任衍鋼 白冠軍 宋玉奇 衛(wèi)紅萍

（陽泉師范高等?？茖W(xué)校 山西平定 045200）

血紅蛋白是研究生物化學(xué)和分子生物學(xué)的重要實驗材料，是闡述生命大分子結(jié)構(gòu)和功能的經(jīng)典物質(zhì)。血紅蛋白是人類最早推測出分子量的蛋白質(zhì)，也是人類最早較系統(tǒng)地闡明結(jié)構(gòu)和功能的生命類重要化合物，最早人類分子病發(fā)生的原因闡明即是基于對血紅蛋白的研究。本文簡要回顧從血紅蛋白發(fā)現(xiàn)到其分子結(jié)構(gòu)和生理機制揭示的歷史過程。

1 血紅蛋白的發(fā)現(xiàn)與早期的研究

對血紅蛋白的研究最早可追溯到1825年?；瘜W(xué)家恩格爾哈德（Johann Friedrich Engelhard）發(fā)現(xiàn)動物血紅蛋白中鐵的比例總是恒定的。根據(jù)鐵原子的質(zhì)量，他計算出血紅蛋白的分子量為4×16 000。這是歷史上首次確定的蛋白質(zhì)分子量。這個“草率的結(jié)論”在當時遭到其他學(xué)者的嘲笑，他們不相信任何分子的分子量會如此大。1925年是恩格爾哈德推測血紅蛋白分子量100周年，英國科學(xué)家代爾（Gilbert Smithson Adair）用 1877年德國植物學(xué)家菲費爾（Wilhelm Pfeffer)發(fā)明的滲透壓測定大分子量的方法證實了恩格爾哈德的結(jié)果。代爾還預(yù)測血紅蛋白分子是一個四聚體化合物，其意義在于首先證實了蛋白質(zhì)大分子內(nèi)部不都是通過共價鍵相結(jié)合的。

1.1 血紅素的發(fā)現(xiàn)——從有機化學(xué)開始早在1746年，意大利學(xué)者梅紐因（Vincenzo Menghini）用含有磁力的刀片檢測到動物器官燃燒后形成的灰分中含有鐵元素。他發(fā)現(xiàn)將動物器官內(nèi)的血液析出后鐵元素的量會減少，由此推測血液中含有鐵元素。梅紐因還通過將血液分離成3部分的實驗證實，鐵元素主要存在于血紅細胞之中［1］。1831年，法國化學(xué)家勒卡努（Louis René Lecanu）在研究血液呈現(xiàn)顏色的原因時，發(fā)現(xiàn)血液的顏色與血紅蛋白有關(guān)。他將血紅蛋白分解成2個部分后，發(fā)現(xiàn)了一種僅占血紅蛋白4%的物質(zhì)。通過實驗進一步發(fā)現(xiàn)該化合物中含有鐵。為此，他采用法國化學(xué)家謝弗勒爾（Chevreul Michel Eugene）給予的名字 “hematosine”（高鐵血紅素，現(xiàn)稱為血紅素）進行命名［2］。隨后科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，血紅素除去鐵離子后，剩余部分可進一步分裂成大致相當于血紅素1/4大小的碎片，這些碎片后被鑒定是吡咯（吡咯最早是從煤焦油中提取的）。吡咯如何組成血紅素？直到20世紀20年代這項工作才取得實質(zhì)性的突破。1921年德國科學(xué)家漢斯·費歇爾（Hans Fischer）在研究膽汁色素時發(fā)現(xiàn)，當把膽汁中的膽紅素分裂成一半時，在膽汁色素中就有血紅素的成分存在。同時他發(fā)現(xiàn)血紅素的結(jié)構(gòu)與吡咯有一定的聯(lián)系，于是想到如果能將4個吡咯合在一起，也許就能發(fā)現(xiàn)血紅素的結(jié)構(gòu)。不久，費歇爾成功地得到了一種四環(huán)化合物，并稱之為“卟吩”。由于分解血紅素時，吡咯是含有一些側(cè)鏈的，所以在合成卟吩時，也就形成了一些不同側(cè)鏈的卟吩衍生物，這些含側(cè)鏈的卟吩衍生物就有了一個新的名字：“卟啉”（“卟啉”一詞是其英文名稱porphyrin的音譯，其英文名源于希臘語單詞，意為紫色，因此卟啉也被稱作紫質(zhì)）。血色素是哪一種卟啉？費歇爾打算從他合成的15種卟啉化合物中挑選。經(jīng)過他和學(xué)生的反復(fù)比較和甄別，終于找出了與天然血色素一樣的卟啉。費歇爾由于在合成血色素方面杰出的貢獻，榮獲1930年的諾貝爾化學(xué)獎。此后，費歇爾將注意力轉(zhuǎn)移到研究葉綠素結(jié)構(gòu)，通過多方面的研究，于1940年闡明了葉綠素a的結(jié)構(gòu)。

1.2 血紅蛋白功能的發(fā)現(xiàn)——生物化學(xué)的奠定血紅蛋白晶體最早是由德國萊比錫大學(xué)生物化學(xué)家許內(nèi)費爾德（Friedrich Ludwig Hünefeld）于1840年發(fā)現(xiàn)的。他將蚯蚓的血液制成涂片放在顯微鏡下，觀察到了針狀多簇的晶體，經(jīng)分析確定，這是血紅蛋白形成的單晶結(jié)構(gòu)（也有記載是觀察女性經(jīng)血）。這項研究開啟了蛋白質(zhì)晶體研究的先河［3］。 1851—1852 年，德國生理學(xué)家芬克（Otto Funke）發(fā)表了一系列通過用純水、酒精溶液、醇或醚溶劑以緩慢蒸發(fā)的方法從蛋白質(zhì)溶液獲得氧合血紅蛋白單晶結(jié)構(gòu)的文章，為此，芬克被認為是蛋白質(zhì)晶體研究的先驅(qū)。隨后，德國生理學(xué)家霍普·塞勒（Felix Hoppe-Seyler）于 1866年在研究血紅細胞功能時，將細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)化合物命名為hemoglobin或haemoglobin。英文血紅蛋白來自希臘語“haima”（血液）和“globule”（小球或水珠）。 霍普·塞勒還發(fā)現(xiàn)氧合血紅蛋白與非氧合血紅蛋白之間在吸收光譜的波段上存在差異，從而揭示了血紅蛋白與氧結(jié)合及分離的過程，并指出氧與血紅蛋白的結(jié)合是以分子而不是以原子形式進行的。為此，他又創(chuàng)造了氧合血紅蛋白這一術(shù)語（英文為oxyhemoglobin）。正是由于對血紅蛋白功能的認識，人類開始認識到血紅細胞的功能是運輸氧氣［注：血紅細胞最早是由荷蘭生物學(xué)家斯瓦默丹（Jan Swammerdam）于1658年用顯微鏡觀察蛙血時發(fā)現(xiàn)的。1674年，另一個荷蘭顯微學(xué)家列文虎克（Anton van Leeuwenhoek）對紅血球進行了更加詳細的描述［4］］?；羝铡と者€發(fā)現(xiàn)一氧化碳也能與血紅蛋白穩(wěn)定結(jié)合。最早對一氧化碳毒性進行研究的是法國著名的生理學(xué)家克勞德·伯納德（Claude Bernard）。1846年，克勞德讓狗吸入這種氣體，發(fā)現(xiàn)狗的血液變成“櫻桃紅色”，即一氧化碳中毒癥狀，最早解釋了煤氣中毒的原因?？藙诘聦ρt蛋白研究的論文多達30余篇。其中一個有趣的發(fā)現(xiàn)是，若在壓縮空氣下工作的工人突然回到正常狀態(tài)下，會由于血液中氧氣迅速的流失而引起死亡，而如果讓他們漸漸地回到正常的大氣壓下則會避免這種災(zāi)難的發(fā)生，這一發(fā)現(xiàn)挽救了許多人的生命。他還說明了機體氧化的最終場所是機體組織而不是血液。作為生物化學(xué)的先驅(qū)，霍普·塞勒在1877年首先使用“生物化學(xué)（德語：biochemie。英文中的biochemistry首次出現(xiàn)在1848年）”一詞，標志著生物化學(xué)學(xué)科的誕生［5］。

2 血紅蛋白結(jié)構(gòu)和機制的揭示——分子生物學(xué)的研究

由于血紅蛋白易于提取和結(jié)晶，并且與一些貧血癥狀有關(guān)，科學(xué)家對血紅蛋白的研究興趣愈發(fā)濃厚，從而使血紅蛋白成為揭開蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)和功能的重要實驗材料。

2.1 血紅蛋白一級結(jié)構(gòu)的研究——分子生物學(xué)的開端 血紅蛋白一級結(jié)構(gòu)的揭示是對一種鐮刀型細胞貧血癥的疾病研究引發(fā)的。1910年，美國芝加哥醫(yī)生赫里克（James B.Herrick）注意到了一位來自加勒比海貧血癥患者，患者血液中的紅細胞呈現(xiàn)“鐮刀形”。1927 年，哈恩（E.V.Hahn）和吉萊斯皮（E.B.Gillespie）通過實驗證實鐮刀型貧血與缺氧有關(guān)［6］。1940年，著名科學(xué)家霍普金斯（Johns Hopkins）的學(xué)生謝爾曼（Irving Sherman）發(fā)現(xiàn)，脫氧紅細胞會出現(xiàn)雙折射現(xiàn)象，因而推測缺氧會使血紅蛋白改變形狀［7］。1948年，著名的美國科學(xué)家鮑林（Linus Pauling）和哈維·板野 （Harvey Itano）通過電泳技術(shù)分析方法發(fā)現(xiàn)鐮刀型細胞貧血癥患者的血紅蛋白與正常人存在差異，這使他們在1949年首次提出了分子病的概念，這也是人類發(fā)現(xiàn)的第1種分子疾病。正常血紅蛋白與鐮刀型血紅蛋白差異究竟在哪里？1959年，德籍美國科學(xué)家弗農(nóng)·英格拉姆（Vernon Ingram）揭開了這個謎底。英格拉姆發(fā)明了酶解圖譜法或稱指紋圖譜法的特殊紙上層析技術(shù)。該技術(shù)是先將血紅蛋白用胰蛋白酶水解，制成胰蛋白酶的水解產(chǎn)物，然后采取橫向和縱向的雙向分離方法將氨基酸盡可能都分開，這樣就發(fā)現(xiàn)在1個點上，正常血紅蛋白與鐮刀型血紅蛋白存在明顯差異。這個差異只是1個氨基酸，即正常的谷氨酸被異常的纈氨酸替代了，正可謂“差之毫厘謬以千里”，1個氨基酸的差錯就導(dǎo)致了鐮刀型貧血癥。緊接著英格拉姆用著名科學(xué)家桑格（Frederick Sanger）發(fā)明的測定胰島素一級結(jié)構(gòu)氨基酸順序的方法，確定是血紅蛋白β鏈中從N端數(shù)第6個氨基酸谷氨酸被纈氨酸所取代。英格拉姆因其卓越的貢獻被科學(xué)界稱為分子醫(yī)學(xué)之父。此外，為了弄清血紅蛋白的一級結(jié)構(gòu)，德國科學(xué)家布勞恩 （Gerhard Braunitzer）從1956年開始著手這項工作，經(jīng)過5年的努力，于1961年在莫斯科第5屆國際生化代表大會上宣讀了關(guān)于正常人血紅蛋白A化學(xué)組成的論文，并于同年發(fā)表在《Hopp-Seyler生理化學(xué)雜志》上，詳盡列出血紅蛋白A的α鏈 （141個氨基酸）、β鏈（146個氨基酸）和肌紅蛋白（155個氨基酸）等一級結(jié)構(gòu)的全部氨基酸順序。由此闡明血紅蛋白A（α2β2）含有 574 個氨基酸，分子量為 64 450［8］。血紅蛋白一級結(jié)構(gòu)的研究為分子生物學(xué)的研究提供了經(jīng)典案例，也為血紅蛋白空間結(jié)構(gòu)的研究奠定了基礎(chǔ)。布勞恩也因其卓越貢獻被公認是分子生物學(xué)的先驅(qū)之一。

2.2 血紅蛋白空間結(jié)構(gòu)的研究——分子生物學(xué)的深入 1951年，鮑林在研究血紅蛋白結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，結(jié)合他對肽鏈和肽平面化學(xué)結(jié)構(gòu)的理論，提出了α螺旋和β折疊的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的理論（鮑林憑此杰出的貢獻榮獲了1954年的諾貝爾化學(xué)獎）。同年，英國科學(xué)家馬克斯·佩魯茨（Max Perutz）首次用X射線衍射的方法證實了鮑林的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)模型。1953年，佩魯茨發(fā)現(xiàn)，通過浸泡的方法可將重原子引入蛋白質(zhì)中，然后用同晶置換的方法就能解決多年一直未能解決的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相位問題，這種方法為他們研究血紅蛋白空間結(jié)構(gòu)提供了一個新途徑，并為以后更進一步確定蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)邁出了關(guān)鍵一步，從而使對生物大分子的認識深入到了原子水平。1957年，在佩魯茨領(lǐng)導(dǎo)下從事研究的英國科學(xué)家約翰·肯德魯（John Kendrew）從鯨肌紅蛋白入手，對肌紅蛋白晶體的X射線衍射斑點進行分析。鑒于整個衍射圖涉及到幾萬個衍射斑點，他使用了當時最先進的計算機，確定了肌紅蛋白分子約2 600個原子的空間位置，并于1958年完成了肌紅蛋白結(jié)構(gòu)的模型。佩魯茨從1937年開始便將研究重心放在血紅蛋白的結(jié)構(gòu)上，并在1958年完成了血紅蛋白分辨率較低的三維結(jié)構(gòu)的測定。由于肯德魯和佩魯茨杰出的貢獻，他們分享了1962年的諾貝爾化學(xué)獎。在獲得諾貝爾化學(xué)獎后，佩魯茨繼續(xù)研究血紅蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。1967年，佩魯茨完成了對血紅蛋白的高分率測定。這項工作從開始到完成歷時30年，終于畫上了圓滿句號［9］。血紅蛋白空間結(jié)構(gòu)的測定，使科學(xué)家對血紅蛋白功能的了解更加深入。早在1938年，豪若威茲（Felix Haurowitz）就發(fā)現(xiàn)氧合血紅蛋白與脫氧血紅蛋白的晶體在結(jié)構(gòu)上有差異［10］。1962年，佩魯茨等通過將脫氧血紅蛋白與氧合血紅蛋白的晶體比較后發(fā)現(xiàn)，氧合血紅蛋白與脫氧血紅蛋白的空間結(jié)構(gòu)不同。在有氧條件下，血紅蛋白的四級結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化，2個α、β二聚體之間可以做相對位置的移動，氧合血紅蛋白比脫氧血紅蛋白的結(jié)合更加緊密。當氧合血紅蛋白失去氧時，它又緩慢地重新恢復(fù)到脫氧血紅蛋白的構(gòu)象。由于血紅蛋白與氧的這種相互運動猶如肺的呼吸運動，因此有人稱之為“分子肺”。1970年，佩魯茨進一步發(fā)現(xiàn)，血紅蛋白構(gòu)象之間的互變有利于與氧的結(jié)合和釋放。當?shù)?個氧分子與血紅素上的鐵原子結(jié)合后，會促進其他氧分子與這個血紅蛋白中其他血紅素上的鐵原子結(jié)合；同樣，當?shù)?個氧分子從血紅素上釋放以后，會促進其他氧分子從這個血紅蛋白的其他血紅素上的釋放。但這種效應(yīng)在單聚體和二聚體中都不發(fā)生，只有四聚體通過構(gòu)象變化才表現(xiàn)這種協(xié)同作用。血紅蛋白的構(gòu)象就是這樣在氧分壓高或低時進行亞基的運動，循環(huán)往復(fù)地進行［11］。25年后，約克大學(xué)蓋·多德森（Gug Dodson）教授的研究生瑪森姆·保利（Massime Paoli）證實了這一結(jié)論［12］。在評價佩魯茨的貢獻時，科學(xué)界認為，如果說DNA雙螺旋的發(fā)現(xiàn)標志著現(xiàn)代生物學(xué)的開始，血紅蛋白分子結(jié)構(gòu)的解析則標志著分子生物學(xué)的開端，佩魯茨被Nature等雜志尊稱為 “分子生物學(xué)之父”［13］。

還需要指出的是，20世紀90年代，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)血紅蛋白中亞鐵血紅素附近的三級結(jié)構(gòu)變化會引起二聚體間作用力的變化，進而導(dǎo)致四級結(jié)構(gòu)發(fā)生可逆性的改變，并形成低氧合力和高氧合力之間的平衡［14］。近幾年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，高海拔蜂鳥高親和性的血紅蛋白主要是由于2個氨基酸位置的突變，改變了血紅蛋白與氧的結(jié)合能力［15］?？傊?，血紅蛋白是脊椎動物高海拔低氧適應(yīng)代謝通路上最重要、研究最多的功能蛋白，其本身的結(jié)構(gòu)功能進化也代表一定的脊椎動物進化規(guī)律。

圖1 血紅蛋白變構(gòu)平衡下的可逆氧結(jié)合（仿Projecto等［15］）

綜上所述，血紅蛋白研究的歷史是生物化學(xué)和分子生物學(xué)發(fā)展的一個微觀縮影。有關(guān)它的每一項研究，都見證了生物化學(xué)和分子生物學(xué)的進步，折射了近、現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展歷程。生物化學(xué)與分子生物學(xué)既是生命科學(xué)的基礎(chǔ)，又是生命科學(xué)的前沿，是目前自然科學(xué)中發(fā)展最迅速、最具活力的前沿領(lǐng)域，二者在分子水平探討生命的本質(zhì)，前者側(cè)重于代謝與生理功能的聯(lián)系，后者側(cè)重于研究生命大分子的結(jié)構(gòu)和功能。因此，分子生物學(xué)是從生物化學(xué)中深化和延伸出的一門重要的前沿學(xué)科，尤其是在分子生物學(xué)發(fā)展初期，對血紅蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究起到了先導(dǎo)作用。

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