駱靈喜+李彬輝+林秋月+王波

摘要：為探索微囊藻抵抗短時超聲波表達調(diào)控相關(guān)蛋白質(zhì)，應用雙向電泳技術(shù)對微囊藻短時超聲波處理蛋白質(zhì)表達進行分析，結(jié)果表明，71個蛋白質(zhì)點上調(diào)，56個蛋白質(zhì)點下調(diào)，54個新增蛋白質(zhì)點，21個消失蛋白質(zhì)點。對其中8個差異大的蛋白質(zhì)點采用MALDA-TOF-MS進行質(zhì)譜分析，并經(jīng)數(shù)據(jù)庫搜索匹配，鑒定出2個未知蛋白、6個功能蛋白。這些功能蛋白參與抗氧化和抗炎癥、磷酸鹽合成、電子傳遞等生理過程，實現(xiàn)微囊藻在短時超聲波脅迫下的代謝平衡和自我保護。

關(guān)鍵詞：微囊藻；短時超聲波；蛋白表達；雙向電泳

中圖分類號：X703 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）07-1366-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.07.043

Differentially Expressed Proteome of Microcystis under Short-time Ultrasound Stress

LUO Ling-xi1，2，LI Bin-hui1，2，LIN Qiu-yue1，2，WANG Bo1

（1.Peking University Shenzhen Research Institute，Shenzhen 510008， China；2.Shenzhen-Hongkong Institution of Industry，Education & Research Environmental Engineering Technique Co.，Ltd.，Shenzhen 510008， China）

Abstract：In order to explore the regulation mechanism for key protein expression， the Microcystis treated by short-time ultrasound were used to analyze the total protein based on 2DE. Results showed that 71 upregulated protein spots，56 downregulated protein spots，54 new adding protein spots and 21 protein spots disappeared under short-time ultrasound stress. Eight differential proteins were chosen for further MALDI-TOFTOF/MS analysis， the results showed that 2 unknown proteins and 6 functional proteins were detected. These proteins were relevant to some physiology procedures，such as antioxidant，anti-inflammatory，synthesis of phosphate and electron transfer，which were beneficial for the metabolism balance and self-protection under short-time ultrasound stress.

Key words：microcystis；short-time ultrasound；protein-expression；two-dimensional electrophoresis

近年來，隨著水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象的日趨嚴重，對于飲用水源較為單一且緊缺的城市飲用水生產(chǎn)影響很大，首先，高藻源水會堵塞濾池，增加反沖洗次數(shù)和藥耗；其次會縮短管網(wǎng)的使用年限，增加配水動力費用；更重要的是，一些產(chǎn)毒素水華藻類（如微囊藻）會釋放出藻毒素，長期攝入容易引發(fā)肝癌、腸癌等疾病，嚴重威脅人體的健康[1，2]。盡管目前已經(jīng)開發(fā)出多種治理藍藻水華的措施，包括物理打撈、噴灑化學除藻劑、黏土絮凝以及生物操縱等，但是這些除藻方法在經(jīng)濟性、安全性和高效性等方面仍存在局限性，甚至會造成二次污染。而超聲波除藻由于其操作簡便、能耗低、無二次污染等特點被認為是極具潛力的治藻技術(shù)，同時也是近年來的研究熱點[3，4]。

目前國內(nèi)外的研究均證明，超聲波處理方法可以有效抑制藻類繁殖，且與其他除藻方法有機結(jié)合能夠達到更理想的抑藻效果[5-8]。特別對于具有偽空泡的藍藻，超聲波處理對其的抑制作用更為明顯。研究顯示在超聲波輻射后，微囊藻的沉降率明顯高于其他藻類[9]，研究普遍認為由于微囊藻內(nèi)部存在大量氣囊，受到超聲波的空化效應作用，內(nèi)部氣囊產(chǎn)生巨大壓力而破裂，導致其失去浮力調(diào)節(jié)功能，最終下沉[10]。然而超聲波對微囊藻的抑制作用不僅僅體現(xiàn)在簡單的物理沉降作用，更是一個復雜而緩慢的生理生化作用過程。近年來，關(guān)于超聲波對銅綠微囊藻細胞生理生化特性影響的研究報道較少，僅有的研究認為超聲波能夠有效破壞藻細胞吸收光能的天線復合物和葉綠素，減慢光合作用，從而抑制細胞生長[11]，并且誘導藻細胞發(fā)生脂膜過氧化反應，增加膜透性[9]。但是針對微囊藻抵御短時超聲波脅迫的分子生物學應激反應機理的研究鮮見報道，在分子水平研究短時超聲波對微囊藻蛋白質(zhì)表達的影響機理了解甚少，一定程度上減緩了超聲波除藻技術(shù)的發(fā)展。因此，本試驗以長時間超聲波對藻類聚集性和沉降性的作用機理作為參考，在此基礎(chǔ)上，進一步將短時超聲波作為藻類的脅迫因素，從分子生物學水平研究其引起的微囊藻蛋白質(zhì)表達量和種類的差異，為確定短時超聲波強化混凝除藻技術(shù)的作用機理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種及培養(yǎng)

試驗選用的銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）是中國富營養(yǎng)化湖庫最常見的水華藍藻之一。藻種購于中國科學院水生生物研究所，編號FACHB-905，為產(chǎn)毒種類。培養(yǎng)溫度27±1 ℃，光暗比12 L∶12 D，光照度36 μE/（m2·s），培養(yǎng)時間7 d，培養(yǎng)基為高壓滅菌的BG-11培養(yǎng)基[12]。

1.2 試驗裝置

主要設備：JY92-IIN型超聲細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；IPGhor型等電聚焦儀、DALT-SIX SDS-PAGE型電泳儀、ImageScanner掃描儀（GE Healthcare）。

其他設備：GZP-250型光照培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設備有限公司）；LDZ-50KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械有限公司）；TG16-WS型高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 短時超聲波處理 采用BG-11培養(yǎng)基將菌種樣品稀釋到適當濃度，然后將超聲波探頭放入菌液中，進行80 kHz、60 W超聲波處理5 s。

1.2.2 蛋白提取及測定 取適量菌樣，加入1 mL蛋白質(zhì)裂解液（PL039），進行超聲波破碎（100 W，2 s，3 min），離心（4 ℃，12 000 r/min，30 min）去除沉淀，加1 mL預冷丙酮（-20 ℃沉淀過夜），離心（4 ℃，12 000 r/min，30 min）去除上清液，晾干沉淀，加入500 μL蛋白質(zhì)裂解液（PL039），最后使用非干擾型蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒（SK3071）進行定量測定。

1.2.3 雙向電泳

1）第一向等電聚焦電泳。主要參照Bio-Rad等電聚焦系統(tǒng)操作指南進行，取400 μg蛋白質(zhì)樣品，加上樣液（9 mol/L尿素，4% CHAPS，2%IPG緩沖液，40 mmol/L DTT，40 mmol/L Trisbase）至終體積450 μL，放入標準型膠條槽中。將17 cm IPG膠條膠面朝下覆蓋在樣品上，室溫吸收1 h后，加2 mL礦物油覆蓋。20 ℃下水化14 h，以50 μA電流和20 ℃聚焦溫度進行等電聚焦電泳。

2）第二向SDS-PAGE電泳。等點聚焦結(jié)束后，膠條依次在平衡液Ⅰ（含6 mol/L尿素，2%SDS，0.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，30%甘油，0.25%溴酚藍，5%DTT）和平衡液Ⅱ（含6 mol/L尿素，2%SDS，0.5 mol/L Tris-HCl，pH 8.8，30%甘油，0.25%溴酚藍，5.5%IAA）中各平衡15 min后進行電泳。電泳后銀染顯色。

1.2.4 圖像掃描和分析 通過ImageScanner掃描儀獲取電泳圖像，采用PDquest 8.0軟件進行分析。對圖像進行背景消減、斑點檢測、凝膠匹配，檢出的蛋白質(zhì)點進行歸一化處理，相同位置的染色點進行豐度分析，通過軟件計算蛋白質(zhì)含量變化比值，變化比值在2倍以上的蛋白質(zhì)點視為表達差異點。

1.3 MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析與數(shù)據(jù)檢索

制備好樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司進行質(zhì)譜檢測，檢測儀器為Bruker Autofle MALDT-TOF-MS質(zhì)譜儀。數(shù)據(jù)檢索：質(zhì)譜峰人工去除胰酶自切峰和角蛋白峰的污染后，將數(shù)據(jù)在網(wǎng)站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov上進行搜索匹配。

2 結(jié)果及分析

2.1 蛋白質(zhì)雙向電泳分析

采用雙向電泳技術(shù)對經(jīng)過短時超聲波處理的微囊藻總蛋白質(zhì)進行分離，獲得背景清晰且分離效果較好的2-DE圖譜（圖1、圖2）。經(jīng)過軟件PDquest 8.0分析，短時超聲波處理的蛋白質(zhì)雙向電泳凝膠圖譜和對照組的顯著蛋白質(zhì)差異點有127個，其中56個蛋白質(zhì)點下調(diào)，71個蛋白質(zhì)點上調(diào)，另外有54個新增蛋白質(zhì)點，21個消失蛋白質(zhì)點。

2.2 差異表達蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜鑒定

選取其中豐度大于2、分離效果清晰的26個差異蛋白質(zhì)點進行質(zhì)譜鑒定，鑒定成功的有8個，質(zhì)譜鑒定結(jié)果見表1，其中有2個未知蛋白質(zhì)和6個功能蛋白質(zhì)。這些功能蛋白質(zhì)參與抗氧化和抗炎癥、磷酸鹽合成、電子傳遞等多個生理過程，實現(xiàn)微囊藻在短時超聲波脅迫下的代謝平衡和自我保護。

3 討論

3.1 與抗氧化、抗炎癥相關(guān)的蛋白

藻青蛋白α亞基片段。藻青蛋白質(zhì)是藍綠藻內(nèi)的藍色素，在活的藻細胞內(nèi)，藻青蛋白質(zhì)是蛋白質(zhì)存儲單位和抗氧化劑，防止細胞受到某些波長的傷害。有研究表明，藻青蛋白質(zhì)有較強的抗氧化和抗炎癥特性，在多種炎癥動物模型內(nèi)，藻青蛋白質(zhì)可以減少或預防炎癥。當微囊藻受到超聲波脅迫時，藻青蛋白α亞基片段呈現(xiàn)出明顯的差異表達，通過其抗氧化和抗炎癥等特性，對微囊藻起到自我修復和保護的作用。

3.2 與光合作用相關(guān)的蛋白

1，5-二磷酸核酮糖合成酶亞基。1，5-二磷酸核酮糖是在光合作用中的卡爾文循環(huán)里起重要作用的一種五碳糖。植物體內(nèi)的酶用1，5-二磷酸核酮糖作為底物來固定二氧化碳，生成六碳磷酸鹽，這種高度不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物最終分解為兩分子的甘油3磷酸。當微囊藻受到超聲波脅迫時，可能其光合作用受到影響，從而造成該合成酶亞基出現(xiàn)差異表達。

3.3 與電子傳遞相關(guān)的蛋白

光系統(tǒng)PSⅠ復合體蛋白亞基。PSⅠ是光合電子傳遞鏈的一部分，位于類囊體膜的間質(zhì)部分。當受到超聲波脅迫時，光合電子的傳遞可能受到影響，從而引起該蛋白質(zhì)的較大差異表達。

參考文獻：

[1] CHORUS I，BARTRAM J.Toxic cyanobacteria in water：A guide to their public health concequences， monitoring and management[M].London：E and FN Spon，1999.

[2] DE FIGUEIIREDO D R，AZEITEIIRO U M，ESTEVES S M，et al. Microcystin-producing bloom-a serious global public healthy issue[J].Ecotoxicol Environ Safety，2004，59：151-163.

[3] ZHANG G，ZHANG P，WANG B，et al. Ultrasonic frequency effects on the removal of Microcystis aeruginosa[J].Ultrasonics Sonochemistry，2006，13（5）：446-450.

[4] 邵路路，陸開宏，朱津永，等.低強度超聲波抑制銅綠微囊藻生長的研究[J].生態(tài)科學，2012，31（4）：413-417.

[5] NAKANO K，LEE T J，MATSUMURA M. In situ algal bloom control by the integration of ultrasonic radiation and jet circulation to flushing[J].Environmental Science & Technology，2001， 35（24）：4941-4946.

[6] ZHANG G，ZHANG P，F(xiàn)AN M. Ultrasound-enhanced coagulation for Microcystis aeruginosa removal[J].Ultrasonics Sonochemistry，2009，16（3）：334-338.

[7] HENG L，JUN N，WEN J H，et al. Algae removal by ultrasonic irradiation-coagulation[J].Desalination，2009，239（1）：191-197.

[8] 陸貽超，王國祥，李仁輝.超聲波和改性黏土集成技術(shù)在去除藍藻水華上的應用[J].湖泊科學，2010，22（3）：421-429.

[9] TANG J W，WU Q Y，HAO H W，et al. Effect of 1.7 MHz ultrasound on a gas-vacuolate cyanobacterium and a gas-vacuole negative cyanobacterium[J].Colloids and Surfaces B： Biointerfaces，2004，36（2）：115-121.

[10] HAO H，WU M，CHEN Y，et al. Cavitation mechanism in cyanobacterial growth inhibition by ultrasonic irradiation[J]. Colloids and Surfaces B：Biointerfaces，2004，33（3）：151-156.

[11] ZHANG G，ZHANG P，LIU H，et al. Ultrasonic damages on cyanobacterial photosynthesis[J].Ultrasonics Sonochemistry，2006， 13（6）：501-505.

[12] 鄭朔方，楊蘇文，金相燦.銅綠微囊藻生長的營養(yǎng)動力學[J].環(huán)境科學，2005，26（2）：152-156.