錢哲+陳海燕+黃清+黃靈+劉國軍+唐雄林+黃建敏

【摘要】目的研究基因SCN1A rs3812718多態(tài)性與桂西地區(qū)難治性癲癇（RE）的關(guān)系。

方法收集診斷明確并且規(guī)范化治療的桂西地區(qū)癲癇患者109例，根據(jù)RE的診斷標(biāo)準(zhǔn)將其分為RE組（38例）和非RE組（71例）。利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDITOFMS）技術(shù)檢測患者外周血基因SCN1A rs3812718 的多態(tài)性，評估兩組患者不同基因型和等位基因與難治性癲癇患病風(fēng)險的關(guān)聯(lián)性。

結(jié)果RE組AA、GA、GG基因型分別占5.3%、52.6%、42.1%，非RE組分別占9.9%、38.0%、52.1%，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。RE組患者rs3812718等位基因A、G頻率分別占31.6%、68.4%，非RE組A、G頻率分別占28.9%、71.1%，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），兩組患者不同基因模型比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

結(jié)論未發(fā)現(xiàn)基因SCN1A rs3812718 多態(tài)性與桂西地區(qū)RE易感性有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】SCN1A基因；基因多態(tài)性；難治性癲癇；桂西地區(qū)

中圖分類號：R742.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：ADOI：10.3969/j.issn.10031383.2017.02.001

【Abstract】ObjectiveTo study correlation between polymorphism of gene SCN1A rs3812718 and human refractory epilepsy（RE） in western Guangxi.

Methods109 cases of epilepsy with clear diagnosis and standardized treatment in western Guangxi were collected and divided into RE group （38 cases） and non RE group （71 cases） according to the diagnostic criteria of RE.MatrixAssisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry（MALDITOFMS） was used to detect polymorphism of gene SCN1A rs3812718 in peripheral blood，and correlation between different genotypes and alleles with the risk of RE in the two groups was evaluated.

ResultsAA，GA and GG genotypes in the RE group accounted for 5.3%，52.6%，and 42.1%，respectively，and that of the non RE group accounted for 9.9%，38.0% and 52.1%，respectively，difference was not statistically significant（P>0.05）.Allele A and G frequency of rs3812718 in the RE group accounted for 31.6% and 68.4% respectively，and that of the non RE group accounted for 28.9% and 71.1% respectively，difference was not statistically significant（P>0.05）.Difference of different gene models between the two groups was not statistically significant（P>0.05）.

ConclusionNo relation between polymorphism of gene SCN1A rs3812718 and susceptibility to RE in western Guangxi is found.

【Key words】gene SCN1A；genetic polymorphism；RE；western Guangxi

癲癇是一種以神經(jīng)元異常放電導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常的疾病，近年來盡管在藥物治療方面取得巨大進(jìn)步，開發(fā)很多抗癲癇新藥，但是仍有30%左右癲癇患者對抗癲癇藥物（antiepileptic drugs， AEDs）不敏感甚至耐受，發(fā)展為難治性癲癇（refractory epilepsy，RE），原因在于RE的耐藥機(jī)制不完全清楚[1]。研究表明癲癇發(fā)病機(jī)制是編碼電壓門控性Na+通道的相關(guān)基因突變所致，其中與編碼α亞基的SCN1A 基因突變的關(guān)系非常密切，如Dravet綜合征 （DS）、全身泛化性癲癇伴發(fā)熱綜合征（GEFS+）等發(fā)病機(jī)制與SCN1A 基因突變密切相關(guān)?；騍CN1A rs3812718突變可直接導(dǎo)致不同類型、輕重程度不同的癲癇[2～3]，可能導(dǎo)致控制癲癇所需的藥物劑量增加[4]，甚至造成對某些抗癲癇藥物抵抗[5]，但也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)突變與癲癇耐藥無關(guān)[6]。既往研究發(fā)現(xiàn)桂西地區(qū)癲癇發(fā)病率及患病率均高于全國平均水平，農(nóng)村地區(qū)占 2/3[7]。為了進(jìn)一步探討該地區(qū)癲癇發(fā)病的原因，有效地開展預(yù)防工作，本研究利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDITOFMS）技術(shù)分析研究電壓門控性Na+通道基因SCN1A rs3812718多態(tài)性與桂西地區(qū)RE易感性的關(guān)系。

1資料與方法

1.1研究對象

選取2015年1月至2016年8月就診于右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的住院或門診癲癇患者109例。入組標(biāo)準(zhǔn)：①符合國際抗癲癇聯(lián)盟 2001年制定的癲癇和癲癇綜合征的分類標(biāo)準(zhǔn)[8]， 根據(jù)發(fā)作類型選擇適合的AEDs治療，藥物種類不做要求；②桂西地區(qū)戶籍；③規(guī)范化的AEDs治療；④自愿同意進(jìn)入本研究，簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①暈厥、假性癲癇發(fā)作、低血糖、發(fā)作性睡病等發(fā)作性疾病；②存在腦腫瘤、進(jìn)行性加重的腦部疾病和神經(jīng)系統(tǒng)退行性變；③合并嚴(yán)重心、肝、腎等重要器官功能障礙者；④有精神病史或家族史；⑤明顯的智力障礙患者。RE診斷標(biāo)準(zhǔn)：按照患者的發(fā)作類型，適當(dāng)?shù)牡谝痪€抗癲癇藥物規(guī)范治療且藥物的血藥濃度在有效范圍內(nèi)，仍不能控制發(fā)作且影響日常生活，無進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或占位性病變。按照RE標(biāo)準(zhǔn)分為RE組和非RE組，其中RE組38例，非RE組71例。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取

抽取患者外周靜脈血3 ml于血清管中，經(jīng)3500 rpm離心5 min，用下層血凝塊提取 DNA，放置-80℃保存，并采用紫外分光光度儀測定DNA純度，其A260/A280范圍在1.6至2.0之間。

1.2.2PCR擴(kuò)增及純化

Pubmed中檢索基因SCN1A的全序列，使用Assay Designer（Sequenom）軟件設(shè)計引物，rs3812718前后引物分別為：5ACGTTGGATGTCAGCTCTTCGCACTTTCAG3和5ACGTTGGATGGTGACGTACCTGTAATAGGG3。PCR反應(yīng)體系：所需DNA樣本稀釋至20 ng/μL，取1 μL DNA樣本，并與1.850 μL水、0.325 μL的25 mmol/L MgCl2、0.625 μL PCR緩沖液（含15 mmol/L MgCl2）、0.100 μL的25 mmol/L dNTP、1 L PCR引物以及0.1 μL HotStar Taq（Qiagen）酶混合在一起。PCR反應(yīng)條件為94℃ 5 min，94℃ 20 s，56℃ 30 s，進(jìn)行45個循環(huán)，最后72℃ 3 min。PCR擴(kuò)增后，剩余的dNTP將被去磷酸降解，反應(yīng)體系包括1.53 μL水、0.17 μL SAP緩沖液、0.3單位堿性磷酸酶（Sequenom）。該反應(yīng)在37℃進(jìn)行20 min，而后85℃ 5 min，最終使酶失去活性。

1.2.3延伸反應(yīng)

SCN1A rs3812718特異的延伸引物為：5GCCTATCCTTTACTCTAATCACTT3，反應(yīng)體系：0.619 μL水、0.2iPLEX緩沖液、0.2 μL終止混合物、0.940 μL 延伸引物（Sequenom）。在94℃ 30 s，94℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃ 5 s，進(jìn)行5個步驟，共行40次循環(huán)后，產(chǎn)物于72℃ 3 min。在最終反應(yīng)產(chǎn)物里均勻填充陽離子交換樹脂（Sequenom）脫鹽，混合后加入16 μL懸浮。

1.2.4樣本分析

使用MassARRAY Nanodispenser RS1000點(diǎn)樣機(jī)（Sequenom）將最終的分型產(chǎn)物點(diǎn)樣于384孔spectroCHIP bioarray芯片（Sequenom）上，將點(diǎn)樣后的SpectroCHIP芯片使用MALDITOFMS技術(shù)對基因多態(tài)性進(jìn)行檢測，最終由MassARRAY Typer4.0軟件系統(tǒng)完成基因分型分析。

1.2.5等位基因判別

通過MALDITOFMS檢測，計算產(chǎn)物峰值與相應(yīng)的引物峰值之間的質(zhì)荷比，得知所延伸的類型，可推斷該位點(diǎn)的基因型。見表1。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)評估 RE組與非RE組以及所有患者基因型的分布是否符合HardyWeinberg平衡（HWE）；應(yīng)用Pearson χ2檢驗(yàn)，比較兩組患者基因型頻率和等位基因頻率的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2結(jié)果

2.1基因型特征質(zhì)譜圖

基因SCN1A rs3812718的雜合子GA型在G和A等位基因處均有信號強(qiáng)度峰，純合的GG、AA基因型則只在G、A等位基因處有信號強(qiáng)度峰值。見圖1。

2.2HardyWeinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

分別對基因SCN1A rs3812718在RE組、非RE組所有患者中的基因型頻率分布進(jìn)行HWE檢驗(yàn)，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），結(jié)果各基因型的分布頻率符合HWE，說明選取的樣本具有代表性。見表2。

2.3基因SCN1A rs3812718基因型分布和等位基因頻率比較

RE組與非RE組基因SCN1A rs3812718基因型分布比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），兩組基因SCN1A rs3812718等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表3。分別比較RE組與非RE組患者每個基因型別，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；單獨(dú)比較兩組患者中基因型AA和GG，亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

3討論

癲癇發(fā)病機(jī)制的功能學(xué)核心是神經(jīng)元異常放電，而電壓門控性Na+通道結(jié)構(gòu)和功能改變在神經(jīng)元動作電位產(chǎn)生與傳播過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，是神經(jīng)元異常放電的電生理學(xué)基礎(chǔ)，與癲癇發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。電壓門控性Na+通道由一個α大亞基和兩個β小亞基構(gòu)成的跨膜蛋白，α大亞基是具有高度保守遺傳性的功能性亞基，β亞基只有通過與α亞基結(jié)合才具有Na+通道活性作用，為此對電壓門控性Na+通道的研究主要集中在α亞基。目前已鑒定出人類的α亞基有9種不同的異構(gòu)體，即編碼基因SCN1A、SCN2A、SCN3A、SCN4A、SCN5A、SCN8A、SCN9A、SCN10A、SCN11A。SCN1A是電壓門控性Na+通道α亞基的編碼基因，定位于2號染色體長臂（2q24.3），該基因的突變可改變Na+通道的結(jié)構(gòu)和功能，直接造成癲癇的發(fā)生或是影響抗癲癇藥對神經(jīng)細(xì)胞作用，導(dǎo)致難治性癲癇形成[9]。國內(nèi)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，SCN1A IVS5N+5G>A基因多態(tài)性與卡馬西平耐藥性癲癇有關(guān)，提示 SCN1A IVS5N+5G>A基因突變可能通過改變鈉通道蛋白的表達(dá)，使得卡馬西平作用靶點(diǎn)功能下降， 從而導(dǎo)致卡馬西平治療無效或者有效治療劑量的改變[10]；國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，SCN1A IVS5N+5G>A 突變純合子需要更高的卡馬西平劑量治療，或治療無效[11]；對漢族癲癇患者研究發(fā)現(xiàn) SCN1A 基因第 5 外顯子的SNP rs3812718的點(diǎn)突變與卡馬西平治療個體差異存在一定關(guān)系，同時發(fā)現(xiàn)亞洲人該位點(diǎn)突變發(fā)生率較高[4]。這些研究結(jié)果表明SCN1A 基因多態(tài)性與癲癇的難治性密切相關(guān)，同時該基因突變可能與種族、地域的差異有關(guān)。

關(guān)于基因SCN1A rs3812718多態(tài)性與RE的關(guān)系，目前尚存在爭議。既往有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，若想控制癲癇的發(fā)作，基因SCN1A rs3812718的AA型癲癇患者往往較GG型患者需要服用更多的卡馬西平，并得出了SCN1A rs3812718 A等位基因治療癲癇的藥物維持劑量應(yīng)大于G等位基因的患者[4]。但是更多學(xué)者的研究結(jié)果并沒有發(fā)現(xiàn)SCN1A rs3812718與耐藥性存在關(guān)系[12]。有研究在同一樣本、不同的基因模型下會得出不同結(jié)論的情況[13]。之所以存在這些研究結(jié)果，可能是因?yàn)榇嬖跇颖玖?、種族、實(shí)驗(yàn)方法、病例納入標(biāo)準(zhǔn)等條件不同。本研究中，采用國際認(rèn)可的RE診斷標(biāo)準(zhǔn)，觀察和分析了38位RE患者、71位非RE患者SCN1A rs3812718基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)RE組中GG基因型、G等位基因頻率雖然高于非RE組，AA基因型、A等位基因頻率低于非RE組，但通過統(tǒng)計學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這些差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，不同基因模型下同樣未發(fā)現(xiàn)有統(tǒng)計學(xué)差異，本研究結(jié)果提示，基因SCN1A rs3812718多態(tài)性與桂西地區(qū)RE的發(fā)生可能不存在聯(lián)系。但是考慮到桂西地區(qū)為多民族聚居地、氣候?qū)賮啛釒?，每年五、六月份持續(xù) 38℃高溫，大量鋁土礦開采，露天暴露，造成嚴(yán)重的空氣污染，基于這些地理環(huán)境、氣候條件、民族分布等基因突變可能存在較大影響，如果要得到更可靠的結(jié)論，必須擴(kuò)大樣本、細(xì)分民族，分析氣候環(huán)境的影響，以全面深入了解各種因素作用的方式及效應(yīng)，才有可能闡明發(fā)病機(jī)制，有效地開展預(yù)防工作。

參考文獻(xiàn)

[1]錢哲，黃建敏.難治性癲癇發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展[J].右江醫(yī)學(xué)，2016，44（4）：450453.

[2]Fry AE，Rees E，Thompson R，et al.Pathogenic copy number variants and SCN1A mutations in patients with intellectual disability and childhoodonset epilepsy[J].BMC Med Genet，2016，17（1）：34.

[3]Daci A，Beretta G，Vllasaliu D，et al.Polymorphic Variants of SCN1A and EPHX1 Influence Plasma Carbamazepine Concentration，Metabolism and Pharmacoresistance in a Population of Kosovar Albanian Epileptic Patients[J].PLoS One， 2015，10（11）：e0142408.

[4]Zhou BT，Zhou QH，Yin JY，et al.Comprehensive analysis of the association of SCN1A gene polymorphisms with the retentionrate of carbamazepine following monotherapy for newonset focal seizures in the Chinese Han population[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2012，39（4）：379384.

[5]Abe T，Seo T，Ishitsu T，et al.Association between SCN1A polymorphism and carbamazepineresistant epilepsy[J].Br J Clin Pharmacol，2008，66（2）：304307.

[6]Manna I，Gambardella A，Bianchi A，et al，A functional polymorphism in the SCN1A gene does not influence antiepileptic drug responsiveness in Italian patients with focal epilepsy[J].Epilepsia， 2011，52（5）：e4044.

[7]黃瑞雅，解繼勝，李雪斌，等.廣西桂西壯族癲癇患者生活質(zhì)量調(diào)查[J].中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院學(xué)報，2007，29（1）：103106.

[8]EngelJ Jr，International League Against Epilepsy （ILAE）.A proposed diagnostic scheme for people with epileptic seizures and with epilepsy：report of the ILAE Task Force on Classification and Terminology[J].Epilepsia，2001，42（6）：796803.

[9]Tang L，Lu X，Tao Y，et al.SCN1A rs3812718 polymorphism and susceptibility to epilepsy with febrile seizures：a metaanalysis[J].Gene，2014，533（1）：2631.

[10]趙昕，何周康，張晶，等.SCN1A基因多態(tài)性與卡馬西平治療兒童癲癇療效的關(guān)系[J].兒科藥學(xué)雜志，2011，17（1）：2628.

[11]Menzler K，Hermsen A，Balkenhol K，et al.A common SCN1A splicesite polymorphism modifies the effect of carbamazepine on corticalexcitabilitya pharmacogenetic transcranial magnetic stimulation study[J].Epilepsia，2014，55（2）：362369.

[12]Haerian BS，Baum L，Kwan P，et al.SCN1A，SCN2A and SCN3A gene polymorphisms and responsiveness to antiepileptic drugs：a multicenter cohort study and metaanalysis[J].Pharmacogenomics，2013，14（10）：11531166.

[13]Angelopoulou C，Veletza S，Heliopoulos I，et al.Association of SCN1A gene polymorphism with antiepileptic drug responsiveness in the population of Thrace，Greece[J].Arch Med Sci，2017，13（1）：138147.

（收稿日期：2017-02-24修回日期：2017-04-07）

（編輯：梁明佩）

基金項目：廣西自然科學(xué)基金（2014GXNSFAA118215）

作者簡介：錢哲，男，在讀碩士研究生，研究方向：難治性癲癇的基礎(chǔ)與臨床。Email：342837827@qq.com

通信作者：黃建敏。Email：bshuangjianmin@126.com