趙鵬飛，劉紹能，馬繼征

(1.青海省第四人民醫(yī)院 西寧 810000；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院 北京 100053)

苦刺總生物堿對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的保護(hù)作用※

趙鵬飛1，劉紹能2，馬繼征2

(1.青海省第四人民醫(yī)院 西寧 810000；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院 北京 100053)

目的 探討苦刺總生物堿對(duì)LPS所致急性肺損傷(ALI)模型小鼠的保護(hù)作用。方法 將小鼠分為空白組、模型對(duì)照組、地塞米松組、苦刺總生物堿低劑量組(46.65mg·kg-1)、苦刺總生物堿中劑量組(93.30mg·kg-1)、苦刺總生物堿高劑量組(186.60mg·kg-1)。各0受試藥物組按體重灌胃給予相應(yīng)藥物(0.2mL·10g-1)，空白對(duì)照組與模型對(duì)照組給予等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥7天。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食不禁水12小時(shí)，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日，地塞米松組按體重腹腔注射給藥(0.1mL·10g-1)1次，末次給藥1小時(shí)后，除空白對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積無(wú)菌生理鹽水外，其余各組均按體重腹腔注射LPS(0.1ml ·10g-1)制備小鼠ALI模型。12小時(shí)后各組均取血，分離血清，收集肺泡灌洗液(BALF)。檢測(cè)小鼠全血白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)；肺指數(shù)；BALF中總蛋白含量；肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性；血清白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α( TNF-α) 含量，BALF中白介素-1β(IL-1β)、白介素-10(IL-10)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)含量。計(jì)算小鼠肺濕/干重(W/D)。結(jié)果 苦刺總生物堿明顯降低ALI模型小鼠全血WBC水平，顯著升高小鼠淋巴細(xì)胞(LY)計(jì)數(shù)；顯著降低肺指數(shù)、肺W/D；明顯降低BALF中總蛋白的含量、肺組織 MPO活性，顯著降低血清IL-6、TNF-α含量及BALF中IL-1β、IL-10、MDA和NO的表達(dá)水平。結(jié)論 本研究結(jié)果顯示，苦刺總生物堿對(duì)LPS所致ALI小鼠急性肺損傷具有明顯保護(hù)作用，作用機(jī)制與抗氧化、抑制促炎因子的釋放有關(guān)。

苦刺 總生物堿 脂多糖 急性 肺 損傷 保護(hù)

前期研究表明，苦刺(Sphora vieiifolia Hance)總生物堿抗炎活性良好，主要表現(xiàn)為其可顯著降低二甲苯致小鼠耳腫脹度，降低醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管的通透性。為進(jìn)一步探討其對(duì)急性肺損傷是否存在影響及可能影響機(jī)制，本研究應(yīng)用苦刺總生物堿對(duì)LPS所致急性肺損傷(ALI)模型小鼠開展相關(guān)研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藥物

苦刺經(jīng)馬繼征博士鑒定為豆科槐屬植物苦刺(Sphora vieiifolia Hance)的干燥根，其質(zhì)量符合《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)(2005年版)》“白刺花根”項(xiàng)下相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器、試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(型號(hào)：RE5203)，購(gòu)自上海亞榮生化試劑廠；臺(tái)式循環(huán)水式多用真空泵(型號(hào)：SHB-Ⅲ)，購(gòu)自鄭州長(zhǎng)城有限公司；全波長(zhǎng)多功能讀數(shù)儀(型號(hào)：Varioskan Flash)，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；全自動(dòng)血液分析儀(型號(hào)：MEK-8222K)，購(gòu)自日本Nihon Kohden公司。冰醋酸(批號(hào)：20150304)、二甲苯(批號(hào)：20150907)，均購(gòu)自重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司。地塞米松磷酸鈉注射劑(批號(hào)：1608042111)，購(gòu)自福建南少林藥業(yè)有限公司；LPS(E.col：055：B5)(批號(hào)：L-2880)，購(gòu)自Sigma公司。小鼠 IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α ELISA 試劑盒(批號(hào)分別為：20151123、20151126、20151127、20151129)，均購(gòu)自北京科盈美科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào)：P0010S)，購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所；髓過氧化物酶(MPO)試劑盒(批號(hào)：20150421)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號(hào)：20151225)、一氧化氮(NO)試劑盒(批號(hào)：20151207)，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，SPF級(jí)，雌雄各半，體重18～22 g，購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXX(軍)2013-14。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苦刺總生物堿的制備

取苦刺藥材，適當(dāng)破碎，加8倍量70%乙醇加熱回流提取二次，每次50分鐘，合并乙醇提取液，減壓回收乙醇，得粗浸膏，加入3倍體積量的2%鹽酸溶液，充分?jǐn)嚢?，靜置過夜，過濾，收集水溶液，加入氨試液調(diào)pH至10，用等量氯仿振搖提取三次，收集氯仿層，無(wú)水Na2SO4脫水，減壓回收氯仿，得脂溶性總生物堿；水相繼續(xù)加入等量水飽和的正丁醇振搖提取三次，減壓回收正丁醇，得水溶性總生物堿。脂溶性總生物堿和水溶性總生物堿之和即為總生物堿的量。經(jīng)計(jì)算，總生物堿得率為3.11%。

供試藥物采用0.50%吐溫溶液配制，苦刺按成人(60kg)臨床日用量15 g計(jì)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥劑量分別按人用臨床劑量的6、12、24倍，結(jié)合總生物堿出膏率進(jìn)行換算，即為46.65、93.30、186.60 mg ·kg-1(提取物/體重)。

1.2.2 苦刺總生物堿對(duì)LPS所致小鼠急性肺損傷(ALI)模型的影響

1.2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、給藥及ALI模型的建立

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按體重分層，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、地塞米松組、苦刺總生物堿高劑量組(186.60mg·kg-1)、苦刺總生物堿中劑量組(93.30mg·kg-1)、苦刺總生物堿低劑量組(46.65mg·kg-1)，每組12只。各受試藥物組按體重灌胃給予相應(yīng)藥物(0.2mL·10g-1)，空白對(duì)照組與模型對(duì)照組給予等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥7天。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食不禁水12小時(shí)，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日，地塞米松組按體重腹腔注射給藥(0.1mL·10g-1)1次，末次給藥1小時(shí)后，除空白對(duì)照組小鼠腹腔注射等體積無(wú)菌生理鹽水外，其余各組均按體重腹腔注射LPS(0.1mL·10g-1)制備小鼠ALI模型。

1.2.2.2 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)

1.2.2.2.1 苦刺總堿對(duì)ALI小鼠全血白細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)的影響：眼底靜脈叢取血法取小鼠全血20 μL，至預(yù)先分裝2 mL 稀釋液的EP管中，充分混勻，通過全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀測(cè)定小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)，并對(duì)淋巴細(xì)胞(LY)、單核細(xì)胞(MO)分類計(jì)數(shù)進(jìn)行考察。

1.2.2.2.2 苦刺總堿對(duì)ALI小鼠血清炎癥細(xì)胞因子IL-6、TNF-α水平的影響：摘眼球法收集小鼠血液，離心(4℃，3500r/min)10 min，分取血清，ELISA法測(cè)定血清IL-6、TNF-α水平。

1.2.2.2.3 苦刺總堿對(duì)ALI小鼠BALF中總蛋白含量及IL-1β、IL-10、MDA、NO含量的影響：取血完成后，脫頸處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，剖開胸腔，暴露氣管，結(jié)扎右肺，用4 ℃無(wú)菌PBS溶液灌洗左肺，16號(hào)針自口腔插入氣管，固定后每次注入0.4 mL，注入后停留1 min，重復(fù)灌洗3次，收集BALF，離心(4℃，1000r/min)5 min，取上清液，BCA法測(cè)定BALF中蛋白含量，另按試劑盒說明書分別測(cè)定BALF中IL-1β、IL-10、MDA、NO含量。

1.2.2.2.4 苦刺總堿對(duì)ALI小鼠肺濕重(W)/干重(D)、肺指數(shù)及肺組織MPO活性的影響：迅速剖取已處死小鼠肺臟，稱全肺濕重，計(jì)算肺指數(shù)；然后準(zhǔn)確分取部分肺組織，稱重(W)，放入60 ℃烘箱中干燥60小時(shí)，稱取干重(D)，計(jì)算W/D值，反映肺組織的水腫程度；另取部分肺組織充分勻漿，制備10%肺組織勻漿液，按照MPO試劑盒說明書測(cè)定MPO活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 苦刺總生物堿對(duì)ALI小鼠外周血白細(xì)胞及其分類計(jì)數(shù)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠外周血WBC水平顯著增高、LY計(jì)數(shù)顯著降低，MO計(jì)數(shù)無(wú)顯著改變，提示ALI小鼠炎癥活動(dòng)明顯。與模型對(duì)照組比較，苦刺總生物堿各劑量均能明顯降低ALI小鼠WBC水平和LY計(jì)數(shù)(P<0.01，P<0.05)；與地塞米松組比較，苦刺總生物堿各劑量組小鼠WBC水平顯著升高(P<0.01)；與苦刺總生物堿186.60 mg·kg-1組相比，苦刺總生物堿93.30 mg·kg-1組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物外周血WBC水平顯著降低(P<0.01)；與苦刺總生物堿93.30 mg·kg-1組相比，苦刺總生物堿46.65 mg·kg-1組小鼠外周血LY計(jì)數(shù)顯著下降(P<0.05)，結(jié)果見表1。

Table 1 Effects of total alkaloids of Sphora vieiifolia Hance on the contents of WBC and differential blood count in peripheral blood of ±s)

*：與模型對(duì)照組比較P<0.05，**：P<0.01；#：與地塞米松組比較P<0.05，##：P<0.01；#：與苦刺總生物堿中劑量組比較P<0.05，##：P<0.01.

2.2 苦刺總生物堿對(duì)ALI小鼠血清IL-6、TNF-α水平及BALF總蛋白含量的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠血清IL-6、TNF-α水平及BALF總蛋白含量顯著升高(P<0.01，P<0.05)，表明模型組小鼠炎癥模型復(fù)制成功；與模型對(duì)照組比較，苦刺總生物堿各劑量組均能顯著降低ALI小鼠血清IL-6、TNF-α水平及BALF總蛋白含量，且隨著劑量的增加，藥效強(qiáng)度有增強(qiáng)的趨勢(shì)(P<0.01)；與空白組相比，苦刺總生物堿93.30、46.65 mg·kg-1組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清TNF-α水平顯著升高(P<0.05)，結(jié)果見表2。

Table 2 Effects of total alkaloids of Sphora vieiifolia Hance on IL-6，TNF-α in serum and the total protein concentration in BALF of ±s)

*與：模型對(duì)照組比較P<0.05，**：P<0.01；★：與地塞米松組比較P<0.05，★★：P<0.01；#：與苦刺總生物堿中劑量組比較P<0.05，##：P<0.01.

2.3 苦刺總生物堿對(duì)ALI小鼠BALF中炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-10、MDA、NO水平的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠BALF中IL-1β、IL-10、MDA、NO水平顯著升高(P<0.01，P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，苦刺總生物堿各劑量組均能明顯降低ALI小鼠BALF中IL-1β、IL-10水平(P<0.01)，苦刺總生物堿93.30、186.60 mg·kg-1能明顯下降MDA、NO的表達(dá)水平(P<0.01)；與地塞米松組相比，苦刺總生物堿實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALF中IL-1β、MDA、NO水平顯著升高(P<0.01，P<0.05)；與苦刺總生物堿46.65 mg·kg-1組相比，苦刺總生物堿93.30、186.60 mg·kg-1組能顯著降低MDA、NO含量(P<0.01，P<0.05)，結(jié)果見表3。

Table 3 Effects of total alkaloids of Sphora vieiifolia Hance on the level of IL-1β，IL-10，

*：與模型對(duì)照組比較P<0.05，**：P<0.01；#：與地塞米松組比較P<0.05，##：P<0.01；#：與苦刺總生物堿中劑量組比較P<0.05，##：P<0.01.

2.4 苦刺總生物堿對(duì)ALI小鼠肺濕重(W)/干重(D)、肺指數(shù)及肺組織MPO活性的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠肺W/D值、肺指數(shù)及MPO活性顯著升高(P<0.01，P<0.05)；與模型對(duì)照組比較，苦刺總生物堿93.30、186.60 mg·kg-1能明顯降低ALI小鼠W/D值及肺指數(shù)(P<0.01，P<0.05)，各劑量均能明顯降低ALI小鼠肺組織MPO活性(P<0.01)；與地塞米松組比較，苦刺總生物堿46.65、186.60 mg·kg-1組實(shí)驗(yàn)小鼠肺組織MPO活性顯著降低(P<0.01，P<0.05)；與苦刺總生物堿46.65 mg·kg-1組比較，苦刺總生物堿93.30 mg·kg-1組小鼠肺組織MPO活性顯著降低(P<0.05)，結(jié)果見表4。

Table 4 Effects of total alkaloids of Sphora vieiifolia Hance on the W/D，lung index and MPO activity of ±s)

*：與模型對(duì)照組比較P<0.05，**：P<0.01；#：與地塞米松組比較P<0.05，##：P<0.01；#：與苦刺總生物堿低劑量組比較P<0.05，##：P<0.01.

3 討論

有研究顯示，苦刺具有明顯的抗炎作用[1]，課題組前期通過采用二甲苯致小鼠耳腫脹以及醋酸致小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高兩種急性炎癥動(dòng)物模型，觀察苦刺不同提取部位的抗炎效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦刺總生物堿對(duì)兩種急性炎癥模型抑制效果明顯，表明總生物堿是苦刺發(fā)揮抗炎效應(yīng)的有效部位。

內(nèi)毒素性急性肺損傷發(fā)病機(jī)理錯(cuò)綜復(fù)雜，迄今尚未完全闡明，目前認(rèn)為發(fā)病機(jī)理主要是致病因子對(duì)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的直接損傷和全身炎癥反應(yīng)[2]。ALI的主要致病因子之一是LPS，LPS誘導(dǎo)的ALI動(dòng)物模型可表現(xiàn)肺泡毛細(xì)血管和肺泡上皮彌漫性損傷、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有肺水腫、甚至肺出血等病理癥狀[3]。本研究以LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠模型為載體，觀察苦刺總生物堿對(duì)模型小鼠的保護(hù)作用，可為苦刺藥理作用的挖掘及其臨床拓展應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。結(jié)果顯示，腹腔注射LPS制備的ALI模型小鼠炎癥活動(dòng)明顯，具體表現(xiàn)為：肺水腫明顯，肺指數(shù)升高，外周血WBC水平增加，肺組織MPO活性、血清及BALF中炎癥細(xì)胞因子水平均顯著升高?？啻炭偵飰A對(duì)ALI模型小鼠則有顯著保護(hù)作用：減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺水腫癥狀，降低肺指數(shù)及外周血WBC水平，還可顯著降低肺組織MPO活性及血清、BALF中IL-1β、IL-10、MDA、NO等促炎因子水平，進(jìn)而顯著減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物機(jī)體的炎性活動(dòng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了苦刺總生物堿為其主要抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)之一，同時(shí)初步揭示了苦刺總生物堿抗炎作用機(jī)制與抗氧化、抑制促炎因子的釋放有關(guān)。

[1]張明發(fā)，沈雅琴.苦刺總生物堿的抗腹瀉和抗炎作用[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，1991，26(1)：20-23.

[2]吳岳，趙海龍，張偉，等.肺泡Ⅱ型細(xì)胞凋亡在急進(jìn)高原大鼠早期肺損傷中的作用[J].青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，34(4)：233-236.

[3]張廣梅，李福安，童麗.熱痛方對(duì)大鼠急性肺損傷保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].青海醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，27(2)：104-106.

Protection effects of total alkaloids ofSphoravieiifoliaHance on Lipopoly saccharide-induced Acute Lung Injury in Mice

ZHAO Peng-fei1，LIU Shao-neng2，MA Ji-zheng2

(1.The fourth people′s hospital of Qinghai Province，Xining 810000； 2.Guang An Men hospital，China academy of Chinese Medical sciences Beijing 100053)

Objective To investigate the protection effects of total alkaloids ofSphoravieiifoliaHance on Lipopolysaccharide(LPS)-induced acute lung injury(ALI)in mice.Method Mice were randomly divided into six groups，which including normal control group，ALI model group，ALI model+dexamethasone group，ALI model+total alkaloids ofSphoravieiifoliaHance(46.65mg·kg-1、93.30mg·kg-1、186.60mg·kg-1)groups.Except the dexamethasone group′s mice were given the drugs once time by i.p before experiment，other group′s were given drugs by intragastric administration once a day for 7 days.Then，the ALI model was established by intraperitoneal injection of LPS(10mg·kg-1)in mice after 1h of the last administration.12h after LPS injection，the blood，serum，bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were collected.White blood cell(WBC)content of blood，lung index，myeloperoxidase(MPO)activity in lung tissue，total protein concentration in BALF，and the level of IL-6，TNF-α in serum，IL-1β，IL-10，MDA，NO in BALF were measured respectively.Measure the ratio of wet lung to dry lung weight(W/D).Result The total alkaloids ofSphoravieiifoliaHance significantly decreased the WBC content in blood，increased lymphocyte(LY)count，as well as decreased the lung index，the value of W/D，MPO activity in lung tissue，the level of IL-6，TNF-α in serum and contents of IL-1β，IL-10，MDA and NO in BALF.Conclusion The results reveal that the total alkaloids ofSphoravieiifoliaHance show a protective action against the inflammatory pathological changes of lung tissue in ALI mice，and mechanisms underlying the action may be related to anti-oxidation and inhibiting the release of pro-inflammatory cytokines.

SphoravieiifoliaHance Total alkaloids Lipopolysaccharide Acute Lung Injury Protection

※：“西部之光”訪問學(xué)者項(xiàng)目資助(2016) 趙鵬飛(1984～ )，男，漢族，陜西籍，主治醫(yī)師

R774.1

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.01.012

2016-11-09