牛思思,汪建明,賀雅欣,于景華

(食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

羥基自由基氧化對(duì)蛋清蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響

牛思思,汪建明*,賀雅欣,于景華

(食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津 300457)

研究蛋清蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)FeCl3/抗壞血酸(Asc)/H2O2產(chǎn)生的羥基自由基氧化體系氧化后化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化。用不同濃度的H2O2(0、1、5、10和20 mmol/L)對(duì)蛋清蛋白質(zhì)氧化3 h,研究氧化前后蛋清蛋白質(zhì)羰基、游離巰基、總巰基、游離氨基、粒徑分布及二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化趨勢(shì)。結(jié)果表明:氧化可使蛋清蛋白質(zhì)羰基含量顯著升高(p<0.05),游離巰基和總巰基含量顯著下降(p<0.05),游離氨基顯著下降(p<0.05),平均粒徑逐漸增大。當(dāng)H2O2濃度為20 mmol/L時(shí),與對(duì)照組相比羰基含量增加2.01倍,游離氨基降低了29.1%,平均粒徑增加到666 nm。在H2O2濃度低于5 mmol/L時(shí),α-螺旋和β-折疊含量升高,β-轉(zhuǎn)角降低;H2O2濃度高于5 mmol/L時(shí)蛋清蛋白質(zhì)的肽鏈發(fā)生斷裂,進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。以上結(jié)果表明氧化能在一定程度上改變蛋清蛋白的結(jié)構(gòu)特性。

蛋清蛋白,羥基自由基,蛋白質(zhì)氧化,結(jié)構(gòu)

蛋白質(zhì)的氧化行為是使食品品質(zhì)變差的重要原因,是導(dǎo)致蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)流失、風(fēng)味變差以及功能特性下降的重要原因[1]。蛋白質(zhì)在加工和貯藏階段引入的氧化劑、催化劑、金屬離子或不當(dāng)?shù)募庸l件(如輻照)[2],都有可能引起蛋白質(zhì)的氧化。蛋白質(zhì)的氧化變性取決于其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和特定的促氧化劑所固有的氧化機(jī)制,也可能受到pH、溫度和系統(tǒng)組分的影響。氧化劑通過(guò)奪氫、加氧、斷裂、交聯(lián)等方式使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,失去生物活性,并引起其它不理想的變化[3]。

目前,在食品科學(xué)領(lǐng)域,對(duì)蛋白質(zhì)氧化機(jī)理的解釋大多集中于大豆分離蛋白、乳清分離蛋白以及肌肉纖維蛋白。研究表明,在模擬氧化體系中對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行氧化處理,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的主鏈和氨基酸殘基的側(cè)鏈發(fā)生變化,如肽鏈的斷裂、氨基酸殘基側(cè)鏈的氧化修飾以及蛋白質(zhì)分子間交聯(lián)物的形成等,進(jìn)而會(huì)使得其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)及功能性質(zhì)的降低,蛋白制品的品質(zhì)及消費(fèi)者的可接受性隨之下降[4]。Davies[5]發(fā)現(xiàn)活性氧自由基會(huì)攻擊幾乎所有類(lèi)型氨基酸側(cè)鏈,而芳香族和含硫氨基酸酸側(cè)鏈特別容易受到氧化。Kong等[6]在室溫條件下將乳清分離蛋白暴露于H2O2/FeCl3羥基自由基體系中,研究不同氧化程度的乳清蛋白化學(xué)和結(jié)構(gòu)變化,主要表現(xiàn)為羰基氧化產(chǎn)物的生成,總巰基含量的降低及蛋白質(zhì)交聯(lián)聚集等,并且蛋白質(zhì)在羥基自由基體系下更容易發(fā)生氧化。章銀良等[7]研究了羥基自由誘導(dǎo)牛血清蛋白的氧化發(fā)現(xiàn)總巰基及活性巰基的含量都有著不同程度的減少,隨著氧化劑濃度的增加和氧化時(shí)間的延長(zhǎng),表面疏水性和羰基含量均呈增加趨勢(shì),蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)也發(fā)生了改變。但是目前的研究中并沒(méi)有涉及氧化對(duì)蛋清蛋白物理化學(xué)性質(zhì)方面的研究。對(duì)于蛋清蛋白的氧化修飾及其氧化后理化性質(zhì)的變化規(guī)律還需更多的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)揭示。

本研究以蛋清蛋白為研究對(duì)象,采用羥自由基氧化體系(FeCl3/Asc/H2O2,pH6.0)對(duì)其進(jìn)行氧化修飾,通過(guò)對(duì)羰基含量、游離巰基、總巰基及二級(jí)結(jié)構(gòu)等結(jié)構(gòu)指標(biāo)的探討,根據(jù)它們的變化規(guī)律及相互關(guān)系揭示羥基自由基對(duì)蛋清蛋白結(jié)構(gòu)的氧化修飾。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋清粉 鄭州頂嘉食品科技有限公司;牛血清蛋白 美國(guó)Sigma公司;考馬斯亮藍(lán) 北京Solarbio科技有限公司;巰基乙醇 北京索萊寶科技有限公司;氯化鐵(FeCl3)、過(guò)氧化氫(H2O2)、抗壞血酸(Asc)、乙二胺四乙酸(EDTA) 均為分析純。

HH-S4型恒溫水浴鍋 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;H05-1型恒溫磁力攪拌器 天津東南儀誠(chéng)科技有限公司;AB204-N型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;FD-1型系列冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技發(fā)展有限公司;TDZ5-WS型低速離心機(jī) 湘儀離心機(jī)有限公司;756PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 天津普瑞斯有限公司;BT-90型納米粒度儀 丹東市百特儀器有限公司;IS50型傅里葉紅外光譜儀 美國(guó)尼高利。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋清蛋白的氧化 采用羥基自由基氧化體系主要由FeCl3、Asc和H2O2通過(guò)鐵的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生自由基[8]。FeCl3、Asc濃度均為0.1 mmol/L,H2O2濃度分別為0、1、5、10、20 mmol/L,反應(yīng)體系均在50 mmol/L磷酸鹽緩沖液中,在上述氧化體系中加入蛋清粉,使得蛋白質(zhì)終質(zhì)量濃度為20 mg/mL,80 ℃水浴3 h,研究不同氧化程度對(duì)蛋清蛋白結(jié)構(gòu)及其功能特性的影響。氧化結(jié)束后,加入EDTA(終濃度為1 mmol/L)終止反應(yīng)。為了減少氧化試劑對(duì)測(cè)定指標(biāo)的影響,氧化產(chǎn)物要經(jīng)過(guò)pH6.0磷酸鹽緩沖溶液洗滌和離心處理去掉上清液,冷凍干燥得到氧化蛋白,用于測(cè)定氧化蛋白的羰基含量、巰基含量、二硫鍵含量、游離氨基含量、粒徑、二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.2 氧化蛋清蛋白羰基含量的測(cè)定 蛋白質(zhì)羰基含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[9]。將制備的氧化蛋清蛋白分散于去離子水中,磁力攪拌2 h,4000 r/min離心30 min。采用考馬斯亮藍(lán)法以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)量濃度。將10 mL上清液與2 mL含有10 mmol/L 2,4-二硝基苯肼(DNPH)的2 mol/L HCl混合,另取10 mL上清液與2 mL不含有2,4-二基苯肼的2 mol/L HCl混合作為對(duì)照,常溫反應(yīng)2 h。然后在每個(gè)離心管中加入40%的三氯乙酸0.50 mL,劇烈振搖均勻后靜置20 min。4000 r/min 離心20 min后棄去上清液。用乙醇-乙酸乙酯混合溶液(體積比為1∶1)2.0 mL洗滌沉淀,4000 r/min離心10 min棄去上清液,重復(fù)洗滌3次。加入0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(含6 mol/L鹽酸胍,pH7.0)2.0 mL,37 ℃水浴20 min,每5 min劇烈振搖1次。以空白對(duì)照在370 nm處作校正,以 22000 cm-1消光系數(shù)計(jì)算每毫克蛋白質(zhì)羰基衍生物的物質(zhì)的量。

式中,A370:370 nm出的吸光值;D:為稀釋倍數(shù);C:為蛋白樣品濃度,mg/mL。

1.2.3 氧化蛋清蛋白巰基與總巰基的測(cè)定 采用5,5′-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DNTB)比色法[9]測(cè)定蛋白質(zhì)的巰基含量(包括游離的和埋藏在蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)內(nèi)部的巰基)和總巰基基團(tuán)(包括巰基和還原的二硫鍵)含量。

巰基含量的測(cè)定:取3 mL蛋白溶液,加入0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(1 mmol/L EDTA和1% SDS,pH8.0)3 mL、DNTB 0.1 mL,振蕩均勻后在常溫反應(yīng)1 h。4000 r/min離心10 min。以不加DNTB為對(duì)照,取上清液在412 nm下測(cè)定吸光度,以13600 cm-1消光系數(shù)計(jì)算巰基含量。

總巰基基團(tuán)含量的測(cè)定:取1 mL蛋白溶液,加入 0.05 mLβ-巰基乙醇和0.1 mol/L尿素-鹽酸胍磷酸鹽緩沖液(6 mol/L尿素和4 mol/L鹽酸胍,pH8.0)4 mL,反應(yīng)1 h后再加入12%三氯乙酸10 mL,反應(yīng)1 h后,4000 r/min離心10 min。沉淀分散在20 mL 12%的三氯乙酸中,離心除去β-巰基乙醇,如此重復(fù)2次。最后將沉淀溶解于0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(1 mmol/L EDTA和1% SDS,pH8.0)10 mL,再加入0.08 mL DNTB,劇烈振蕩后反應(yīng)1 h,4000 r/min離心 30 min。以不加 DNTB 為對(duì)照,取上清液在 412 nm 下測(cè)定吸光度,以13600 cm-1消光系數(shù)計(jì)算巰基含量。

式中,A412:412 nm出的吸光值;D:為稀釋倍數(shù);C:為蛋白樣品濃度,mg/mL。

1.2.4 氧化蛋清蛋白游離氨基的測(cè)定 采用三硝基苯磺酸(TNBS)比色法[10]測(cè)定蛋清蛋白游離氨基含量。將一定量氧化后的蛋清蛋白分散于0.1 mol/L的四硼酸鈉緩沖溶液(1% SDS,pH9.3)中,磁力攪拌2 h后,4000 r/min離心30 min,以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白,采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)量濃度,最后通過(guò)稀釋使得上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 mg/mL。取1 mL蛋白液與50 μL 0.03 mol/L TNBS混勻,37 ℃水浴1 h,加入0.24 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至 3.5～4.0,在 335 nm下測(cè)定吸光度。以亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算游離氨基的含量(標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.0527x+0.0075,R2=0.9986)。

1.2.5 氧化蛋清蛋白粒徑的測(cè)定 將氧化后的蛋清蛋白分散在0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(pH7.0)中,磁力攪拌 2 h,采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度,通過(guò)稀釋使得上清液蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL,使用納米粒度儀測(cè)定樣品粒度分布。

1.2.6 氧化蛋清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 將真空冷凍干燥后的蛋白粉末2～6 mg與0.2 g溴化鉀混合研磨均勻,用紅外專用壓片機(jī)進(jìn)行壓片,在恒溫箱里平衡5 min,以空氣為掃描背景,運(yùn)用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)測(cè)定。

掃描參數(shù):光譜范圍4000～400 cm-1,分辨率為4 cm-1,掃描累加64次,重復(fù)3次。選取1600～1700 cm-1波數(shù)的譜圖,利用OMNIC 8.2數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行分析處理。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn),數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,采用Origin 8.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。不同字母表示組間差異顯著(p<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 羰基含量的變化

圖1 不同氧化程度的蛋清蛋白羰基含量的變化Fig.1 Changes in carbonyl content of different degree of oxidation egg white protein

2.2 游離巰基和總巰基的變化

巰基和二硫鍵是蛋白質(zhì)中具有最高反應(yīng)活性的基團(tuán),蛋白質(zhì)發(fā)生氧化可使巰基(-SH)形成二硫鍵(-S-S-),因此在研究蛋白質(zhì)氧化時(shí),巰基和二硫鍵含量的測(cè)定是重要的測(cè)定指標(biāo)。

不同氧化程度的蛋清蛋白游離巰基和總巰基含量的變化見(jiàn)表1。由表1可知,羥基自由基氧化體系對(duì)游離巰基和總巰基含量的影響同羰基變化趨勢(shì)恰好相反。隨著氧化劑濃度的增大,蛋清蛋白的游離巰基的含量顯著下降。游離巰基含量的下降表明了氧化使得蛋白質(zhì)發(fā)生了變性,或者形成了分子間二硫鍵[14]。

表1 不同氧化程度的蛋清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)游離巰基和總巰基的變化Table 1 Changes in free sulphydryl and total sulfhydryl(SH) content of different degree of oxidation egg white protein

注:不同字母表示組間差異顯著p<0.05。

由表1同樣可以發(fā)現(xiàn),隨著氧化劑濃度的增大,蛋清蛋白的總巰基含量也是顯著下降的,總巰基含量與對(duì)照相比分別減少了1.5%、7.9%、17.8%、33.5%和35.7%。

游離巰基和總巰基含量會(huì)隨著氧化程度的增加而呈現(xiàn)不同程度的損失。蛋清蛋白總巰基下降的絕對(duì)值大于游離巰基下降的絕對(duì)值,表明蛋白質(zhì)氧化使得蛋清蛋白二硫鍵含量下降。蛋白質(zhì)巰基可被氧化成多種狀態(tài),包括可逆氧化形式,主要形成蛋白質(zhì)二硫鍵和次磺酸;與不可逆氧化形式,主要形成亞磺酸和磺酸[14]。而實(shí)驗(yàn)結(jié)果為二硫鍵含量下降,說(shuō)明蛋清蛋白巰基被氧化成為不可逆氧化狀態(tài),形成了非二硫鍵的含硫化合物。

2.3 游離氨基酸含量的變化

圖2 不同氧化程度的蛋清蛋白游離氨基酸的變化Fig.2 Changes in free amine content of different degree of oxidation egg white protein

2.4 蛋清蛋白粒徑的變化

激光納米粒度測(cè)定儀是對(duì)可溶性蛋白質(zhì)的粒度分布進(jìn)行測(cè)定,一定程度上可以解釋氧化蛋清蛋白的聚集程度。在羥基自由基氧化體系中蛋清蛋白的粒徑分布情況如圖3所示,與對(duì)照樣相比,當(dāng)H2O2濃度為0和1 mmol/L時(shí),蛋清蛋白的粒徑分布偏向粒徑小的方向;H2O2濃度達(dá)到5 mmol/L以上時(shí),蛋清蛋白的粒徑分布偏向于粒徑大的反向。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明氧化使得蛋清蛋白的粒徑發(fā)生變化,分為大粒度(約1000 nm)和小粒度(約100 nm)兩個(gè)部分。蛋清蛋白的平均粒徑隨著氧化劑濃度的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì),氧化劑濃度達(dá)到20 mmol/L時(shí)平均粒徑達(dá)到666 nm,比表面積達(dá)到最低,對(duì)照組的蛋清蛋白PDI(polydiseperse index,PDI)值最低,為0.139,粒度分布的均勻性較高,氧化劑濃度為20 mmol/L時(shí),PDI值最大,說(shuō)明粒度差異最大。

表4 氧化對(duì)蛋清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量的影響Table 4 Changes in secondary structural comparative content of different degree of oxidation egg white protein

圖3 氧化對(duì)蛋清蛋白粒徑的影響Fig.3 Influence of egg white protein particle diameter on oxidation

這說(shuō)明羥自由基氧化使得蛋清蛋白發(fā)生變性和聚集,使得蛋白質(zhì)粒徑增大,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能性質(zhì)改變。吳偉[4]在對(duì)大豆蛋白進(jìn)行氧化的研究中也發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的聚集,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。黃友如等[16]研究報(bào)道蛋白質(zhì)氧化引起蛋白質(zhì)分子或亞基間共價(jià)的交聯(lián)和疏水基團(tuán)的暴露,反應(yīng)后的蛋白質(zhì)通過(guò)范德華力、氫鍵、疏水相互作用和靜電作用等分子間作用力重新折疊與組裝,從而形成較大的蛋白質(zhì)聚集體。

表2 蛋清蛋白粒徑分布的測(cè)定結(jié)果Table 2 Results of particle size distribution of egg white protein

2.5 蛋清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

紅外光譜圖中的酰胺I帶(1600～1700 cm-1)對(duì)蛋白質(zhì)中的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化非常敏感,常用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化[17]。根據(jù)表3去卷積酰胺I帶各個(gè)波數(shù)及結(jié)構(gòu)指認(rèn)表[18],計(jì)算出蛋清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量。

表3 去卷積酰胺I帶各個(gè)波數(shù)及其結(jié)構(gòu)指認(rèn)Table 3 Deconvoluted amide I band frequencies and assignments to secondary structure for protein

表4所示是羥基自由基氧化的蛋清蛋白發(fā)生不同程度氧化的二級(jí)結(jié)構(gòu)相對(duì)含量,發(fā)現(xiàn)氧化對(duì)蛋清蛋白α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲的相對(duì)含量有不同程度的影響。隨著氧化劑濃度的增加,α-螺旋的相對(duì)含量先升高到5 mmol/L時(shí)達(dá)到最大,隨后呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。無(wú)規(guī)則卷曲不明顯。β-轉(zhuǎn)角先下降后升高,而β-折疊的相對(duì)含量的變化是低濃度時(shí)升高,表明氧化可使蛋清蛋白形成聚集體,而當(dāng)濃度達(dá)到10、20 mmol/L時(shí),相對(duì)含量降低,可能是高濃度條件下,蛋清蛋白的肽鏈發(fā)生斷裂,進(jìn)一步導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。吳偉[4]和Lund等[19]認(rèn)為高氧化條件會(huì)致使蛋白質(zhì)肽鏈斷裂。

3 結(jié)論

通過(guò)FeCl3/Asc/H2O2產(chǎn)生的羥基自由基氧化體系對(duì)蛋清蛋白進(jìn)行氧化,能夠顯著改變其結(jié)構(gòu)特性,隨著H2O2的濃度逐漸增加,蛋清蛋白的羰基含量顯著增加,游離巰基和總巰基含量顯著降低,二硫鍵含量降低,蛋白質(zhì)巰基發(fā)生不可逆氧化,形成了非二硫鍵的含硫化合物。隨著氧化程度的加深,蛋清蛋白的游離氨基含量逐漸降低,平均粒徑呈現(xiàn)增大趨勢(shì),在氧化濃度低于5 mmol/L時(shí),α-螺旋和β-折疊含量升高,伴隨著β-轉(zhuǎn)角降低,而氧化濃度高于5 mmol/L時(shí)蛋清蛋白的多肽鏈發(fā)生斷裂,從而導(dǎo)致了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。氧化還會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)其他結(jié)構(gòu)特性的改變,進(jìn)一步影響蛋白質(zhì)宏觀上的功能特性,這些內(nèi)容會(huì)在今后的研究中進(jìn)行探索。

[1]Xiong Y L. Protein oxidation and implications for muscle food quality[M]. In Antioxiants in Muscle Foods;Decker E A,Faustman C L,Lopez-Bote C J,Eds.,John Wiley & Sons Inc.,New York,2000：85-111.

[2]Schaich K M. Free Radical Initiation in Proteins and Amino Acids by Ionizing and Ultraviolet Radiations and Lipid Oxidation(Ⅲ)[J]CRC Crit Rev Food Sci Nutr,1980,13:189-244.

[3]崔旭海,孔保華. 蛋白質(zhì)氧化及其對(duì)乳蛋白結(jié)構(gòu)與功能性的影響[J]. 中國(guó)乳品工業(yè),2008,36(1):44-47.

[4]吳偉.蛋白質(zhì)氧化對(duì)大豆蛋白結(jié)構(gòu)和凝膠性質(zhì)的影響[D]. 無(wú)錫:江南大學(xué),2010.

[5]Davies M J.The oxidative environment and protein damage[J]. Biochimica et Biophysica Acta,2005,1703(2):93-109.

[6]Cui X H,Xiong Y L,Kong B H,et al.Hydroxyl radical-stressed whey rrotein isolate:Chemical and structural properties[J].Food & Bioprocess Technology,2011,5(6):2454-2461.

[7]章銀良,楊慧,安巧云.羥自由基誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化損傷的研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2012,31(3):313-318.

[8]Kong B,Xiong YL,Cui X,et al. Hydroxyl Radical-Stressed Whey Protein Isolate:Functional and Rheological Properties[J]. Food and Bioprocess Technology,2011,6(1):169-176.

[9]Huang Y R,Hua Y F,Qiu A Y.Soybean protein aggregation induced by lipoxygenase catalyzed linoleic acid oxidation[J].Food Research International,2006,39(2):240-249.

[10]Habeeb A F S A.Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid[J].Analytical Biochemistry,1966,14(3):328-336.

[11]Stadtman E R.Oxidation of free amino acids and amino acid residues in proteins by radiolysis and by metal-catalyzed reactions[J].Annual Review of Biochemistry,1993,62(1):797-821.

[12]Santelhoutellier V,Aubry L,Gatellier P.Effect of oxidation on in vitrodigestibility of skeletal muscle myofibrillar proteins[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2007,55(13):5343-5348.

[13]Park D,Xiong Y L,Alderton A L,et al.Biochemical changes in myofibrillar protein isolates exposed to three oxidizing systems[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(12):4445-4451.

[14]Thomas J A,Mallis R J.Aging and oxidation of reactive protein sulphydryls[J].Experimental Gerontology,2001,36(9):1519-1526.

[15]崔旭海,孔保華.羥基自由基氧化對(duì)乳清蛋白氨基酸含量的影響[J].食品工業(yè)科技,2010,31(10):85-89.

[16]黃友如,華欲飛,裘愛(ài)泳.脂質(zhì)氧化誘導(dǎo)的大豆蛋白質(zhì)聚集機(jī)理的研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2006,21(6):80-87.

[17]Liu Y,Zhao G,Zhao M,et al.Effects of moist heat treatments to peanut kernels on the structure and functional properties of peanut protein isolated[J].Modern Food Science and Technology,2011,27(5)：506-510.

[18]Byler D M,Brouillette J N,Susi H.Quantitative studies of protein structure by FTIR spectra deconvolution and curve-fitting[J].Spectroscopy,1986,1(3):29-32.

[19]Lund M N,Heinonen M,Baron C P,et al.Protein oxidation in muscle foods:A review[J].Molecular Nutrition & Food Research,2011,55(1):83-95.

Effect of hydroxyl radical oxidation system on structure of egg white protein

NIU Si-si,WANG Jian-ming*,HE Ya-xin,YU Jing-hua

(Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education,College of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology,Tianjin 300457,China)

The objective of this study was to determine structural changes,including carbonyls,sulfhydryls,free amino,particle size distribution,secondary structure in egg white protein exposed to FeCl3/Asc/H2O2hydroxyl radical-generating systems. Protein carbonyl content in EWP increased(p<0.05)with increasing concentrations of H2O2,free SH,total SH groups and free amino decreased(p<0.05)in a similar fashion. EWP average particle size increased. When the H2O2concentration was increased to 20 mmol/L,there was 2.01-fold increase in carbonyl group,29.1% decrease in free amino acid,compared with control group. The average particle size reached 666 nm. The results showed that there were increases inα-helix andβ-fold of relative content,decrease inβ-turn of relative content with the increase of oxidizing agent(H2O2<5 mmol/L). Higher level oxidation(H2O2>5 mmol/L)would induce fragmentation through direct breakage of peptide bonds,resulted in changes in the secondary structures. These oxidation-induced changed demonstrate high susceptibility of EWP to oxidative stress.

egg white protein;hydroxyl radical;protein oxidation;structure

2016-08-16

牛思思(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)，E-mail：nss_bae@163.com。

*通訊作者:汪建明(1972-)，女，教授，研究方向：動(dòng)物資源開(kāi)發(fā)與功能食品，E-mail：wangjianming@tust.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31271904)。

TS253.1

A

1002-0306(2017)08-0113-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.08.014