王彥平,宿 時,陳月英

(河南農業(yè)職業(yè)學院,河南鄭州 451450)

紫山藥多糖超聲結合酶法提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

王彥平,宿 時,陳月英*

(河南農業(yè)職業(yè)學院,河南鄭州 451450)

以紫山藥為實驗材料,采用超聲結合酶法提取多糖,用Sevag法脫蛋白,用活性炭除花青素,并對其進行體外抗氧化實驗,研究了紫山藥中多糖提純工藝和體外抗氧化活性。實驗結果表明,最佳工藝條件為加酶量1.5%、料液比1∶10 g/mL、提取時間25 min、超聲功率200 W。在上述最佳條件下,紫山藥多糖平均得率為9.83%。經脫蛋白、去除花青素后的紫山藥多糖粉末中多糖質量分數為58.9%。體外抗氧化實驗中,紫山藥多糖表現出明顯的抗氧化能力,對1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)的清除能力較維生素C弱,但對羥基自由基(·OH)的清除能力略強于維生素C。

紫山藥,多糖,超聲結合酶法提取,抗氧化性

紫山藥(Dioscoreaalata)又名參薯、腳板薯等,是我國重要的地方特色經濟作物,屬于藥食同源的綠色蔬菜。《本草綱目》記載其具有補脾胃、益腎氣,可治虛勞咳嗽、氣虛衰弱、遺精帶下等病癥?，F代研究認為,紫山藥富含黏性多糖、花青素、膽堿、尿囊素和薯蕷皂苷等多種功能成分[1-3],并在抗氧化、抗腫瘤、降血糖、增強免疫、調節(jié)血脂方面具有良好作用。

多糖是紫山藥的重要活性成分之一,具有提高機體免疫力[4]、清除體內自由基[5]、耐缺氧[6]等保健功能,具有良好的開發(fā)應用前景。多糖是由20個以上的醛糖或酮糖通過苷鍵連接而成的高分子多聚物,廣泛存在于生物細胞壁中[7]。提取多糖的傳統(tǒng)方法是熱水浸提法,但耗時長、溫度高、提取率低、多糖純度低;酶輔助提取法利用酶催化水解生物細胞壁,從而加快多糖釋放速度,具有條件溫和、提取率高、操作簡單等特點[8];超聲波輔助提取法利用超聲波的空化作用、機械作用和熱效應破壞生物細胞壁結構,加快多糖釋放速度,提取時間短、提取率高,但長時間作用會破壞多糖活性[9]。目前,紫山藥中多糖的提取方法[10]有熱水浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶提取法,但超聲結合酶法提取紫山藥多糖的方法尚未見報道。

自由基學說是目前公認的衰老學說之一,機體經過代謝會產生大量的自由基,自由基導致的氧化應激是導致多種慢性退化性疾病的重要因素。氧化應激可引起磷脂、蛋白質、DNA等生物大分子的氧化損傷,從而增加炎性病變、心血管疾病、腫瘤、糖尿病、阿爾茲海默癥、白內障、年齡相關的功能衰退的風險[11]。植物作為人體外源性抗氧化物質的最重要來源,其提取物的抗氧化研究開發(fā)日益受到人們的重視并取得了許多成果[12]。本文采用超聲結合酶法提取紫山藥多糖,對其提取工藝進行優(yōu)化,并用Sevag法對粗多糖進行脫蛋白,用活性炭去除花青素后得紫山藥多糖,并對紫山藥多糖的體外抗氧化能力進行研究,旨在為我國紫山藥資源的綜合開發(fā)利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫山藥 河南溫縣產完全成熟的紫山藥,置于60 ℃恒溫箱烘24 h,稱恒重、粉碎,過50目篩后,在二氧化硅干燥器內常溫保存?zhèn)溆?1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH) 純度99%，Sigma公司;纖維素酶 10000 u/g,索萊寶公司;乙醚、氯仿、正丁醇、苯酚、濃硫酸、醋酸、醋酸鈉、無水乙醇、葡萄糖、濃硫酸、鐵氰化鉀、雙氧水、三氯乙酸、三氯化鐵等 均為分析純,國藥集團。

BS224S分析天平 德國賽多利斯公司;UV power紫外可見光分光光度計 北京萊伯泰科儀器股份有限公司;HH-2數顯恒溫水浴鍋 上海喬躍電子科技有限公司;202-3AB電熱恒溫鼓風干燥箱 上海喬躍電子科技有限公司;PHS-3C精密pH計 上海雷磁儀器廠;RE2000旋轉蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;KBS-250型數控超聲波細胞粉碎機 昆山舒美超聲儀器有限公司;D5-R2離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制 使用葡萄糖作為標準物,采用苯酚-硫酸法[13],用紫外可見分光光度計在490 nm處測定其吸光度。以葡萄糖濃度(mg/mL)為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線,其線性回歸方程為:y=8.85x+0.012,R2=0.997。

1.2.2 紫山藥粉預處理 準確稱取紫山藥粉20 g置索氏抽提器中,用乙醚90 ℃回流脫脂,脫脂后的紫山藥粉中乙醚揮發(fā)完后,加入70%乙醇90 ℃回流提取,以去除單糖、多酚、低聚糖等小分子物質;將揮發(fā)完乙醇后紫山藥粉60 ℃恒溫箱干燥、恒重,得預處理紫山藥粉。

1.2.3 多糖的提取與純化 預處理紫山藥粉與水按一定比例混合,加醋酸鈉-醋酸緩沖液調節(jié)pH至5.0后,采用超聲結合酶法熱水浸提,將提取液離心(4000 r/min,15 min)后取上清液。采用Sevag法脫蛋白[14],取下面水層離心(4800 r/min,15 min)后取上清液,用活性炭除花青素,75%乙醇沉淀12 h[15]后,離心(4800 r/min,15 min)取沉淀,用水溶解紫山藥多糖,再用95%乙醇洗滌3次后,用無水乙醇洗滌沉淀多糖3次。用旋轉蒸發(fā)儀低溫減壓干燥得紫山藥多糖粉末。

多糖得率(%)=多糖質量(g)/紫山藥粉質量(g)×100

1.2.4 紫山藥多糖粉末中多糖質量分數測定 紫山藥多糖粉末在60 ℃下干燥至恒重,精確稱取紫山藥多糖粉末50 mg,用水定容至100 mL做多糖儲備液。取多糖儲備液1 mL,加水定容至10 mL,用分光光度計490 nm處測吸光度。根據1.2.1標準曲線方程計算多糖質量。

多糖質量分數(%)=多糖質量(g)/紫山藥多糖粉末質量(g)×100

1.2.5 單因素實驗 紫山藥多糖提取的單因素實驗,準確稱取紫山藥預處理粉5.0 g加入一定容積的蒸餾水中,加醋酸鈉-醋酸緩沖液調節(jié)pH至5.0,采用超聲結合酶法40 ℃浸提一定時間后,4000 r/min離心15 min后取上清液,定容至100 mL,然后測定吸光度。

1.2.5.1 加酶量對紫山藥粗多糖得率的影響 加酶量(紫山藥干重酶量)分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%,在料液比1∶20 g/mL、超聲時間30 min、超聲功率100 W條件下提取1次,考察加酶量對紫山藥粗多糖得率的影響。

1.2.5.2 料液比對紫山藥粗多糖得率的影響 料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL,在超聲時間30 min、超聲功率100 W、加酶量1%條件下提取1次,考察料液比對紫山藥粗多糖得率的影響。

1.2.5.3 超聲時間對紫山藥粗多糖得率的影響 超聲時間分別為5、10、15、20、25、30 min,在料液比1∶20 g/mL、超聲功率100 W、加酶量1%條件下提取1次,考察超聲時間對紫山藥粗多糖得率的影響。

1.2.5.4 超聲功率對紫山藥粗多糖得率的影響 超聲功率分別為50、100、150、200、250 W,在料液比1∶20 g/mL、超聲時間30 min、加酶量1%條件下提取1次,考察超聲功率對紫山藥粗多糖得率的影響。

1.2.5.5 提取次數對紫山藥粗多糖得率的影響 提取次數分別為1、2、3次,在料液比1∶20 g/mL、超聲時間30 min、超聲功率100 W、加酶量1%條件下提取,考察提取次數對紫山藥粗多糖得率的影響。

1.2.6 正交實驗 在單因素實驗基礎上,設計出4因素3水平L9(34)的正交實驗,見表1。超聲結合酶法熱水浸提紫山藥多糖混合液,4000 r/min離心15 min后取上清液得多糖粗提液,按照1.2.1的方法測定粗提液的吸光度,并計算粗多糖得率,以確定超聲結合酶法提取紫山藥多糖的最佳工藝條件。

表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.7 紫山藥多糖體外抗氧化活性的測定 按照正交實驗獲得的最佳工藝條件提取并按方法1.2.3純化后得紫山藥多糖粉末,按1.2.4測定多糖質量分數后,按照不同要求,配制不同濃度的紫山藥多糖水溶液,分別進行總還原能力的測定、DPPH·清除率的測定、·OH清除率的測定,體外抗氧化實驗參照文獻[16]的方法。

1.3 數據處理

使用Microsoft office excel 2007進行數據處理及圖標制作。

2 結果與分析

2.1 紫山藥多糖提取的單因素實驗

2.1.1 加酶量對紫山藥粗多糖得率的影響 由圖1可知,相同條件下,紫山藥中多糖得率隨著加酶量的增加而升高。當加酶量由0.5%增加到1.5%時,多糖得率不斷升高,當加酶量大于1.5%時,多糖得率趨于穩(wěn)定,表明一定量的纖維素酶已將紫山藥細胞壁酶解完全。故選擇加酶量為1.0%～2.0%做進一步優(yōu)化實驗。

圖1 加酶量對粗多糖得率的影響Fig.1 Effect of cellulose amount on polysaccharide yield

2.1.2 料液比對紫山藥粗多糖得率的影響 由圖2可知,相同條件下,紫山藥粗多糖得率隨著料液比的增大而升高。當料液比由1∶5 g/mL增加到1∶15 g/mL時,多糖提取得率不斷升高,當料液比大于1∶15 g/mL時,粗多糖得率呈下降趨勢。一定范圍內,提取劑劑量越大,多糖浸出率越高;但當提取劑過多時由于可影響超聲的空化效應和機械振動的效果,多糖得率反而下降[17]?？紤]后續(xù)濃縮工作的難度,故選擇料液比為(1∶10～1∶20) g/mL進一步優(yōu)化實驗。

圖2 料液比對粗多糖得率的影響Fig.2 Effect of water-material ratio on polysaccharide yield

2.1.3 超聲時間對紫山藥粗多糖得率的影響 由圖3可知,超聲時間低于20 min時,紫山藥粗多糖得率隨著時間延長呈現升高趨勢,20～30 min范圍時趨向平穩(wěn)。超聲時間達到一定程度,紫山藥粗多糖得率趨于平穩(wěn),說明此時細胞壁破壞較完全。故選擇超聲時間在15～25 min進一步優(yōu)化實驗。

圖3 超聲時間對粗多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on polysaccharide yield

2.1.4 超聲功率對紫山藥粗多糖得率的影響 由圖4可知,紫山藥粗多糖得率隨著超聲功率的提高呈現升高趨勢,當超聲功率為200 W時,粗多糖得率最高,之后反而下降,可能由于功率過大加速了提取液的流動,使物料作用于超聲波下的時間減少,細胞壁被破壞程度減弱,多糖溶出減少[18];超聲功率過高,熱效應顯著,可能影響纖維素酶活性,從而影響多糖溶出效果;同時,超聲波具有較強的剪切作用,功率過高會導致多糖化學鍵斷裂,進而影響紫山藥粗多糖得率[18]。故選擇超聲功率在150～250 W進一步優(yōu)化。

圖4 超聲功率對粗多糖得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on polysaccharide yield

2.1.5 提取次數對紫山藥粗多糖得率的影響 圖5結果顯示,提取2次后,紫山藥粗多糖得率變化不大,可見,超聲結合酶法提取紫山藥多糖2次即可。

圖5 提取次數對粗多糖得率的影響Fig.5 Effect of extraction times on polysaccharide yield

2.2 紫山藥多糖提取的正交實驗

紫山藥多糖提取的正交實驗結果(表2)分析表明,根據極差結果得出各因素對紫山藥粗多糖提取效果重要性的順序為RC>RD>RA>RB,即超聲時間>超聲功率>加酶量>料液比。最佳提取工藝為A2B1C3D2,即加酶量1.5%、料液比1∶10 g/mL、超聲時間25 min、超聲功率200 W。對最佳提取工藝條件做驗證實驗,重復3次,此條件下紫山藥粗多糖的平均提取率為9.83%±0.92%,高于正交實驗中所有實驗結果。經脫蛋白、去除花青素后的紫山藥多糖粉末的多糖質量分數為58.9%。

表2 紫山藥粗多糖提取的正交實驗結果Table 2 The results of orthogonal test of extraction of purple yam diosgenin

2.3 紫山藥多糖體外抗氧化活性

2.3.1 紫山藥多糖的總還原能力 由圖6可知,在0.03～0.15 mg/mL濃度范圍內,總還原能力隨著紫山藥多糖濃度的增加而升高,并與樣品濃度存在良好的量效關系。在0.06～0.15 mg/mL濃度下,紫山藥多糖的總還原能力略高于維生素C。

圖6 紫山藥多糖的總還原能力Fig.6 The total reducing power of purple yam polysaccharide

2.3.2 紫山藥多糖對DPPH·的清除作用 由圖7可知,在0.1～0.5 mg/mL濃度范圍內,對DPPH·的清除能力隨著紫山藥多糖濃度的提高而增強,通過線性回歸方程計算得到紫山藥多糖的IC50=0.351 mg/mL,而維生素C的IC50=0.227 mg/mL,這說明在相同濃度下,紫山藥多糖對DPPH·的清除能力明顯弱于維生素C。

圖7 紫山藥多糖對DPPH·的清除作用Fig.7 The DPPH· removal effect of purple yam polysaccharide

2.3.3 紫山藥多糖對·OH的清除作用 由圖8可知,在·OH清除實驗中,在0.1～0.5 mg/mL濃度范圍內,多糖濃度與·OH清除率之間存在良好的量效關系,通過線性回歸方程計算得到紫山藥多糖的IC50=0.329 mg/mL,而維生素C的IC50=0.364 mg/mL,這說明在相同濃度下,紫山藥多糖對·OH的清除能力略強于維生素C。

圖8 紫山藥多糖對·OH的清除作用Fig.8 The ·OH removal effect of purple yam polysaccharide

3 討論與結論

對紫山藥多糖的提取進行的單因素實驗結果表明,不同提取因素對紫山藥多糖得率的影響由大到小依次為提取時間、超聲功率、加酶量和料液比。正交實驗優(yōu)化后最佳提取工藝條件為加酶量1.5%、料液比1∶10 g/mL、提取時間25 min、超聲功率200 W。在此條件下做驗證實驗,測得紫山藥多糖的平均提取率為9.83%±0.92%。該方法工藝簡便、高效、快速、成本低、提取劑使用量少、多糖活性良好。

衰老是人體內自由基不斷產生與積累的結果,自由基能使人體細胞中多種物質發(fā)生氧化,導致體內抗氧化酶活性降低,抗氧化能力下降,從而引起衰老[19]。該研究分別從總還原力、對DPPH·和·OH清除率3個方面對提純后的紫山藥多糖進行了體外抗氧化能力測定。通過體外抗氧化性實驗,發(fā)現紫山藥多糖總還原能力和·OH的清除能力略高于維生素C,但DPPH·的清除能力明顯弱于維生素C。紫山藥多糖在實驗濃度下,濃度與總還原能力、對DPPH·和·OH的清除能力呈現良好的量效關系,即濃度越高抗氧化能力越強。綜上所述,紫山藥多糖具有較好的抗氧化活性,其作為天然抗氧化劑值得進一步的研究和開發(fā)。

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Study on optimization of ultrasonic-enzymatic extraction of polysaccharides from purple yam and its antioxidant activity

WANG Yan-ping,XU Shi,CHEN Yue-ying*

(Department of Food Engineering,Henan Vocational College of Agriculture,Zhengzhou 451450,China)

Taking purple yam as the experimental material,the extraction technology and antioxidant activity of polysaccharides from purple yam were studied by ultrasonic-enzymatic extraction,Sevag method for deproteinization,activated carbon for anthocyanins removal andinvitroantioxidant activity. Results showed that the optimum condition were as follows:cellulose amount 1.5%,material-solvent ratio 1∶10(g/mL),extraction time 25 min,ultrasonic power 200 W. Under such conditions,the yield of polysaccharides was 9.83%. The mass fraction of polysaccharides from purple yam polysaccharides powder was 58.9% after deproteinization and anthocyanins removal. The extraction from purple yam showed significant antioxidant capacity,and the scavenging ability of DPPH· were weaker than vitamin C,but that of ·OH was slightly stronger than vitamin C.

purple yam;polysaccharides;ultrasonic-enzymatic extraction;inoxidizability

2016-10-14

王彥平(1983-),女,碩士,講師,研究方向:食品功能與營養(yǎng)因子,E-mail:14389487@qq.com。

*通訊作者:陳月英(1964-),女,碩士,教授,主要從事營養(yǎng)與食品安全等方面的研究,E-mail:1055955506@qq.com。

鄭州市普通科技攻關項目(153PKJGG424);2015年度河南省高等學校優(yōu)秀教學團隊建設;2014年度河南省高等學?！皩I(yè)綜合改革試點”項目。

TS202.3

B

1002-0306(2017)08-0189-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.028