李亞萍，王 靜，周立新，陸步實(shí)#（1.南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，南京 11816；.江蘇省藥物研究所有限公司，南京 10009）

HPLC法測(cè)定氨氯地平氫氯噻嗪纈沙坦片中的有關(guān)物質(zhì)

李亞萍1＊，王 靜2，周立新2，陸步實(shí)2#（1.南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，南京 211816；2.江蘇省藥物研究所有限公司，南京 210009）

目的：建立測(cè)定氨氯地平氫氯噻嗪纈沙坦片中有關(guān)物質(zhì)的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Symmetry C18，流動(dòng)相為[水-乙腈-三氟乙酸（90∶10∶0.1，V/V/V）]-[水-乙腈-三氟乙酸（10∶90∶0.1，V/V/V）]（梯度洗脫），流速為0.6 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm（雜質(zhì)A）和225 nm（雜質(zhì)B、C、D），柱溫為30 。結(jié)果：雜質(zhì)A、B、C、D檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為93.43～987.34 ng/mL（r＝0.999 4）、12.27～255.92 ng/mL（r＝0.999 6）、78.96～657.17 ng/mL（r＝0.999 9）、28.39～218.16 ng/mL（r＝0.999 7）；定量限分別為91.27、11.35、78.31、26.56 ng，檢測(cè)限分別為22.98、3.13、19.17、8.16 ng；精密度的RSD＜2.0%，穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)中只檢出雜質(zhì)A，RSD＝0.79%；回收率分別為99.4%～100.6%（RSD＝0.41%，n＝9）、98.9%～102.0%（RSD＝1.04%，n＝9）、99.4%～100.9%（RSD＝0.56%，n＝9）、98.6%～101.2%（RSD＝0.92%，n＝9）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、重復(fù)性好，可用于測(cè)定氨氯地平氫氯噻嗪纈沙坦片中的有關(guān)物質(zhì)。

氨氯地平；氫氯噻嗪；纈沙坦；有關(guān)物質(zhì)；高效液相色譜法；氨氯地平氫氯噻嗪纈沙坦片

氨氯地平氫氯噻嗪纈沙坦片是2009年FDA批準(zhǔn)諾華公司研發(fā)的復(fù)方制劑，商品名為Exforge HCT，其主要成分為氨氯地平（Amlodipine）、氫氯噻嗪（Hydrochlorothiazide）和纈沙坦（Valsartan），均為長(zhǎng)效降壓藥，本制劑適用于單一藥物治療不能控制血壓的患者，其中氨氯地平屬于鈣離子拮抗藥，氫氯噻嗪屬于利尿藥，纈沙坦屬于血管緊張素Ⅱ受體拮抗藥[1]，這3種成分可通過(guò)不同的機(jī)制發(fā)揮降壓作用，療效及耐受性均較好，大大提高了患者用藥依從性[2]；此外，該制劑對(duì)靶器官有較好的保護(hù)作用[3-6]。

現(xiàn)有文獻(xiàn)只對(duì)氨氯地平氫氯噻嗪纈沙坦片中1種或2種主要成分的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行分析，未有同時(shí)測(cè)定該制劑中3種主要成分的有關(guān)物質(zhì)的報(bào)道[7-10]，因此筆者采用高效液相色譜法（HPLC）建立了測(cè)定氨氯地平氫氯噻嗪纈沙坦片中有關(guān)物質(zhì)的方法，以期為完善該制劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括1260型可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、安捷倫工作站等（美國(guó)Agilent公司）；UV-2450型紫外分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）；BS21S型電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；KQ-200KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：200 W，頻率：40 kHz）。

1.2 藥品與試劑

氨氯地平氫氯噻嗪纈沙坦片（江蘇省藥物研究所有限公司，批號(hào)：140506、140507、140508，規(guī)格：每片含氨氯地平5 mg，氫氯噻嗪12.5 mg，纈沙坦80 mg）；氨氯地平對(duì)照品（批號(hào)：100374-201204，純度：99.6%）、氫氯噻嗪對(duì)照品（批號(hào)：100309-201103，純度：99.0%）、纈沙坦對(duì)照品（批號(hào)：100651-200902，純度：98.9%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；雜質(zhì)A對(duì)照品（批號(hào)：G0L172，純度：99.5%）、雜質(zhì)B對(duì)照品（批號(hào)：I0F027，純度：98.2%）、雜質(zhì)C對(duì)照品（批號(hào)：H1K270，純度：99.5%）均購(gòu)自美國(guó)藥典委員會(huì)；雜質(zhì)D對(duì)照品（江蘇省藥物研究所有限公司，批號(hào)：201405，純度：98.5%）；乙腈、三氟乙酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為高純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Symmetry C18（150 mm×3.0 mm，5μm）；流動(dòng)相：[水-乙腈-三氟乙酸（90∶10∶0.1，V/V/V）]（A）-[水-乙腈-三氟乙酸（10∶90∶0.1，V/V/V）]（B），梯度洗脫（0 min，80%A；20 min，20%A；25 min，80%A；35 min，80%A）；流速：0.6 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm（雜質(zhì)A）和225 nm（雜質(zhì)B、C、D）；柱溫：30 。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取雜質(zhì)A對(duì)照品10 mg、雜質(zhì)B對(duì)照品2.5 mg、雜質(zhì)C對(duì)照品6.4 mg和雜質(zhì)D對(duì)照品5 mg，置于同一100 mL量瓶中，加乙腈-水（1∶1，V/V）定容，搖勻，作為混合對(duì)照品貯備液。取上述混合對(duì)照品貯備液10 mL，置于100 mL量瓶中，加乙腈-水（1∶1，V/V）定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 取樣品細(xì)粉適量（相當(dāng)于氨氯地平5 mg），置于100 mL量瓶中，加乙腈-水（1∶1，V/V）定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 空白溶液 精密稱取處方量的空白輔料適量，置于100 mL量瓶中，加乙腈-水（1∶1，V/V）定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 系統(tǒng)適用性溶液 精密稱取氨氯地平對(duì)照品5 mg、氫氯噻嗪對(duì)照品12.5 mg和纈沙坦對(duì)照品20 mg，置于同一100 mL量瓶中，加入“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備液10 mL，加乙腈-水（1∶1，V/V）定容，搖勻，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液、系統(tǒng)適用性溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以氨氯地平峰計(jì)≥2 500，氨氯地平保留時(shí)間為13.349 min、氫氯噻嗪保留時(shí)間為4.168 min、纈沙坦保留時(shí)間為17.975 min、雜質(zhì)A保留時(shí)間為11.620 min、雜質(zhì)B保留時(shí)間為3.412 min、雜質(zhì)C保留時(shí)間為16.336 min、雜質(zhì)D保留時(shí)間為6.958 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of system suitability test

2.4 破壞性試驗(yàn)

2.4.1 酸破壞樣品溶液 精密稱取樣品（批號(hào)：140506）適量，置于50 mL量瓶中，加1 mol/L鹽酸溶液2 mL，于室溫下放置2 h，加1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL調(diào)節(jié)pH至中性，再加乙腈-水（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，即得。

2.4.2 堿破壞樣品溶液 精密稱取樣品（批號(hào)：140506）適量，置于50 mL量瓶中，加1 mol/L氫氧化鈉溶液2 mL，于室溫下放置2 h，加1 mol/L鹽酸溶液2 mL調(diào)節(jié)pH至中性，再加乙腈-水（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，即得。

2.4.3 氧化破壞樣品溶液 精密稱取樣品（批號(hào)：140506）適量，置于50 mL量瓶中，加30%過(guò)氧化氫溶液

1 mL，于室溫下放置2 h，加乙腈-水（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，即得。

2.4.4 高溫破壞樣品溶液 精密稱取樣品（批號(hào)：140506）適量，置于50 mL量瓶中，于沸水（100 ）中加熱5 h，加乙腈-水（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，即得。

2.4.5 光破壞樣品溶液 精密稱取樣品（批號(hào)：140506）適量，置于50 mL量瓶中，于人工氣候箱中（溫度：25 ，照度：4 500 lx）照射18 h，加乙腈-水（1∶1，V/V）溶解并定容，搖勻，即得。

取上述各破壞樣品溶液各10μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖2。由圖2可知，本品在上述條件下，產(chǎn)生的降解產(chǎn)物均能與主成分峰達(dá)到有效分離。

2.5 線性關(guān)系考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)雜質(zhì)質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得雜質(zhì)A、B、C、D回歸方程分別為y＝0.125x－4.130 5（r＝0.999 4）、y＝0.067 6x+ 0.100 3（r＝0.999 6）、y＝0.090 7x－1.486 9（r＝0.999 9）、y＝0.081 6x－1.395（r＝0.999 7）。結(jié)果表明，雜質(zhì)A、B、C、D檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為93.43～987.34、12.27～255.92、78.96～657.17、28.39～218.16 ng/mL。

2.6 定量限與檢測(cè)限考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得定量限（LOQ）；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得檢測(cè)限（LOD）。結(jié)果，雜質(zhì)A、B、C、D的LOQ分別為91.27、11.35、78.31、26.56 ng，LOD分別為22.98、3.13、19.17、8.16 ng。

2.7 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，雜質(zhì)A、B、C、D峰面積的RSD分別為1.01%、0.39%、1.22%、0.98%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，雜質(zhì)D峰面積的RSD為0.98%（n＝5），其他成分未檢出，表明供試品溶液在室溫放置8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品細(xì)粉（批號(hào)：140506）適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，雜質(zhì)A峰面積的RSD＝0.79% （n＝6），其他成分未檢出，表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 回收率試驗(yàn)

圖2 破壞性試驗(yàn)高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms of destructive test

精密稱取雜質(zhì)A、B、C、D各適量，共9份，分別置于100 mL量瓶中，加乙腈-水（1∶1，V/V）溶解并定容，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成低、中、高3種不同質(zhì)量濃度的供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.11 樣品有關(guān)物質(zhì)測(cè)定

取3批樣品（批號(hào)：140506、140507、140508）各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并按外標(biāo)法計(jì)算樣品中的有關(guān)物質(zhì)。結(jié)果，3批樣品中只有1批（批號(hào)：140508）只檢測(cè)出雜質(zhì)D，其含量為0.01%。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 1 Results of recovery tests（n＝9）

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)和柱溫的選擇

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，在200～400 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在237 nm波長(zhǎng)處雜質(zhì)A有最大吸收，在225 nm波長(zhǎng)處雜質(zhì)B、C、D有較大吸收，因此最終確定本試驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)為237 nm（雜質(zhì)A）和225 nm（雜質(zhì)B、C、D）。在預(yù)試驗(yàn)中，筆者發(fā)現(xiàn)溫度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致氨氯地平、氫氯噻嗪和纈沙坦主峰與其相鄰的有關(guān)物質(zhì)峰分離度不佳，造成干擾，故選用30為本試驗(yàn)的柱溫。

3.2 有關(guān)物質(zhì)的確定

根據(jù)氨氯地平、氫氯噻嗪和纈沙坦原料的合成路線和可能的降解模式，氨氯地平涉及的有關(guān)物質(zhì)為雜質(zhì)A，其在氧化、光照及高溫條件下均可產(chǎn)生；氫氯噻嗪涉及的有關(guān)物質(zhì)有氯噻嗪、氫氯噻嗪二聚物和苯并噻二嗪（即雜質(zhì)B），其中氯噻嗪是合成過(guò)程中間體，氫氯噻嗪二聚物是合成過(guò)程中的副產(chǎn)物，雜質(zhì)B是氫氯噻嗪降解產(chǎn)物及該藥質(zhì)量控制中的主要有關(guān)物質(zhì)[4-5]；纈沙坦涉及的有關(guān)物質(zhì)有雜質(zhì)C、雜質(zhì)E及纈沙坦水解產(chǎn)物（雜質(zhì)D）[6]，其中雜質(zhì)E是纈沙坦的手性異構(gòu)體，其檢測(cè)可在另一色譜系統(tǒng)下用手性色譜柱進(jìn)行研究，本系統(tǒng)不對(duì)雜質(zhì)E做具體說(shuō)明，雜質(zhì)C是纈沙坦同系物副產(chǎn)物，雜質(zhì)D為纈沙坦水解產(chǎn)物。

綜上所述，本方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、重復(fù)性好，可用于測(cè)定氨氯地平氫氯噻嗪纈沙坦片中的有關(guān)物質(zhì)。

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（編輯：劉 柳）

Determination of Related Substance in Amlodipine Hydrochlorothiazide and Valsartan Tablets by HPLC

LI Yaping1，WANG Jing2，ZHOU Lixin2，LU Bushi2（1.College of Pharmacy，Nanjing Tech University，Nanjing 211816，China；2.Jiangsu Province Institute of Materia Medica Co，Ltd.，Nanjing 210009，China）

OBJECTIVE：To establish the method for simultaneous determination of related substances in Amlodipine hydrochlorothiazide and valsartan tablets.METHODS：HPLC method was used.The determination was performed on Symmetry C18column with mobile phase consisted of water-acetonitrile-trifluoroacetic acid（90∶10∶0.1，V/V/V）and water-acetonitrile-trifluoroacetic（10∶90∶0.1，V/V/V）（gradient elution）at the flow rate of 0.6 mL/min.The detection wavelength was set at 237 nm（impurity A）and 225 nm（impurity B，C，D）.The column temperature was 30 .RESULTS：The linear range of impurity A，B，C，D were 93.43-987.34 ng/mL（r＝0.999 4），12.27-255.92 ng/mL（r＝0.999 6），78.96-657.17 ng/mL（r＝0.999 9），28.39-218.16 ng/mL（r＝0.999 7），respectively.The limits of quantitation were 91.27，11.35，78.31，26.56 ng；the limits of stability and detection were 22.98，3.13，19.17，8.16 ng.RSDs of precision tests were lower than 2.0%.Only impurity A was found in repeatability test，RSD＝0.79%.Recoveries were 99.4%-100.6%（RSD＝0.41%，n＝9），98.9%-102.0%（RSD＝1.04%，n＝9），99.4%-100.9%（RSD＝0.56%，n＝9），98.6%-101.2%（RSD＝0.92%，n＝9），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，rapid，sensitive and repeatable，and can be used for the determination of related substance in Amlodipine hydrochlorothiazide and valsartan tablets.

Amlodipine；Hydrochlorothiazide；Valsartan；Related susbtance；HPLC；Amlodipine hydrochlorothiazide and valsartan tablets

R927.2

A

1001-0408（2017）12-1714-04

2016-05-22

2017-01-22）

＊碩士研究生。研究方向：藥劑學(xué)。電話：025-58139411。E-mail：liyaping0816@163.com

#通信作者：研究員，碩士。研究方向：藥物制劑。E-mail：bushi89@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.12.36