劉志科，張秋雨，陳創(chuàng)夫

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

豬鏈球菌病原的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

劉志科1，張秋雨2，陳創(chuàng)夫1

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

試驗(yàn)對(duì)河南某豬場(chǎng)的病豬通過(guò)臨床觀察及剖檢病變初步懷疑為鏈球菌病。無(wú)菌采集病料送到實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化試驗(yàn)鑒定、革蘭氏染色和動(dòng)物致病性試驗(yàn)，以及根據(jù)豬鏈球菌的cps1基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)有擴(kuò)增目的條帶，確診為該病。并對(duì)分離出的豬鏈球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明該菌對(duì)泰樂(lè)菌素、丁胺卡那、環(huán)丙沙星和頭孢氨芐唑啉鈉為高度敏感；對(duì)青霉素、強(qiáng)力霉素和卡那霉素等抗生素藥物為中度敏感；對(duì)磺胺二甲氧嘧啶、磺胺六甲氧嘧啶有明顯的耐藥性，由此可見試驗(yàn)分離的豬鏈球菌野毒株對(duì)不同藥物的敏感性存在著一定差異。該研究對(duì)養(yǎng)殖戶和獸醫(yī)工作者在診斷和預(yù)防豬鏈球菌病方面奠定了基礎(chǔ)。

豬鏈球菌；分離鑒定；PCR；藥敏試驗(yàn)

豬鏈球菌?。⊿.suis）是由鏈球菌引起豬的一種急性、敗血癥型和腦膜炎型的人畜共患傳染病[1]?，F(xiàn)公認(rèn)的血清型有35個(gè)，其分部有地域性，本病流行無(wú)明顯季節(jié)性，但潮濕悶熱的天氣多發(fā)。

近幾年隨著集約化、規(guī)模化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，飼養(yǎng)密度的增加，常常導(dǎo)致豬鏈球菌病與豬瘟和豬圓環(huán)病毒病相混淆，應(yīng)根據(jù)不同病的典型癥狀，結(jié)合分子生物學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行區(qū)分[2-6]。及早診斷，一旦發(fā)生本病往往給養(yǎng)殖戶造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。而該病的血清型比較復(fù)雜，根據(jù)臨床癥狀和剖檢變化很難做出診斷，而PCR方法可以直接檢測(cè)疑似病豬的分離菌落，此方法比較準(zhǔn)確、快速，但必須在一定的試驗(yàn)條件下才能完成[7]。豬鏈球菌病的病原中2型最為常見，報(bào)道也比較多，致病力最強(qiáng)，死亡率高，致病性主要為敗血癥和豬腦膜炎，病豬常突然死亡；人也可以感染致死。為了更好控制本病的發(fā)生，我們對(duì)某豬場(chǎng)疑似豬鏈球菌病進(jìn)行了分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，以期為養(yǎng)豬場(chǎng)的疾病診斷和病原的凈化提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)病料 2016年10月9日，在河南省新鄉(xiāng)市輝縣某大型種豬場(chǎng)發(fā)現(xiàn)15頭疑似豬鏈球菌病的典型癥狀豬15頭，其中1頭已經(jīng)死亡。病豬解剖后，按照無(wú)菌操作條件取患病豬的關(guān)節(jié)液、肺臟、心臟、腦及淋巴結(jié)等臟器組織。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 M－肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、鮮血培養(yǎng)基以及其他生化培養(yǎng)基均購(gòu)于青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司；犢牛血清購(gòu)于蘭州生物制品研究所；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，2×ES Taq MasterMix均購(gòu)自天根生化科技有限公司；豬鏈球菌生化鑒定試劑和藥敏片均購(gòu)于保吉安集團(tuán)公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank已公布的豬鏈球cps1基因（登錄號(hào)為NC：8877931.2）的高度保守核苷酸序列，利用Preimer 5.0軟件，設(shè)計(jì)特異性引物1對(duì)（表1），引物由上海Sangon Biotech公司合成。上游引物序列為：5'－CATGGCCAGGGCCGTGGT GG－3'；下游引物序列為：5'－CGCCGCCGCGCCGATCA AAC－3'。并用DNAMAN軟件進(jìn)行基因同源性分析。

表1 本試驗(yàn)核酸擴(kuò)增所用引物信息

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種雌性小白鼠10只，均由華蘭生物工程股份有限公司試驗(yàn)動(dòng)物中心無(wú)償饋贈(zèng)。隔離飼養(yǎng)觀察7 d后，根據(jù)試驗(yàn)要求進(jìn)行分類，做動(dòng)物接種試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 樣本處理 對(duì)無(wú)菌采取的病料，依據(jù)豬的不同臨床癥狀和剖檢變化，采取相應(yīng)的診斷方法，將處理過(guò)的組織和液體直接涂到載玻片上，并用生理鹽水稀釋，進(jìn)行革蘭氏染色，無(wú)菌采集急性死亡的病豬心血、肝、肺、脾及腸系膜淋巴結(jié)等組織，制作肝臟、脾臟的抹片，用關(guān)節(jié)液、心血涂片，干燥、火焰固定后進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下檢查其形態(tài)特征，可以作出初步的鑒定。

1.2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 在超凈工作臺(tái)中，用接種環(huán)取肝、膿汁、脾及炎性分泌物等病料直接接種于鮮血瓊脂平板上，放于37℃培養(yǎng)箱里24～48 h后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，符合豬鏈球菌的形態(tài)和溶血特征后，再挑取典型菌落接種于瓊脂斜面培養(yǎng)基、血清肉湯培養(yǎng)基和普通肉湯培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)24～48 h[7－9]。

PPP是廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)設(shè)施、公用事業(yè)和自然資源開發(fā)等領(lǐng)域的項(xiàng)目融資模式，以合同方式確立，以利益共享、風(fēng)險(xiǎn)共擔(dān)為原則，通過(guò)公共部門（政府）和私營(yíng)部門（企業(yè)）共同努力，提升公共產(chǎn)品或服務(wù)的效率，實(shí)現(xiàn)物有所值。

1.2.3 生化試驗(yàn) 將致病菌株在培養(yǎng)基里進(jìn)行純培養(yǎng)后，接種于葡萄糖、山梨醇、乳糖、蔗糖、水楊苷、甘露醇、菊糖、棉籽糖、明膠、40%膽汁、肉湯、0.1%美藍(lán)牛乳和馬尿酸鈉等生化培養(yǎng)基中。并將發(fā)酵管倒置于37℃溫箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間隨試驗(yàn)的要求及細(xì)菌分解能力而定，可按各類細(xì)菌鑒定方法所規(guī)定的時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)，觀察結(jié)果[8]。

1.2.4 常規(guī)PCR檢測(cè) 分別將invA的上、下游引物濃度稀釋為20 mol/μL，各取0.3 μL，以分離純化的豬鏈球菌用DNA提取試劑盒提取核酸，作為PCR的反應(yīng)模版，其反應(yīng)體系為20 μL：ddH2O 8.2 μL，上、下游引物cps1F、cps1R各0.4 μL，模板1 μL，2× ES Taq MasterMix 10 μL；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；94℃變性40 s，59℃退火30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸1 min 40 s。經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.5 動(dòng)物接種試驗(yàn) 取處理好的病料加入等量佐劑后，用一次性注射器吸?。?.5 mL/只）給小鼠腹腔注射；同時(shí)，對(duì)照組按照同樣的劑量注射生理鹽水，觀察其發(fā)病和死亡狀況[9－14]。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)美國(guó)臨床國(guó)家實(shí)驗(yàn)室委員會(huì)執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)（NCCLS）進(jìn)行，在超凈工作臺(tái)中，將分離到的豬鏈球菌純化培養(yǎng)后，接種到200 mL的M－肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h后，計(jì)算其細(xì)菌的CFU；取調(diào)整好的菌液濃度500 μL滴加到20 cm的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，用酒精燈滅菌后的“T”型玻璃棒均勻涂布平板[15]。待平板中的液體稍干并完全吸收后，選取常用的11種抗生素類藥物，無(wú)菌環(huán)境下，用消毒過(guò)的鑷子夾取藥敏片首先在貼于平板中央，之后用鑷子輕輕按一下，每張藥敏片間的距離不應(yīng)少于20 mm。距平皿邊緣不應(yīng)少于17 mm，貼完后用封口膜纏住，放到37℃培養(yǎng)箱，20～24 h后，根據(jù)說(shuō)明書上的要求進(jìn)行判斷，標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 抗菌類藥物的敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 臨床解剖檢查

病豬多突然死亡，臨床表現(xiàn)癥狀不明顯，精神不振，呈稽留熱，眼結(jié)膜潮紅，有膿性的血樣分泌物；耳尖、四肢、腹下出現(xiàn)紫紅色出血斑；頜下淋巴結(jié)、咽、耳下、頸部等部位出現(xiàn)腫脹、硬固、熱痛；部分仔豬有關(guān)節(jié)炎而出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)障礙，后肢不能站立；個(gè)別豬突然發(fā)病，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，死前有角弓反張的典型癥狀[16]。剖檢后肺臟有大面積的出血、水腫，并有局灶性壞死結(jié)節(jié)，呈敗血癥的特殊癥狀；心臟外膜出血嚴(yán)重，有腦脊液；淋巴結(jié)腫大嚴(yán)重，內(nèi)有深綠色黏稠的液體，關(guān)節(jié)腔內(nèi)有黃色黏稠膿汁。

2.2 分離培養(yǎng)和鑒定

在鮮血瓊脂平板上形成半透明、表面光滑濕潤(rùn)、稍微隆起的灰白色露滴樣的小菌落；在普通瓊脂平板上菌落貧瘠，較小，菌落周圍可見約1 mm透明溶血環(huán)，呈典型的b型溶血。在血清肉湯培養(yǎng)基中形成均勻渾濁，試管底部有明顯的沉淀，無(wú)菌膜。革蘭氏染色為陽(yáng)性球菌，有莢膜；在瓊脂培養(yǎng)基中呈短鏈的圓形排列，在溶菌培養(yǎng)基中呈長(zhǎng)鏈排列[17]。

不同的菌株理化特性存在著很大的差異，其結(jié)果見表3。

表3 分離株的疑似豬鏈球菌的生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果

2.4 試驗(yàn)分離株P(guān)CR鑒定結(jié)果

PCR產(chǎn)物跑2%瓊脂糖凝膠電泳顯示，可擴(kuò)增出1 157 bp大小的目的條帶，其擴(kuò)增大小與預(yù)期的片段相同，而陰性對(duì)照沒(méi)有擴(kuò)增條帶。結(jié)果證明分離菌株為豬鏈球菌（圖1）。

圖1 疑似豬鏈球菌不同部位的病料和陰性樣品PCR電泳

2.5 動(dòng)物試驗(yàn)

免疫后5只小鼠分別呈現(xiàn)出了不同的癥狀，其中2只在接種后的2～3 d死亡；其余3只表現(xiàn)為呼吸困難、精神沉郁、頸部淋巴結(jié)腫脹、化膿。剖檢見其肝、脾、腎腫大，膀胱充盈，胸腔內(nèi)有滲出液，心外膜有出血點(diǎn)，用死亡后的小鼠脾臟，進(jìn)行研磨并用生理鹽水進(jìn)行稀釋，革蘭氏染色為陽(yáng)性，發(fā)現(xiàn)有大量單個(gè)、成對(duì)或呈短鏈狀排列的陽(yáng)性球菌。另外5只對(duì)照組沒(méi)有任何的發(fā)病癥狀。

2.6 藥敏試驗(yàn)

分離出的菌株致病性鏈球菌對(duì)11種抗菌藥物敏感性情況見表4。

表4 致病性豬鏈球菌對(duì)11種抗生素藥物的敏感性比較

由表4可得出這樣的結(jié)果，所有抗生素中，致病性鏈球菌對(duì)泰樂(lè)菌素、丁胺卡那、頭孢氨芐唑啉鈉和環(huán)丙沙星高度敏感；對(duì)磺胺二甲氧嘧啶、磺胺六甲氧嘧啶有一定的耐藥性；對(duì)青霉素、卡那霉素、強(qiáng)力霉素等抗生素藥物為中度敏感。

3 結(jié)語(yǔ)與討論

本研究把疑似豬鏈球菌的病豬解剖后，分別取不同的臟器和腸道組織，進(jìn)行微生物學(xué)和PCR鑒定，根據(jù)分離菌株的形態(tài)染色特性、流行病學(xué)、剖檢特征等可以初步作出判斷，確診還需要進(jìn)行PCR鑒定和實(shí)驗(yàn)室診斷。藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，該場(chǎng)的豬鏈球菌對(duì)常用的抗菌藥物已經(jīng)出現(xiàn)了不同程度的耐藥性，而產(chǎn)生耐藥的主要原因是養(yǎng)豬生產(chǎn)上濫用抗菌藥物。尤其是一些家庭養(yǎng)殖戶，缺乏藥理知識(shí)，只要豬有病就用青霉素、卡那霉素、慶大霉素等，甚至盲目在飼料中添加抗生素藥物，使原來(lái)的極少數(shù)耐藥菌株得以大量生長(zhǎng)繁殖和傳代[18]。

近年的研究表明，磺胺類藥物的耐藥性機(jī)制主要有2個(gè)：一是染色體突變，在臨床上?？梢姷紻HFR結(jié)構(gòu)基因突變引起對(duì)磺胺類耐藥的菌株。二是質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥突變，獲得了編碼產(chǎn)生耐藥性DHPS的質(zhì)粒可導(dǎo)致對(duì)磺胺獲得性耐藥[12]。通過(guò)藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，本場(chǎng)豬鏈菌球?qū)前奉愃幬镉心退幮?。鏈球菌的致病力與莢膜、毒素和酶有關(guān)，該菌可產(chǎn)生許多毒素和酶，有溶血素、透明質(zhì)酸酶、蛋白酶、鏈激酶、DNA酶[19]。對(duì)于患病的豬，應(yīng)該早發(fā)現(xiàn)，早治療，并根據(jù)不同的病型而采取相應(yīng)的措施，特別是在用抗生素藥物進(jìn)行治療時(shí)，應(yīng)加大劑量或者聯(lián)合用藥，才能在一定時(shí)間內(nèi)控制本病的發(fā)生。

豬鏈球菌病極易產(chǎn)生耐藥性，建議采用藥敏試驗(yàn)篩選出高敏感藥物進(jìn)行治療，在一定程度上能迅速改善病情。當(dāng)然在實(shí)際臨床用藥中也應(yīng)考慮藥物的成本和體內(nèi)的吸收機(jī)理，綜合選擇最佳給藥途徑和方式[20]。另外，利用分離菌株制備組織苗是常規(guī)預(yù)防豬鏈球菌的一種切實(shí)可行的方法，保護(hù)率較高，免疫期長(zhǎng)[21]。本次試驗(yàn)分離到的豬鏈球菌野毒株對(duì)抗生素藥物耐藥性嚴(yán)重，加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)豬場(chǎng)的病原的分離與耐藥情況進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)和獸醫(yī)工作者在預(yù)防及臨床用藥方面提供了一個(gè)有針對(duì)性、可靠的理論依據(jù)。

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（編輯：郭玉翠）

全球醫(yī)療不當(dāng)問(wèn)題嚴(yán)重

【路透社倫敦1月9日電】研究人員說(shuō)，美國(guó)70%的子宮切除術(shù)、西班牙四分之一的膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)和中國(guó)一半以上的抗生素處方，都屬于不恰當(dāng)?shù)倪^(guò)度醫(yī)療。

在全球開展一系列研究的專家說(shuō)，各地都同時(shí)存在過(guò)度醫(yī)療和醫(yī)療不足的情況，從而導(dǎo)致了一些可以避免的傷害和痛苦，還浪費(fèi)了寶貴的資源。

這項(xiàng)由《柳葉刀》雜志和27位國(guó)際專家展開的研究還發(fā)現(xiàn)，剖腹產(chǎn)的比例在迅速增加—對(duì)一些女性來(lái)說(shuō)其實(shí)并不需要—而用類固醇來(lái)防止早產(chǎn)的簡(jiǎn)單做法卻落后了40年。

專家在一份聲明中說(shuō)：“不管是在富國(guó)還是窮國(guó)，一種常見的悲劇是使用昂貴且往往無(wú)效的技術(shù)，卻忽視了廉價(jià)有效的干預(yù)手段?！?/p>

世界衛(wèi)生組織估計(jì)，每年有620萬(wàn)例剖腹產(chǎn)是不必要的，其中50%發(fā)生在巴西和中國(guó)。

研究主要作者之一、美國(guó)波士頓勞恩研究所所長(zhǎng)維卡斯·薩伊尼說(shuō)，導(dǎo)致全球醫(yī)療不當(dāng)?shù)囊蛩赜小柏澙?、利益沖突和信息缺乏”。這就共同造就了“一個(gè)不良醫(yī)療的生態(tài)系統(tǒng)”。

參與研究的香農(nóng)·布朗利說(shuō)：“病人和公民需要了解醫(yī)療體系無(wú)法解決這兩個(gè)問(wèn)題所帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。在美國(guó)，我們浪費(fèi)了本該用于改善國(guó)民健康的數(shù)十億美元。”

研究分析了全球醫(yī)療過(guò)度和醫(yī)療不足的范圍、成因和后果，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)問(wèn)題可以發(fā)生在同一個(gè)國(guó)家、同一個(gè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)甚至同一個(gè)病人身上。

研究人員說(shuō)，中國(guó)的一項(xiàng)研究顯示，57%的病人接受了不恰當(dāng)?shù)目股刂委煟幻绹?guó)各州不恰當(dāng)?shù)淖訉m切除術(shù)比例在16%到70%之間；不恰當(dāng)?shù)南ドw置換術(shù)在西班牙和美國(guó)的比例分別是26%和34%。

他們還發(fā)現(xiàn)，不恰當(dāng)?shù)淖訉m切除術(shù)比例在臺(tái)灣地區(qū)是20%，瑞士是13%。

研究人員說(shuō)，醫(yī)療不足導(dǎo)致病人“容易遭受本可以避免的疾病和痛苦”；過(guò)度醫(yī)療則導(dǎo)致檢查和治療帶來(lái)的本可避免的傷害，同時(shí)還浪費(fèi)了原本可用在更需要的服務(wù)上的資源。

（轉(zhuǎn)自參考消息[N]，2017-01-10）

Isolation,Identification and Drug Sensitivity Test of Pathogenic Streptococcus Suis

LIU Zhike1,ZHANG Qiuyu2,CHEN Chuangfu1
(1.College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2.College of Animal Science and Technology,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

The experiment on a pig farm in Henan swine disease through clinical observation and pathologic examination for suspected streptococcal disease.Aseptic collected and sent to the laboratory for bacterial isolation,biochemical identification,Gram staining and animal pathogenicity test,and primers were designed according to cps1 gene of Streptococcus suis PCR reaction amplified bands,diagnosed with the disease.And the drug sensitivity test was performed on the isolated Streptococcus suis,the results showed that the strain of tylosin,amikacin,cefotaxime sodium and ammonia benzazoline ciprofloxac;penicillin,kanamycin,doxycycline, ampicillin,gentamicin and moderately sensitive;have a certain resistance to sulfonamides,two sulfamethoxydiazine sulfonamide six sulfamethoxydiazine.The study lays a foundation for diagnosis and prevention of Streptococcus suis disease farmers and veterinary workers.

Streptococcus suis;isolation and identification;PCR;drug sensitivity test

S858.285.1

A

1002-1957(2017)02-0105-04

2017-03-08

新疆重要人畜共患病分子疾病診斷機(jī)理研究（500003121002）作者簡(jiǎn)介：劉志科（1989-），男，河南新鄉(xiāng)人，在讀碩士研究生，主要從事人畜共患病研究工作.E-mail：624039729@qq.com

陳創(chuàng)夫（1962-），男，教授，博士生導(dǎo)師，博士，研究方向?yàn)榉肿硬±韺W(xué).E-mail：ccfxb@163.com