丁玉惠，蔣霞敏，張澤凌，韓慶喜，梁晶晶

(寧波大學 海洋學院，浙江 寧波 315211)

生物工程

二次培養(yǎng)對大龍骨藻總脂、EPA及PUFA含量的影響

丁玉惠，蔣霞敏，張澤凌，韓慶喜，梁晶晶

(寧波大學 海洋學院，浙江 寧波 315211)

為探究二次培養(yǎng)(低溫和高光照強度脅迫)對大龍骨藻(Tropidoneismaxima)總脂、EPA及PUFA 含量的影響，將大龍骨藻置于適宜條件(溫度25℃，光照強度36 μmol/(m2·s)，鹽度25)下培養(yǎng)10 d后，采用單因子試驗，在低溫(10℃)或高光照強度(80 μmol/(m2·s))條件下進行二次培養(yǎng)，并進一步進行低溫、高光照強度二因子三水平二次培養(yǎng)試驗。結果表明：二次培養(yǎng)最佳時間為3 d；低溫10℃有利于EPA和PUFA積累，分別可達(28.48±0.47)%和(43.28±1.06)%；光照強度80 μmol/(m2·s)有利于總脂、EPA和PUFA積累，分別可達(43.19±1.29)%、(27.11±0.25)% 和(41.78±0.22)%；在低溫10℃、高光照強度80 μmol/(m2·s)交互作用下更有利于總脂、EPA、PUFA積累，分別可達(42.99±2.51)%、(32.83±0.58)%和(46.43±0.22)%。綜上所述，二次培養(yǎng)方式有利于藻生長和油脂積累達到較高水平，為提高微藻產(chǎn)油量提供了一種新的培養(yǎng)方法，值得深入研究。

大龍骨藻；二次培養(yǎng)；總脂；EPA；PUFA

近年來產(chǎn)油微藻由于生長快速、產(chǎn)油量高[1]，可以在短期內獲得大量油脂而成為生物能源開發(fā)的重點[2]。同時因其油脂中所含的高不飽和脂肪酸是人類及動物的生理活性物質[3]，因此如何提高微藻的油脂含量成為了一項重要的研究。大部分含油微藻通過光合作用依靠還原戊糖磷酸途徑(C3途徑)[4]將H2O、CO2及無機鹽轉化為油脂，其主要成分為甘油三酯(80%)和C14～C22的長鏈脂肪酸，是組成細胞膜結構、細胞代謝物及能量的來源[5-6]。培養(yǎng)環(huán)境的變化會影響細胞中酶的活性、脂肪酸的代謝速率以及細胞膜的流動性等，同時也影響藻細胞中的油脂積累量[7-10]，因此對培養(yǎng)環(huán)境的研究既可以提高產(chǎn)油微藻的生物量，還可以提高油脂的積累量。

大龍骨藻(Tropidoneismaxima)隸屬硅藻門、羽紋綱、舟形藻目、舟形藻科、龍骨藻屬，是新分離的海洋微藻，具有生長快、易收集、油脂含量高、EPA含量豐富等特點[11]，是較理想的產(chǎn)油微藻。但培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)該藻快速生長和油脂積累(特別是EPA)所適應的理化因子條件不同，生物量及油脂含量較難統(tǒng)一。

一般來說，理化因子對藻生長和油脂含量的影響分為“適宜模式”和“脅迫模式”[12]?！斑m宜模式”指在適宜生長的條件下能促進藻生物量提高[13-14]，而“脅迫模式”雖不利于藻快速生長，但能使油脂含量提高[15]。針對一次培養(yǎng)難以解決生物量與油脂含量的矛盾，我們提出了二次培養(yǎng)方法，即將微藻先置于最適環(huán)境中培養(yǎng)，至生長指數(shù)后期(達到最大生物量)迅速轉入脅迫環(huán)境下培養(yǎng)，以提高油脂積累量，使生物量及油脂含量均達到較高水平[16]。但不同微藻對脅迫因子適應能力不同，為探究大龍骨藻的富油的最佳脅迫因子，本試驗采用單因子試驗和正交試驗研究了低溫、高光照強度二次培養(yǎng)對大龍骨藻總脂、脂肪酸組成、EPA含量的影響，以期為大龍骨藻的規(guī)?；囵B(yǎng)和綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗藻種大龍骨藻是本實驗室從浙江漁山列島海域(121°30′～123°25′E、29°32′～31°04′N)拖網(wǎng)，水樣帶回實驗室，采用微吸管分離、純化得到，由寧波大學餌料生物培養(yǎng)室保藏。培養(yǎng)用水采用象山港天然海水，經(jīng)沙濾、暗沉淀、脫脂棉過濾和燒開冷卻。培養(yǎng)容器為3 L錐形瓶，培養(yǎng)水體各2 L。營養(yǎng)鹽：氮質量濃度26.5 mg/L，磷質量濃度2 mg/L，鐵質量濃度0.5 mg/L，硅質量濃度0.5 mg/L；接種藻密度5×104cell/mL，置于GXZ智能型光照培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)培養(yǎng)?？刂七m宜條件：溫度25℃，光照強度36 μmol/(m2·s)，光暗周期12 h∶12 h，鹽度25，pH 8.10。

1.2 試驗方法

1.2.1 低溫二次培養(yǎng)試驗

大龍骨藻在1.1適宜培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10 d，移入低溫10℃(低溫條件根據(jù)張澤凌等[15]溫度篩選確定)進行二次培養(yǎng)，設對照組(25℃)，各15個平行，培養(yǎng)時間4 d，每日定時取3個平行樣，測定藻的總脂含量及脂肪酸組成。

1.2.2 高光照強度二次培養(yǎng)試驗

大龍骨藻在1.1適宜培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10 d，移入高光照強度(80 μmol/(m2·s))(高光照強度條件根據(jù)張澤凌等[15]光照強度篩選確定)下進行二次培養(yǎng)，設對照組(36 μmol/(m2·s))，各15個平行，培養(yǎng)時間4 d，每日定時取3個平行樣，測定藻的總脂含量及脂肪酸組成。

1.2.3 低溫、高光照強度二因子二次培養(yǎng)試驗

采用低溫、高光照強度二因子三水平試驗。將1.1適宜培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10 d的大龍骨藻，進行二因子(光照強度和溫度)三水平二次培養(yǎng)試驗(見表1)，各3個平行，培養(yǎng)時間為3 d，試驗結束測定藻的總脂含量及脂肪酸組成，其他條件同1.1。

表1 二因子三水平二次培養(yǎng)試驗

1.2.4 總脂含量及脂肪酸組成的測定

1.2.4.1 樣品處理

試驗藻先靜放，去上清液，底部藻液離心(4 000 r/min)10 min，用蒸餾水洗滌，再離心，反復2次。將離心后得到的藻泥放入冰箱，-20℃下冷凍。1 d后進行冷凍干燥(FD5-3T立式冷凍干燥機，Gold-SIM)，稱重。

1.2.4.2 總脂含量測定

稱取100 mg左右的藻粉，采用改良后的 Bligh-Dyer法抽提總脂，分層后下層氯仿層旋轉蒸發(fā)至恒重，得到總脂含量。

1.2.4.3 脂肪酸組成測定

提取到的總脂加入5%～6%KOH-甲醇水溶液(體積比 4∶1)，14%BF3-甲醇溶液，進行皂化甲酯化[17-18]，采用QP2010氣相色譜-質譜分析儀(日本SHIMADZU公司)進行分析[19-20]，用面積歸一化法計算各脂肪酸相對含量。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)用“平均值±標準偏差”表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和Duncan多重比較分析(P=0.05)，利用Excel進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 低溫二次培養(yǎng)

2.1.1 低溫二次培養(yǎng)對大龍骨藻總脂含量的影響(見圖1)

注：不同小寫字母表示P<0.05水平下差異顯著。

圖1 低溫(10℃)二次培養(yǎng)對大龍骨藻總脂含量的影響

由圖1可知，低溫二次培養(yǎng)對大龍骨藻的總脂含量影響不顯著(P>0.05)。藻在10℃低溫培養(yǎng)條件下，隨著培養(yǎng)時間的延長，藻的總脂含量略有升高，在3 d時獲得最大總脂含量(39.10±0.34)%，但與對照組和其他組無顯著差異(P>0.05)。

2.1.2 低溫二次培養(yǎng)對大龍骨藻脂肪酸組成的影響(見表2)

由表2可知，低溫二次培養(yǎng)對大龍骨藻脂肪酸組成有顯著影響(P<0.05)。二次培養(yǎng)初期，脂肪酸含量開始改變。隨著培養(yǎng)時間的延長，EPA含量逐漸增加，在4 d時獲得最大EPA含量(28.65±0.21)%，顯著高于對照組的(25.38±1.31)%(P<0.05)，而與3 d時的含量無顯著差異(P>0.05)；DHA含量也隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸增加，在4 d達到最大值(4.77±0.30)%，顯著高于對照組的(3.28±0.77)%(P<0.05)；PUFA含量在3 d時達到最大值(43.28±1.06)%，與4 d時的含量無顯著差異(P>0.05)，而顯著高于對照組的(39.13±0.94)%(P<0.05)；n-3 PUFA含量在4 d時達到最大值(33.42±0.48)%，與3 d時的含量無顯著差異(P>0.05)，而顯著高于對照組的(27.66±0.87)(P<0.05)。

表2 低溫(10℃)二次培養(yǎng)對大龍骨藻主要脂肪酸組成的影響

2.2 高光照強度二次培養(yǎng)

2.2.1 高光照強度二次培養(yǎng)對大龍骨藻總脂含量的影響(見圖2)

圖2 高光照強度(80 μmol/(m2·s))二次培養(yǎng)

由圖2可知，高光照強度二次培養(yǎng)對大龍骨藻總脂含量有顯著影響(P<0.05)。大龍骨藻在高光照強度80 μmol/(m2·s)的培養(yǎng)條件下，總脂含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在3 d時的總脂含量達到最大(43.19±1.29)%，顯著高于對照組的(36.87±1.93)%和高光照強度處理1 d時的總脂含量(P<0.05)，而與2、4 d時的含量無顯著差異(P>0.05)。

2.2.2 高光照強度二次培養(yǎng)對大龍骨藻脂肪酸組成的影響(見表3)

表3 高光照強度(80 μmol/(m2·s))二次培養(yǎng)對大龍骨藻主要脂肪酸組成的影響

由表3可知，高光照強度二次培養(yǎng)對大龍骨藻脂肪酸組成影響顯著(P<0.05)。隨著培養(yǎng)時間的延長，PUFA與n-6 PUFA含量都先增加后減少，在3 d時分別達最大值((41.78±0.22)%、(11.31±0.23)%)，且n-6 PUFA含量顯著高于對照組的(9.84±0.43)%(P<0.05)。EPA含量也在3 d時達到最大(27.11±0.25)%，顯著高于對照組的(24.75±2.17)%(P<0.05)。而DHA含量則隨著培養(yǎng)時間的延長逐漸降低，在4 d時僅為(1.26±0.11)%，顯著低于對照組的(2.89±0.41)%(P<0.05)。

2.3 低溫、高光照強度條件下的二次培養(yǎng)

2.3.1 低溫、高光照強度對大龍骨藻總脂含量的影響(見表4)

表4 低溫、高光照強度二因子培養(yǎng)試驗的總脂含量

由表4可知，低溫、高光照強度對大龍骨藻總脂含量有顯著影響(P<0.05)。溫度與光照強度的交互作用在溫度10℃、光照強度80 μmol/(m2·s)(A1B3)時效果最佳，此時大龍骨藻的總脂含量為(42.99±2.51)%，其次是溫度20℃、光照強度80 μmol/(m2·s)(A3B3)組，該組大龍骨藻的總脂含量為(41.57±1.20)%，A1B3與A3B3兩組的總脂含量無顯著差異(P>0.05)，但顯著高于其他各組的(P<0.05)。

2.3.2 低溫、高光照強度對大龍骨藻脂肪酸組成的影響(見表5)

由表5可知，低溫、高光照強度對大龍骨藻脂肪酸組成有顯著影響(P<0.05)。從整體上看，溫度對大龍骨藻脂肪酸組成的影響要大于光照強度對大龍骨藻脂肪酸組成的影響。在溫度和光照強度的交互作用影響下，C16∶0、C16∶1(n-7)、C18∶0、C20∶4(n-6)、EPA等變化較明顯。除了溫度20℃、光照強度48 μmol/(m2·s)(A3B1)組外，脂肪酸含量均表現(xiàn)出以下大小關系：PUFA>SFA>MUFA。EPA含量在溫度10℃、光照強度80 μmol/(m2·s)(A1B3)組具有最大值(32.83±0.58)%，此時該組的C14∶0、C15∶0、C16∶0 和C18∶0等都具有最小值。PUFA含量也在溫度10℃、光照強度80 μmol/(m2·s)(A1B3)組達到最大(46.43±0.22)%，與溫度10℃、光照強度48 μmol/(m2·s)(A1B1)組以及溫度10℃、光照強度64 μmol/(m2·s)(A1B2)組無顯著差異(P>0.05)，而顯著大于其他各組的(P<0.05)。

表5 低溫、高光照強度對大龍骨藻的主要脂肪酸組成的影響

3 結 論

大龍骨藻經(jīng)低溫10℃脅迫3 d后，EPA、PUFA含量顯著高于對照組的(P<0.05)，分別為(28.48±0.47)%和(43.28±1.06)%，在80 μmol/(m2·s)光照強度條件下脅迫3 d總脂、EPA和PUFA達到最大，分別可達(43.19±1.29)%、(27.11±0.25)%和(41.78±0.22)%。溫度與光照強度的二因子培養(yǎng)試驗表明，低溫與高光照強度二次培養(yǎng)對EPA的富集效果較為顯著。在低溫10℃、高光照強度80 μmol/(m2·s)條件下，大龍骨藻具有最大的總脂含量(42.99±2.51)%、EPA含量(32.83±0.58)% 和PUFA含量(46.43±0.22)%，顯著高于對照組的(P<0.05)。這對優(yōu)化藻的EPA含量提供了一定的理論依據(jù)。

綜上所述，將藻置于最適條件下培養(yǎng)，使得藻快速生長獲得較高的生物量，通過降低溫度、增加光照強度，進行二次培養(yǎng)，可以獲得較高的總脂、EPA及PUFA。最佳二次培養(yǎng)條件為溫度10℃、光照強度80 μmol/(m2·s)、培養(yǎng)時間3 d。二次培養(yǎng)的培養(yǎng)方式結合藻類最適生長條件及最利于藻類油脂積累條件以獲得較高的脂肪酸產(chǎn)量，為大龍骨藻大規(guī)模綜合利用提供理論依據(jù)。

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Effect of the secondary culture on contents of total lipids，EPA and PUFA ofTropidoneismaxima

DING Yuhui， JIANG Xiamin， ZHANG Zeling， HAN Qingxi， LIANG Jingjing

(School of Marine Sciences， Ningbo University， Ningbo 315211， Zhejiang， China)

To explore the effects of the secondary culture (low temperature and high light intensity stress)on the contents of total lipids， EPA and PUFA ofTropidoneismaxima，Tropidoneismaximawas cultured for 10 d under the conditions of temperature 25℃， light intensity 36 μmol/(m2·s) and salinity 25， then was secondarily cultured under low temperature(10℃) or high light intensity (80 μmol/(m2·s)) by single factor experiment， and the two-factor three-level secondary culture experiment of low temperature and high light intensity was further conducted.The results showed that the optimal secondary culture time was 3 d；low temperature of 10℃ was beneficial to the accumulation of EPA and PUFA， and they could reach (28.48±0.47)% and (43.28±1.06)%， respectively；the light intensity of 80 μmol/(m2·s) also had a positive effect on the accumulation of total lipids， EPA and PUFA， reaching(43.19±1.29)%， (27.11±0.25)% and (41.78±0.22)%， respectively. And it was more beneficial to the accumulation of total lipids， EPA and PUFA under the interaction between low temperature 10℃ and light intensity 80 μmol/(m2·s)， and their contents were (42.99±2.51)%， (32.83±0.58)% and (46.43±0.22)%， respectively. Above all， the secondary culture was favorable to obtain higher levels of growth and lipid accumulation of algae. It provided a novel culture method for improving lipid production of algae， and was worthy for further study.

Tropidoneismaxima； secondary culture； total lipids； EPA； PUFA

2016-07-14；

2016-11-21

國家海洋公益項目(201305022)

丁玉惠(1993)，女，碩士研究生，研究方向為海洋微藻培養(yǎng)(E-mail)dingyuhuid@163.com。

蔣霞敏，教授(E-mail)jiangxiamin@nbu.edu.cn。

TS222;Q815

A

1003-7969(2017)02-0107-06