張 瑾 （北京市第四中學(xué) 北京 100034）

1 問題的提出

高中生物學(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容標(biāo)準(zhǔn)中，要求組織學(xué)生“嘗試PCR（DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）技術(shù)的基本操作和應(yīng)用”，建議開展“用某個DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增”的實(shí)驗(yàn)活動。為此，浙科版教材設(shè)有“DNA片段的PCR擴(kuò)增”實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)有助于學(xué)生理解PCR反應(yīng)的原理，掌握PCR和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，認(rèn)同現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值。教材中使用亞甲基藍(lán)溶液對電泳后的凝膠進(jìn)行染色，亞甲基藍(lán)基本無毒，能將無色的DNA染成藍(lán)色，染色結(jié)果穩(wěn)定且肉眼可見，染液可回收和反復(fù)利用。

但是，本實(shí)驗(yàn)選用的實(shí)驗(yàn)材料是市售的λ噬菌體DNA或大腸桿菌，前者較為昂貴，后者需進(jìn)行培養(yǎng)。該實(shí)驗(yàn)流程約為3課時，其中的電泳和染色需安排2節(jié)課連堂，教師調(diào)課有困難。此外，教材對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理也沒有具體要求，通過實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)學(xué)生理性思維的預(yù)期目標(biāo)也難以實(shí)現(xiàn)。

2 實(shí)踐中探索

針對以上問題，筆者在近年的教學(xué)實(shí)踐中逐步對該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了探索，具體如表1。

表1 實(shí)驗(yàn)改進(jìn)前、后對比表

2.1 以酵母菌為實(shí)驗(yàn)材料 為了便于實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備，筆者將實(shí)驗(yàn)材料改為超市購買的食用高活性干酵母（釀酒酵母），并將其制成酵母細(xì)胞懸液。具體操作是：稱取0.1 g干酵母粉，放于盛有100 mL無菌水的三角瓶中，蓋上封口膜用皮筋綁好，搖勻后在溫暖環(huán)境下活化2 h即可。

2.2 簡化實(shí)驗(yàn)步驟

1）PCR擴(kuò)增酵母細(xì)胞的核糖體DNA（rDNA）部分片段。酵母細(xì)胞中編碼核糖體18S rRNA、5.8S rRNA、25S rRNA的3個DNA序列，中間相隔2個內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）。 成熟的核糖體RNA中不包括ITS序列，因此自然選擇壓力較小，能容忍更多變異。此外，ITS序列拷貝數(shù)高，長度多在1 000 bp以內(nèi)，容易被PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增ITS序列，不僅可以鑒定病原真菌，篩選釀酒的酵母菌株，還可以通過測序和比對不同物種的序列建立進(jìn)化樹，體現(xiàn)了PCR技術(shù)在醫(yī)療、工業(yè)和進(jìn)化研究上的應(yīng)用價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)使用真菌通用ITS引物（ITS1引物和ITS4引物）擴(kuò)增5.8S rDNA及其兩端的2個ITS的全部序列，以及相鄰的18S rDNA和25S rDNA的部分序列，總長度為841 bp。引物A（ITS1引物）序列為 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′。 引物 B（ITS4引物）序列為 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′［2］。實(shí)驗(yàn)所用擴(kuò)增緩沖液、dNTP、TaqDNA聚合酶和引物均為市售產(chǎn)品。

圖1 核糖體DNA部分片段示意圖

PCR具體步驟為：使用微量移液器將PCR反應(yīng)體系（見表2）各成分加入到0.2 mL已滅菌的微量離心管中。陰性對照則是用無菌水代替酵母細(xì)胞懸液。切記不可加入過多酵母，否則細(xì)胞壁會影響PCR效果；且酵母細(xì)胞懸液需搖勻后再吸取。反復(fù)吹吸使反應(yīng)液混合均勻，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心30 s,使反應(yīng)液集中于微量離心管的底部。將微量離心管放入PCR儀中，反應(yīng)條件參數(shù)設(shè)置如圖2。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物可貯存于-20℃冰箱中。

表2 PCR反應(yīng)體系配方

圖2 PCR反應(yīng)條件流程圖

2）縮短凝膠電泳時間。教材上是80 V電壓下電泳40 min，現(xiàn)壓縮到25 min即可看到PCR產(chǎn)物和Marker條帶。具體操作方法是：①制備瓊脂糖凝膠:稱取瓊脂糖0.25 g加到盛有25 mL電泳緩沖液的三角瓶中（電泳緩沖液為市售50×TBE電泳緩沖液加蒸餾水稀釋而成。5×TBE電泳緩沖液制備方法為:稱取54 g Tris，27.5 g硼酸溶于800 mL蒸餾水中，加入 20 mL 0.5 mol/L EDTA，調(diào)節(jié) pH至 8.0，加水定容至1 L，室溫保存?zhèn)溆茫Ｉw上封口膜并用橡皮筋綁?。挥梦⒉t加熱1 min，使瓊脂糖熔化呈透明；倒入膠盒，注意避免產(chǎn)生氣泡。待凝膠完全凝結(jié)，小心拔出梳子，將其從膠盒中取出，放入電泳槽內(nèi)，加樣孔一端朝向負(fù)極。向電泳槽中加入電泳緩沖液，并沒過凝膠。②加樣：用微量移液器向50 μL PCR產(chǎn)物中加入 10 μL 6×上樣緩沖液，并反復(fù)吹吸混合均勻。將10 μL和20 μL樣品混合液分別緩慢加到2個加樣孔內(nèi)。陰性對照組方法同上，加樣 10 μL。 將 20 μL DNA Marker 與4 μL 6×上樣緩沖液混合均勻，全部加到加樣孔內(nèi)；若市售DNA Marker已含有上樣緩沖液，則無需混合，直接加樣25 μL。每次加樣需更換1個槍頭。盡量避免使用最外側(cè)的加樣孔，其染色效果有時不理想。③電泳：蓋上電泳槽蓋，連接好電極插頭后再接通電源。將直流電泳儀電源的電壓設(shè)置成80 V，電泳25 min。注意觀察溴酚藍(lán)不要遷移出凝膠。

2.3 優(yōu)化染色方案 教材中的3步染色法，操作時間較長。筆者通過反復(fù)實(shí)踐，提出2種可行的染色方案，既確保實(shí)驗(yàn)效果理想，又能滿足教師的不同排課需求。

染色方案1：壓縮并改進(jìn)3步染色法，1課時完成電泳和染色。具體方法是：①將凝膠放入培養(yǎng)皿里，倒入0.1% 亞甲基藍(lán)溶液沒過凝膠約5 mm，染色8 min。輕輕晃動培養(yǎng)皿，讓染液進(jìn)入凝膠下表面與培養(yǎng)皿之間，不要留有氣泡。染色后回收染液，染液需避光保存。②倒入75%乙醇沒過凝膠約5 mm，不斷晃動培養(yǎng)皿1～1.5 min。再倒去乙醇。③加入冷的蒸餾水進(jìn)行脫色，當(dāng)出現(xiàn)清晰的藍(lán)色條帶時，倒去蒸餾水終止脫色。此過程中可更換被染藍(lán)的蒸餾水。此外，凝膠在蒸餾水中不宜浸泡過久，否則條帶顏色變淡直至無色。

上述方案主要改進(jìn)之處有：將染色時間從“15～20 min”壓縮為“8 min”，因電泳時間已經(jīng)從“40 min”壓縮到“25 min”,從而 1 課時就可以完成電泳、染色和觀察，較原有方案減少了1課時，同時染色結(jié)果十分清晰（如圖3）。染色時間縮短之后，染液的深度對染色結(jié)果的影響就顯現(xiàn)出來。同樣是染色8 min,圖3是染液沒過凝膠約5 mm的結(jié)果，圖4是染液覆蓋凝膠的結(jié)果（使用Marker 5 000），可見前者較為清晰。因此，將“染液覆蓋凝膠”改為“沒過凝膠約5 mm”，即向裝有凝膠的普通中號培養(yǎng)皿中倒?jié)M染液。此外，將“冷水”改為“冷的蒸餾水”，是由于自來水中的氯會影響染色效果。此外，凝膠厚度不同，染色效果也有所差異，教師可進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)并適當(dāng)調(diào)整染色時間。

染色方案2：向盛有凝膠的培養(yǎng)皿中倒入0.002%亞甲基藍(lán)溶液（將2 mL的0.1%亞甲基藍(lán)溶液加入10 mL電泳緩沖液中,再加入88 mL蒸餾水，避光保存），并沒過凝膠約5 mm。輕輕晃動培養(yǎng)皿，讓染液進(jìn)入凝膠下表面與培養(yǎng)皿之間。蓋上培養(yǎng)皿蓋，4℃冷藏過夜。次日觀察經(jīng)過染色處理的凝膠板，看到清晰的藍(lán)色區(qū)帶后，倒去染液，終止染色。

本方案將染色步驟簡化為1步，染色效果仍很好。教師可利用剩余時間講解觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的時間和方法，由于亞甲基藍(lán)的染色效果較為穩(wěn)定，可組織學(xué)生利用次日的課余時間觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.4 細(xì)化觀察方法 學(xué)生觀察凝膠板上呈現(xiàn)的DNA藍(lán)色條帶時，可先在桌上鋪一張白紙，在光下手持盛有凝膠的培養(yǎng)皿距白紙5 cm以上，找到較為清晰的條帶。再將凝膠置于平的透明玻璃板上，放在三腳架上面進(jìn)行觀察和手機(jī)拍照。在觀察的同時，可在實(shí)驗(yàn)報(bào)告單上繪制草圖，標(biāo)出DNA藍(lán)色條帶的數(shù)目和位置。

圖3 染液沒過凝膠5 mm染色結(jié)果照片

圖4 染液覆蓋凝膠染色結(jié)果照片

圖5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果局部照片及黑白鏡像

3 獲得理想的實(shí)驗(yàn)效果

高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)強(qiáng)調(diào)引導(dǎo)學(xué)生體驗(yàn)知識形成的過程，重視學(xué)生的科學(xué)思維訓(xùn)練，培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)和實(shí)事求是的科學(xué)態(tài)度。實(shí)踐表明，只有實(shí)驗(yàn)進(jìn)展順利并獲得理想的實(shí)驗(yàn)效果，才能為學(xué)生的科學(xué)思維訓(xùn)練提供必要條件。本實(shí)驗(yàn)中染色凝膠板上呈現(xiàn)的清晰藍(lán)色條帶（如圖3和圖5），即為DNA所在位置。PCR產(chǎn)物的長度介于800～1 000 bp之間，20 μL的 PCR產(chǎn)物樣品混合液的條帶比 10 μL的條帶深且寬，陰性對照組則無PCR產(chǎn)物條帶。

在實(shí)驗(yàn)教學(xué)活動中，引導(dǎo)學(xué)生通過分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出結(jié)論，是進(jìn)行科學(xué)思維訓(xùn)練的最好方式。但在以往教學(xué)過程中，僅提示學(xué)生通過對比Marker條帶估計(jì)PCR產(chǎn)物的大致長度，卻忽略了3個問題：①PCR產(chǎn)物條帶位于2條Marker條帶之間，應(yīng)該如何科學(xué)地估值？②估測PCR產(chǎn)物長度只用到了Marker的1個或2個條帶，丟棄了Marker其他條帶中所蘊(yùn)含的寶貴信息，應(yīng)如何充分地分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)？③DNA片段長度的對數(shù)與遷移距離呈負(fù)相關(guān)，應(yīng)如何處理與對數(shù)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)？在學(xué)科教研活動中教師普遍認(rèn)為，這節(jié)實(shí)驗(yàn)課獲得的數(shù)據(jù)是培養(yǎng)學(xué)生理性思維的極好素材。理性思維是基于論證及邏輯推理的思維過程和方式，引導(dǎo)學(xué)生解決以上問題的過程就是對學(xué)生進(jìn)行邏輯思維訓(xùn)練的過程，因此筆者在本實(shí)驗(yàn)活動中又進(jìn)行了如下嘗試：

1）用直尺測量凝膠電泳后不同DNA片段遷移距離（圖6），即凝膠板上每條DNA條帶與加樣孔之間的距離，記錄于表3。

圖6 測量DNA條帶的遷移距離照片

表3 DNA片段長度與遷移距離記錄表

2）借助半對數(shù)坐標(biāo)紙分析對數(shù)數(shù)據(jù)。如圖7A所示，遷移距離所在的X軸是分度均勻的普通坐標(biāo)軸；DNA片段長度所在的Y軸是分度不均勻的對數(shù)坐標(biāo)軸，在此軸上某點(diǎn)與0點(diǎn)的實(shí)際距離為該點(diǎn)對應(yīng)數(shù)（即DNA片段長度）的對數(shù)值，但是在該點(diǎn)標(biāo)出的值是DNA片段長度原數(shù)值。實(shí)際應(yīng)用時，往往根據(jù)需要使用半對數(shù)坐標(biāo)紙的一部分，如圖7A縱軸的起點(diǎn)就是100而不是0。將Marker 2000清晰的4個條帶的數(shù)據(jù)標(biāo)到圖上，可見所有的點(diǎn)在一條直線上。從而推斷“DNA片段長度的對數(shù)與遷移距離呈負(fù)相關(guān)”，繪制趨勢線（直線）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線和PCR產(chǎn)物條帶的遷移距離，可推斷出PCR產(chǎn)物的大小約為840 bp。本次估值建立在Marker全部條帶信息的基礎(chǔ)上，更加科學(xué)。半對數(shù)曲線圖的繪制易于教師展開教學(xué)；學(xué)生也習(xí)得了處理對數(shù)的簡便方法，繪圖和分析圖表的能力得到了提升；數(shù)據(jù)的獲取和分析更為深入。

3）使用條帶更多的Marker 5 000驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。將Marker 5 000的8個條帶的數(shù)據(jù)標(biāo)記在半對數(shù)坐標(biāo)紙上，8個點(diǎn)也位于一條直線上，其趨勢線與Marker 2 000很接近，且基本平行。根據(jù)Marker 5 000實(shí)驗(yàn)結(jié)果中PCR產(chǎn)物的遷移距離和趨勢線，推斷PCR產(chǎn)物大小也約為840 bp，從而證明之前實(shí)驗(yàn)分析方法和結(jié)論的正確性。為了更好地比較2條趨勢線，本文中使用Marker 2 000的凝膠實(shí)際電泳時間為23.5 min，比另一組短1.5 min，從而避免2條線過于重合導(dǎo)致繪圖、分析的困難。在實(shí)際教學(xué)過程中，教師可利用等待電泳和染色的時間引導(dǎo)學(xué)生分析課前準(zhǔn)備的已染色凝膠，將學(xué)生分為2組，分別分析使用不同Marker的2塊凝膠，然后互為驗(yàn)證，學(xué)生再運(yùn)用課上學(xué)得的分析方法分析自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

4）運(yùn)用Excel繪制半對數(shù)曲線圖精確計(jì)算PCR產(chǎn)物大小。如果想獲得精確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，學(xué)有余力的學(xué)生可以課下嘗試用Excel處理數(shù)據(jù)，或由教師匯總?cè)鄶?shù)據(jù)：將表3中Marker條帶的信息輸入到Excel中，選擇繪制“散點(diǎn)圖”，將縱坐標(biāo)軸設(shè)置成 “對數(shù)坐標(biāo)”。添加趨勢線時選擇 “指數(shù)”類型，并顯示公式及R2值，從而獲得半對數(shù)曲線圖，如圖7B。可見2條直線接近且基本平行，0.99的R2值說明趨勢線與數(shù)據(jù)的擬合度很好，證明了DNA條帶的遷移距離與片段長度的對數(shù)呈負(fù)相關(guān)。將PCR產(chǎn)物2次實(shí)驗(yàn)的遷移距離分別帶入公式，計(jì)算出其長度約為846 bp及841 bp，與實(shí)際長度841 bp很接近。運(yùn)用軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果是信息技術(shù)與現(xiàn)代生物技術(shù)的結(jié)合，不僅實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析更為精確，也激發(fā)了學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣，使學(xué)生的理性思維水平得以提高。

圖7 DNA片段長度與遷移距離曲線圖

4 達(dá)到預(yù)期的教學(xué)效果

本實(shí)驗(yàn)原本是驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，半對數(shù)曲線圖的引入，使之轉(zhuǎn)變?yōu)樘骄啃詫?shí)驗(yàn)。先通過Marker條帶在圖上對應(yīng)的點(diǎn)尋找規(guī)律，當(dāng)推斷出“DNA片段長度的對數(shù)與遷移距離呈負(fù)相關(guān)”，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后，又利用這個規(guī)律估測PCR產(chǎn)物大小，解決實(shí)際問題。然后，用條帶更多的Marker進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，最終得出令人信服的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。此外，測量DNA條帶的遷移距離時容易產(chǎn)生誤差，可采取多次測量、全班匯總等方法減小誤差。學(xué)有余力的學(xué)生可使用Excel匯總數(shù)據(jù)，繪制半對數(shù)曲線圖，精確計(jì)算PCR產(chǎn)物的大小，通過R2值驗(yàn)證“Marker的DNA條帶的遷移距離與片段長度的對數(shù)呈負(fù)相關(guān)”的正確性。由此可見，引導(dǎo)學(xué)生用數(shù)學(xué)模型法分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，其論證過程嚴(yán)謹(jǐn)，邏輯推理結(jié)論可信，從而將發(fā)展學(xué)生的生物科學(xué)素養(yǎng)落到實(shí)處。

主要參考文獻(xiàn)

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