠菜中分離出23條抗病基因同源序列（RGAs），除SP20沒有P-loop保守結(jié)構(gòu)域外，其余RGAs序列均含有NBS-LRR類抗病基因的4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（P-loop、Kinase-2、Kinase-3和GLPL）。聚類分析結(jié)果表明，除SP7外，其余RGAs可分為5類，每一類中的RGAs彼此之間氨基酸相似性較高，如第Ⅰ類RGAs間氨基酸相似性高達(dá)98%以上，第Ⅴ類RGAs間氨基酸相似性高達(dá)99%。產(chǎn)生這樣的原因主要有：① 每一類菠菜RGAs在核苷酸水平上雖有差異，但是由于密碼子的簡(jiǎn)并性，不同的核苷酸序列翻譯成氨基酸后這種差異變的更??；② 可能是測(cè)序誤差引起的，使得同一序列測(cè)序后獲得不同的重組子。

應(yīng)用Blastn工具在GenBank中搜索，發(fā)現(xiàn)這23條RGAs序列主要與甜菜中的一些抗病蛋白或其他相關(guān)蛋白有較高的同源性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SP3、SP4、SP8、SP9、SP24這5條RGAs氨基酸序列之間有著99%以上的相似性，它們與向日葵抗霜霉病基因PI8相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列相似性為32.20%～33.52%，且在進(jìn)化樹上聚為一類，推測(cè)這5條RGAs序列位于菠菜中類PI8抗病基因的基因簇上；SP1、SP2、SP5、SP6、SP10、SP11、SP12和SP13氨基酸序列之間的相似性在98%以上，且這些RGAs的核苷酸序列與甜菜RF45類抗病蛋白基因有著86%以上的同源性，推測(cè)它們屬于同一基因簇并在菠菜中編碼RF45類抗病蛋白；此外，SP20、SP21、SP22和SP23序列在GenBank中沒有找到與之相匹配的核苷酸序列，但在進(jìn)化樹上與擬南芥抗霜霉病基因RPP8聚在一起，推測(cè)這4條序列成簇的存在于菠菜基因組中且結(jié)構(gòu)類似RPP8基因。這些研究結(jié)果為菠菜抗病基因的分離和克隆提供了條件，同時(shí)也說(shuō)明利用簡(jiǎn)并引物對(duì)菠菜基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增獲得RGAs是一種可行的途徑。

NBS-LRR類抗病基因是植物R基因中最大的一類，這類基因根據(jù)N-端的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可以細(xì)分為兩類：一類是果蠅Toll蛋白和哺乳動(dòng)物白細(xì)胞介素-1受體同源域（TIR-NBS-LRR或TNL蛋白），在雙子葉植物中發(fā)現(xiàn)，如煙草的N基因、亞麻的M和L6基因等；另一類是N端卷曲螺旋域（CCNBS-LRR或CNL蛋白 ）， 也 稱non-TIR-NBSLRR，在單子葉、雙子葉植物中均有發(fā)現(xiàn)，如單子葉植物小麥的Lr1、Lr10基因以及雙子葉植物擬南芥的RPP13、RPP8基因等。此外，根據(jù)Kinase-2區(qū)域末端氨基酸也可以區(qū)分這兩類抗病基因，當(dāng)該氨基酸是色氨酸（W）時(shí)為CNL類抗病基因；是天冬氨酸（D）時(shí)為TNL類抗病基因（Meyers et al.，1999）。菠菜屬于黎科菠菜屬雙子葉植物，通過(guò)對(duì)菠菜23條RGAs序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，SP7氨基酸序列的Kinase-2區(qū)域最后一個(gè)氨基酸為天冬氨酸（D），且在進(jìn)化樹上與TIR類的亞麻M、L6和葡萄MrRPV1基因聚在一起，判斷其為TIR-NBSLRR類抗病基因；其余22條RGAs的Kinase-2區(qū)域末端氨基酸為色氨酸（W），且在進(jìn)化樹上與non-TIR類的抗病基因聚在一起，故判斷其為non-TIR-NBS-LRR類抗病基因。兩種分析結(jié)果是一致的。由于此前菠菜R基因的報(bào)道較少，且本試驗(yàn)所獲RGAs片段多數(shù)沒有與已知R基因聚為一類，且含有NBS結(jié)構(gòu)的RGAs并不全部和抗病相關(guān)，因此，菠菜RGAs的類型、功能以及與抗病基因的關(guān)系等問題仍有待于進(jìn)一步研究。

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Cloning and Analysis of NBS-LRR Type Disease-resistant Gene Analogs in Spinach oleracea L.

SHE Hong-bing1，F(xiàn)AN Gui-yan1，ZHANG He-long2，WANG Xiao-wu1，WU Jian1，QIAN Wei2*，XU Zhao-sheng2*

（1InstituteofVegetablesandFlowers，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Beijing100081，China；2China VegetableSeedTechnologyCo.，Ltd.，Beijing100081，China）

In order to understand better the resistant mechanism of spinach（Spinach oleraceaL.）downy mildew and lay foundation for further clone of spinach downy mildew resistance genes and marker-assistedselection of resistance breeding，2 pares of degenerate primers were designed from the conserved motifs of NBSLRR type plant resistance gene．There are 3 types of spinach material-commercial hybrid‘RZ51-147’，inbred line‘12S3’and‘12S4’．Two pares of primers were used for amplifying the disease-resistant gene analogs（RGAs）by polymerase chain reaction（PCR）from the genomic DNA of these 3 material．After cloning and sequencing the PCR products，23 resistance gene analogs with uninterrupted open reading frames（ORFs）and conserveddomains of NBS were obtained from spinach，and deposited in GenBank with the accession number of KX914865-KX914887．Homology research showed that most of these 23 RGAs shared high homology with some putative disease-resistant genes or the other relative protein genes in Beta vulqaris．For example，the nucleotides of SP1，SP2，SP5，SP6，SP10，SP11，SP12，SP13 were over 86% identical to disease resistance protein RF45 from sugar beet，and the nucleotides of SP3，SP4，SP8，SP9，SP24 were over 85% identical to sugar beet disease resistance RPP13 protein．In addition，these 5 RGAs shared 32.20%-33.52% amino acid sequence homology with sunflower downy mildew resistance genePI8，and clustered a group withPI8gene in phylogenetic tree，suggesting that these 5 RGAs might be related to downy mildew gene．Homologous evolution analysis demonstrated that all of RGAs were ranked into non-TIR-NBS-LRR typeRgene except SP7，which was consistent with the result based on multiple alignment of deduced amino acid sequences．

Spinacia oleraceaL.；Resistance gene analogs；Nucleotide binding site-leucine rich repeat（NBS-LRR）；Spinach downy mildew

折紅兵，男，碩士研究生，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：13051127571@163.com

*通訊作者（Corresponding authors）：徐兆生，研究員，碩士生導(dǎo)師，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：xuzhaosheng@caas.cn；錢偉，副研究員，專業(yè)方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：qianwei@caas.cn

2017-01-07；接受日期：2017-04-10

國(guó)家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2012BAD02B04，2014BAD01B08），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31401872），中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CAAS-ASTIP-IVFCAAS），農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目