馬 赟,王起文,蔡 靜,張園嬌,紀(jì)樂軍,陳建偉,*,李 祥

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京 210023; 2.江蘇神華藥業(yè)有限公司,江蘇淮安 211600)

聚類分析和主成分分析法研究甜味絞股藍(lán)黃酮類成分HPLC指紋圖譜

馬 赟1,王起文1,蔡 靜1,張園嬌1,紀(jì)樂軍2,陳建偉1,*,李 祥1

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇南京 210023; 2.江蘇神華藥業(yè)有限公司,江蘇淮安 211600)

研究了12批5個不同產(chǎn)地的甜味絞股藍(lán)黃酮類成分HPLC指紋圖譜,并進(jìn)行聚類分析和主成分分析。采用Hedera ODS-2色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)以0.1%磷酸水溶液(A相)-乙腈(B相)為流動相,0.8 mL/min梯度洗脫,建立甜味絞股藍(lán)黃酮類成分HPLC指紋圖譜。結(jié)果表明不同產(chǎn)地批次的甜味絞股藍(lán)指紋圖譜相似度在0.977～0.996之間,共標(biāo)定14個共有峰,其中3號峰為蘆丁。利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行聚類分析和主成分分析,結(jié)果表明樣品產(chǎn)地可被聚為3大類,兩個主成分的累積方差貢獻(xiàn)為88.786%。將中藥指紋圖譜及聚類分析、主成分分析相結(jié)合,為甜味絞股藍(lán)的質(zhì)量評價及資源利用提供基礎(chǔ)。

甜味絞股藍(lán),黃酮類成分,HPLC指紋圖譜,蘆丁,聚類分析,主成分分析

絞股藍(lán)為葫蘆科植物絞股藍(lán)Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino的全草,主要分布于陜西、山西和長江以南各地[1],是一類“藥食同源”類植物資源,應(yīng)用日趨廣泛,如治療高脂血癥的絞股藍(lán)沖劑、抗腫瘤的1023合劑等[2-3],同時還可做成茶劑用于降脂減肥[4]。黃酮類成分是絞股藍(lán)的主要成分之一,具有抗氧化、清除氧自由基、改善心腦血管循環(huán)、擴張冠狀動脈血管、保護心肌細(xì)胞等作用[5-8]。

市售絞股藍(lán)口味差別較大,普遍將絞股藍(lán)按照口感差異分為甜味、苦味、淡味,其中甜味絞股藍(lán)由于其獨特的口感廣泛用于茶葉、保健品原料[9-10]。目前市場上銷售甜味絞股藍(lán)的產(chǎn)地來源較多,質(zhì)量參差不齊,難以保障相應(yīng)食品、藥品的質(zhì)量,故建立絞股藍(lán)質(zhì)量評價體系,以確保其應(yīng)用顯得極為迫切。近年來,HPLC指紋圖譜作為一種研究復(fù)雜物質(zhì)體系的技術(shù)手段,被廣泛應(yīng)用于質(zhì)量控制等方面,具有快速準(zhǔn)確的特點。雖有文獻(xiàn)[11-13]對絞股藍(lán)黃酮類成分HPLC指紋圖譜進(jìn)行了探索,但均未對絞股藍(lán)的口感進(jìn)行區(qū)分,也未對共有化學(xué)特征峰等進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,信息非常有限。為更全面地控制絞股藍(lán)的質(zhì)量,本實驗建立了以甜味絞股藍(lán)黃酮類成分為基礎(chǔ)的HPLC指紋圖譜,測定12個不同產(chǎn)地批號的甜味絞股藍(lán),以黃酮類成分指紋圖譜進(jìn)行對比分析,并結(jié)合聚類分析和主成分分析,對其模式進(jìn)行識別研究,為含甜味絞股藍(lán)類保健食品、藥品原料的優(yōu)選提供一定的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜味絞股藍(lán) 共12批次,樣品信息見表1,經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定為葫蘆科植物絞股藍(lán)Gynostemmapentaphyllum(Thunb.)Makino;蘆丁對照品 中國食品藥品檢定研究院,批號100080-201409;乙腈 色譜純,德國Merck公司;水 超純水;其他試劑 均為分析純。

2695型高效液相色譜儀 包括2489型PDA二極管陣列檢測器,Empower工作站,美國Waters公司;BT125D型電子天平 德國Sartorius公司;KQ-2200B超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司;超純水儀 美國Millipore公司;Allegra X-30R離心機 美國貝克曼公司。

表1 樣品信息Table 1 Information of sweet Gynostemma pentaphyllum samples

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備 取蘆丁適量,精密稱定,加甲醇溶解制成含蘆丁2.74 mg/mL的蘆丁對照品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 取絞股藍(lán)樣品粉末(過4號篩)約0.5 g,置于50 mL離心管中,加甲醇20 mL,超聲(500 W,40 kHz)處理1 h,離心(5000 r/m)10 min,取上清液轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻。用0.45 μm微孔濾膜過濾,即得[14]。

1.2.3 色譜條件 采用Hedera ODS-2(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱,流動相:0.1%磷酸水溶液(A相)-乙腈(B相),梯度洗脫(0～15 min,90%～85% A;15～25 min,85%～80% A;25～30 min,80%～70% A;30～40 min,70%～50% A;40～60 min,50%～0% A;60～80 min,0% A);體積流量:0.8 mL/min;檢測波長:370 nm;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 精密度實驗 取同一供試品溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,所得譜圖采用指紋圖譜軟件的相似度系統(tǒng)分析。

1.2.4.2 穩(wěn)定性實驗 取同一供試品溶液,分別在0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣,每次進(jìn)樣定量為10 μL,所得譜圖采用指紋圖譜軟件的相似度系統(tǒng)分析。

1.2.4.3 重復(fù)性實驗 取同一供試品,平行制備6份并檢測,所得譜圖采用指紋圖譜軟件的相似度系統(tǒng)分析。

1.2.5 甜味絞股藍(lán)黃酮類成分的測定 分別將蘆丁對照品溶液和各批次供試品溶液注入高效液相色譜儀中,在“1.2.3”項色譜條件下進(jìn)行測定,記錄色譜圖。

1.3 指紋圖譜的建立與技術(shù)參數(shù)的設(shè)定

將甜味絞股藍(lán)的色譜數(shù)據(jù)以AIA(*cdf)格式導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004年A版),設(shè)定樣品參照圖譜,對色譜圖進(jìn)行多點校正,自動匹配,時間寬度為0.1 min,經(jīng)系統(tǒng)自動匹配,生成對照指紋圖譜R,并建立12批次甜味絞股藍(lán)黃酮類成分的指紋圖譜。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0軟件以不同產(chǎn)地批次甜味絞股藍(lán)的共有峰峰面積為原始數(shù)據(jù),采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié),以夾角余弦為樣品相似度的距離公式,進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。采用SPSS 22.0軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,以主成分的特征值及貢獻(xiàn)率為依據(jù),對不同產(chǎn)地批次甜味絞股藍(lán)的共有峰(變量)進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

精密度實驗所得譜圖相似度均≥0.999,穩(wěn)定性實驗所得譜圖相似度均≥0.999,重復(fù)性實驗所得譜圖相似度均≥0.992,表明儀器精密度較好,供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定,實驗方法重復(fù)性高,均符合指紋圖譜的要求。

2.2 甜味絞股藍(lán)黃酮類成分的HPLC指紋圖譜

通過進(jìn)樣蘆丁對照品溶液和各批次供試品溶液,結(jié)果顯示蘆丁在各產(chǎn)地樣品圖譜中均有出現(xiàn),蘆丁對照品溶液及其中一個批次甜味絞股藍(lán)供試品溶液(S2)的液相色譜圖見圖1,12批供試品色譜圖共有成分峰匹配結(jié)果及生成的對照指紋圖譜R見圖2。從圖2中可以看出12批次樣品的出峰數(shù)目、分離度均較理想。各共有峰較穩(wěn)定,具有指紋圖譜特征。

2.3 指紋圖譜共有峰的標(biāo)定

利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)的數(shù)據(jù)匹配功能,在對照指紋圖譜上共標(biāo)定14個共有指紋峰,見圖3。其中3號峰為蘆丁,且3號峰分離度良好,保留時間適宜,故選為參照峰。各產(chǎn)地批次甜味絞股藍(lán)的共有峰保留時間與峰面積見表2。由表2可看出,各產(chǎn)地批次甜味絞股藍(lán)的共有峰在同一保留時間處有不同的峰面積,可能受生長環(huán)境、種質(zhì)資源、經(jīng)緯度等各因素的影響,導(dǎo)致其質(zhì)量存在差異。

表2 共有峰的相對峰面積Table 2 Relative peak areas of common peaks

圖2 12批甜味絞股藍(lán)黃酮類成分匹配色譜圖Fig.2 The matched chromatograms of flavonoids in 12 batches of sweet Gynostemma pentaphyllum

圖3 對照指紋圖譜RFig.3 The reference fingerprint chromatogram of sweet Gynostemma pentaphyllum

2.4 相似度評價

采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng),計算12批絞股藍(lán)HPLC指紋圖譜的相似度,以生成的共有模式為對照,相似度在0.977～0.996之間,見表3,表明各產(chǎn)地甜味絞股藍(lán)均有良好的相似性。

由于相似度計算無法準(zhǔn)確鑒定甜味絞股藍(lán)的產(chǎn)地來源,同時考慮各共有峰之間的差異,本實驗再通過聚類分析和主成分進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2.5 聚類分析

不同產(chǎn)地甜味絞股藍(lán)的14個共有峰峰面積為原始數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析的結(jié)果見圖4。由圖4可知,絞股藍(lán)樣品被分為3大類,Ⅰ類包括S6、S7、S11、S4、S10;Ⅱ類包括S1、S2、S9、S3、S5、S12;Ⅲ類包括S8。

表3 12批甜味絞股藍(lán)HPLC指紋圖譜相似度評價Table 3 Evaluation of similarity degree of 12 batches of sweet Gynostemma pentaphyllum

圖4 聚類分析樹狀圖Fig.4 Dendrogram of cluster analysis

其中,廣西、湖北、江蘇產(chǎn)地的甜味絞股藍(lán)聚在一起,說明這3個產(chǎn)地甜味絞股藍(lán)生長環(huán)境相當(dāng),同時其指紋圖譜相似度接近。而且,它與相似度分析結(jié)果較為一致,得到了相互驗證。

2.6 主成分分析

12個不同產(chǎn)地批次甜味絞股藍(lán)的14個共有峰(變量)進(jìn)行主成分分析的結(jié)果見表4。利用主成分分析,得到了2個主成分,累計方差貢獻(xiàn)率為88.786%,說明這2個主成分可表達(dá)全部甜味絞股藍(lán)黃酮類成分的88.786%,只有11.214%的信息丟失。其中,第一主成分方差貢獻(xiàn)率最大,貢獻(xiàn)率為72.741%,是甜味絞股藍(lán)最重要的黃酮類成分群,它所包含的化學(xué)成分基本反映出各產(chǎn)地黃酮類成分之間的相似性。

旋轉(zhuǎn)后的公共因子載荷矩陣見表5,可知每個載荷量表示主成分與對應(yīng)變量的相關(guān)系數(shù)。2個主成分與14個共有峰指標(biāo)的線性組合模型如下,計算綜合得分。以第一、第二主成分為變量,得到二維投影圖,見圖5。以X軸為例,在投影圖中選取距離原點較遠(yuǎn)的幾個點,得到第一主成分中變量的權(quán)重值,權(quán)重值越大,該化合物在絞股藍(lán)中的作用越大。其中,前6名變量的權(quán)重值分別為0.943、0.942、0.879、0.865、0.815、0.803,對應(yīng)p9、p5、p1、p2、p4和p6號峰。從對照品色譜圖可知,此6個峰為未知成分,需結(jié)合質(zhì)譜等手段作進(jìn)一步確定。

表5 旋轉(zhuǎn)后的公共因子載荷矩陣表Table 5 Load matrixes of postrotational common factors

注:p為“peak”縮寫,代表色譜峰。

圖5 HPLC指紋圖譜的二維投影圖Fig.5 2D projection map of HPLC fingerprint

3 結(jié)論

建立全面、系統(tǒng)、特征性的指紋圖譜,是評價絞股藍(lán)質(zhì)量的有效辦法,本實驗建立12個不同產(chǎn)地批次甜味絞股藍(lán)黃酮類成分HPLC指紋圖譜,標(biāo)定14個共有峰,以共有模式為對照,進(jìn)行相似度評價,表明所含化學(xué)成分基本相同,但也存在一定的差異,而究其內(nèi)在原因,推測甜味絞股藍(lán)黃酮類成分的差異與產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境、采集加工方法等因素有關(guān)[15-16]。以此為數(shù)據(jù)基礎(chǔ),通過聚類分析和主成分分析,以甜味絞股藍(lán)產(chǎn)地為區(qū)分指標(biāo),可以有效評價甜味絞股藍(lán)的區(qū)域差異性,篩選出共有的特征成分,引導(dǎo)發(fā)現(xiàn)決定性作用的化學(xué)成分,從而為其質(zhì)量評價及資源利用提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

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HPLC fingerprint of flavonoids in sweetGynostemmapentaphyllum
by cluster analysis and principal component analysis

MA Yun1,WANG Qi-wen1,CAI Jing1,ZHANG Yuan-jiao1,JI Le-jun2,CHEN Jian-wei1,*,LI Xiang1

(1.College of Pharmacy,Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023,China; 2.Jiangsu Shenhua Pharmaceutical Co.,Ltd.,Huaian 211600,China)

To establish the HPLC fingerprint of flavonoids in 12 batches of sweetGynostemmapentaphyllumfrom five different growing areas and to make cluster analysis and principal component analysis.The analysis was performed on Hedera ODS-2 column,mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid aqueous solution with gradient elution,flow rate was 0.8 mL/min,column temperature was maintained at 30 ℃,and detection wavelength was set at 370 nm.Results showed that different origins fingerprints similarity were between 0.977 and 0.996.There were fourteen common peaks in the HPLC fingerprints,one of which was identified as Rutin.SweetGynostemmapentaphyllumwas identified with the models of principal component analysis and cluster analysis carried out by SPSS 22.0. The growing areas of samples can be classified into three groups,and two principal components make up 88.786% of the total variance.The Chinese materia medica fingerprint is combined with cluster analysis and principal component analysis to provide basis for the quality evaluation and resource utilization ofGynostemmapentaphyllum.

sweetGynostemmapentaphyllum;flavonoids;HPLC fingerprint;rutin;cluster analysis;principal component analysis

2016-09-26

馬赟(1987-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：中藥品質(zhì)評價，E-mail:myunok@163.com。

*通訊作者:陳建偉(1955-)，男，教授，主要從事中藥品質(zhì)評價與中藥生物技術(shù)方面的研究，E-mail:chenjw695@126.com。

江蘇省科技成果轉(zhuǎn)化項目(BA2014118)；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目(PAPD)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)08-0063-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.004