郭豫杰　高會貞　李宏基　王月影　李奎　楊國宇

摘要：克隆豬的akirin2基因，并對該基因在豬的18個組織中的分布進行研究。豬akirin2基因編碼區(qū)全長為612 bp（GenBank登錄號KCl40110.1），推測的氨基酸序列包含203個氨基酸，為酸性蛋白。利用BLAST工具對克隆到的豬akirin2基因序列與人、大鼠、小鼠、綿羊和牛的序列進行同源性比較。采用軟件對氨基酸序列進行分析，用相關序列的比對結(jié)果進行系統(tǒng)進化樹分析。組織分布結(jié)果顯示，豬akirin2基因在腦組織中高表達，在淋巴、睪丸中表達量相對較低，在心臟、十二指腸、直腸、皮膚、胸腺中幾乎檢測不到該基因的表達。序列分析結(jié)果顯示，豬akirin2基因與綿羊和牛的同源性最高，均為96%，與人、小鼠、大鼠的同源性分別為95%、91%、89%。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，存在1個10個肽的核定位信號序列19-PASPKRRRCA-28，推測的氨基酸序列的二級結(jié)構(gòu)中含有2個a-螺旋。在重建的系統(tǒng)進化樹上，幾個不同物種的akirin2蛋白分成3支，結(jié)果表明豬akirin2與人、牛和羊的親緣關系比其與小鼠和大鼠的近，與雞的親緣關系最遠。

關鍵詞：豬；akirin2基因；克隆；組織分布；序列分析；基因功能

中圖分類號：S828.2 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0025—04

在畜牧業(yè)中，肌肉的產(chǎn)量和質(zhì)量是肉用畜禽的重要經(jīng)濟性狀，對畜禽飼養(yǎng)業(yè)的經(jīng)濟效益起決定性作用。肌細胞的發(fā)育開始于成肌細胞或前體細胞。成肌細胞經(jīng)過分化和融合過程形成肌管，其隨后進一步分化成肌纖維。肌肉抑制素（my-ostatin，MSTN）（或生長分化因子8，GDF-8）是一種調(diào)節(jié)肌肉生長和發(fā)育的主要因子，MSTN表現(xiàn)出對肌肉生長的負調(diào)節(jié)。肌肉抑制素基因中11 bp的缺失在牛中導致比利時藍（belgian blue）或雙臀?。╠ouble-muscled）表型，比利時藍牛在肌肉質(zhì)量上增加20%～30%。盡管在遺傳分析中已經(jīng)揭示出MSTN的重要功能，然而對MSTN信號通路下游調(diào)控肌肉發(fā)生的相關基因的了解還不多。akirin是Miner等通過小鼠消減抑制雜交文庫篩選出的MSTN下游調(diào)控基因。這一新核蛋白基因的發(fā)現(xiàn)，填補了MSTN調(diào)控肌肉生成的上下游基因的空缺。在脊椎動物中akirin基因非常保守，至少存在akirin1和akirin2等2個同源基因。然而，在鳥類和爬行動物中沒有akirin1，只有akirin2基因，在硬骨魚中akirin基因家族有2～8個成員，在細菌、植物和酵母中均未發(fā)現(xiàn)有akirin的存在。張志強等首次克隆到豬的mighty（akirin1）基因，并對該基因在豬不同組織中的表達譜進行分析。本研究克隆豬的akirin2基因，并對其組織分布及序列特征進行分析，為進一步研究該基因的功能奠定基礎。

1材料與方法

1.1樣品采集

取健康豬的心、肝、脾、肺、腎、空腸、十二指腸、回腸、直腸、大腦、肌肉、皮膚、脂肪、胸腺、淋巴、下頜、子宮、睪丸等18個組織，用錫箔紙包好迅速冷凍于液氮中，置于-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑與儀器

Trizol（Invitrogen）；DEPC（Serva）；Reverse TranscriptaseM-MLV（RNase H_）、RNase inhibitor、dNTP-mix、Premix TaqVersion 2.0、DL2000 DNA Marker、凝膠回收試劑盒（TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0）、pMDl9-T Vector均購自寶生物工程（大連）有限公司；大腸桿菌（Escherichiacoli）DH5ct菌株為筆者所在實驗室保存。臺式高速離心機（Eppendorf，Germany）；溫度梯度PCR儀（sensoquest，Germa-ny）；凝膠成像系統(tǒng)（Alphalmager HP，USA）；微量核酸蛋白檢測儀NanoDrop-100（Thermo，USA）。

1.3方法

1.3.1引物設計 根據(jù)NCBI上GenBank中小鼠和人的aki-rin2基因序列，在GenBank數(shù)據(jù)庫中對豬的ESTs和UniGene數(shù)據(jù)庫進行搜索，對搜索到的ESTs序列進行拼接，結(jié)合軟件BIOXM2.6及引物設計軟件，設計1對引物[由生工生物工程（上海）股份有限公司合成]：akirin2-F，5′-ATGGCGTGCG-GAGCTACTCTG-3′；akirin2-R，5′-TCATGAAACATAAC-TAGCAGGCTG-3′。

1.3.2總RNA的提取及cDNA的合成 取50～100 mg經(jīng)液氮處理過的大腦組織，用Trizol法從中提取總RNA。取2μL樣品，采用ND-1000分光光度計檢測總RNA的濃度及純度，取8μL進行甲醛變性膠電泳檢測，其余總RNA樣品-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄體系：0.5μg/μL Oligo（dT）₁₅1μL、總RNA 2μg、M-MLV Buffer（5×）5.0 IxL、10 mmol/LdNTP 6.0 txL、40 U/μL RNase-Inhibitor 0.7 txL、200 U/μLM-MLV Reverse Transcriptase 1.0μL、DEPC H₂O補足至25.0μL。反應程序：25℃10 min，42℃60 min，72℃15 min。反應結(jié)束后，迅速冰浴2 min，得到cDNA，置于-20℃保存。

1.3.3目的基因豬akirin2的擴增 以上述cDNA稀釋5倍作為模板，進行PCR擴增。PCR擴增體系：Premix Taq聚合酶12.0 μL、10μmoL/μL akirin2-F 1.0 μL、10μmol/μLakirin2-R 1.0μL、cDNA 2.0 txL，用滅菌的蒸餾水補足至總體積為25.0μL，混勻，瞬時離心，立即置于PCR儀上。反應程序：95℃預變性5 min；95℃30 s，60℃30 s，72℃40 s，30個循環(huán)；72℃延伸15 min。反應結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物用

1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.3.4豬akirin2基因的克隆 PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行切膠純化，產(chǎn)物純化回收采用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0試劑盒進行。將回收的產(chǎn)物與pMD19-T載體直接進行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α，涂布于含有50μg/mL Amp的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。挑取3～5個單克隆作菌液PCR鑒定，經(jīng)初步鑒定為陽性的克隆送往生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.3.5組織分布 提取采集的豬心、肝、脾、肺、腎、空腸、十二指腸、回腸、直腸、大腦、肌肉、皮膚、脂肪、胸腺、淋巴、下頜、子宮、睪丸等18個組織的總RNA，經(jīng)RT-PCR后得到相應的cDNA。選擇豬的β-actin基因作為內(nèi)參，引物序列：β-actin-F，5′-GGACTTCGAGCAGGAGATGG-3′；β-actin-R，5′-AGGAAGGAGGGCTGGAAGAG-3′，產(chǎn)物片段預計為138 bp。用于擴增豬akirin2基因的引物序列：akirin2-F2，5′-TCCATCAGCAACGTCCTCAC-3′；akirin2-R2，5′-AACTAGCAGGCTGTTCTCCA-3′，擴增片段預計為218 bp。各取5μLPCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，分析豬akirin2在以上各組織中的分布及表達情況。

1.3.6序列分析 利用ncbi在線分析服務器軟件Blast（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）進行序列同源性比對。應用ExPASy（http：∥expasy.ch/tools/protparam.html）在線分析推測氨基酸序列的理化特征。信號肽序列的預測采用signalP 3.0在線軟件（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/Signalp）。應用SABLE（http：∥sable.cchmc.org）在線軟件對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進行預測分析。

為了研究akirin基因在進化上的特點，選取NCBI中綿羊、牛、人、小鼠、大鼠以及雞這幾個物種的相關序列進行多序列比對，并用MEGA 5.0軟件，選擇鄰接法（Neighbor-Join-ing）并自舉（Bootstrap）1000次計算置信值，建立系統(tǒng)進化樹。

2結(jié)果與分析

2.1總RNA的提取

肌肉組織總RNA采用Trizol法提取后，采用ND-1000分光光度計檢測總RNA的濃度及純度。D_260nm/D2_280nm為1.83，電泳條帶以28S rRNA和18S rRNA為主（圖1）。

2.2豬akirin2基因的克隆

總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，以得到的cDNA為模板，經(jīng)PCR擴增后，取5μL PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳結(jié)果顯示，擴增得到1個約為609 bp的片段（圖2），該片段大小與預期目的基因大小位置接近。

2.3菌液PCR鑒定

經(jīng)切膠純化回收后，將該DNA片段與pMD19-T載體進行連接、轉(zhuǎn)化、涂板及挑斑后，經(jīng)菌液PCR對陽性克隆進行初步篩選，菌液PCR結(jié)果（圖3）顯示，在609 bp處有預期大小的目的條帶。

2.4 RT-PCR分析豬akirin2基因組織表達譜

為了分析豬akirin2基因mRNA在不同組織中的表達及分布情況，本研究提取豬18個組織的總RNA，采用半定量RT-PCR的方法進行分析。目的基因豬akirin2的光密度值經(jīng)內(nèi)參基因β-actin進行修正，采用二者的比值作為目的基因的相對表達水平。結(jié)果顯示，豬akirin2基因在豬不同組織中的表達和分布明顯不同（圖4），在有些組織如心臟、十二指腸、直腸、皮膚、胸腺等中幾乎檢測不到該基因的表達，在腦組織中該基因有相對較高的表達水平，在淋巴、睪丸等組織中可以檢測到akirin2基因低水平的表達。

2.5序列分析

在GenBank中利用Blast工具對克隆到的豬akirin2基因進行同源性比較，豬akirin2基因與綿羊（Ovis aries，NM_001252176.1）和牛（Bos taurus，NM_001110087）的akirin2基因同源性最高，均為96%，與人（Homo sapiens，NM_018064.3）的同源性為95%，與小鼠（Mus musculus，NM_001007589.3）的同源性為91%，與大鼠（Rattus norvegicus，NM_001039914.2）的同源性為89%。從比對結(jié)果可知，該基因在不同物種間的同源性較高。

通過ExPASy軟件在線分析預測到該蛋白質(zhì)相對分子量為50 900.1，理論等電點為5.12，為酸性蛋白。采用signalP3.0在線預測信號肽軟件分析發(fā)現(xiàn)，該多肽鏈序列無信號肽，不是分泌蛋白，序列分析發(fā)現(xiàn)存在1個10個肽的核定位信號序列19-PASPKRRRCA-28（圖5），由此推測akirin2可能在細胞核中發(fā)揮功能，這在鼠和果蠅akirin2的研究中已經(jīng)得到證實。

應用SABLE在線軟件對豬Akirin2蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進行預測分析，結(jié)果顯示，二級結(jié)構(gòu)中含有2個α-螺旋（圖6）。其中，靠近C-端的α-螺旋在豬、牛、羊、人、小鼠、大鼠及雞中都有。

為了研究akirin2基因在進化中的特點，選取NCBI中綿羊、牛、人、小鼠、大鼠以及雞這幾個物種的相關氨基酸序列進行多序列比對，并用MEGA 5.0軟件，選擇鄰接法（Neighbor-Joining）并自舉（Bootstrap）1000次計算置信值，建立系統(tǒng)進化樹（圖7）。在重建的系統(tǒng)進化樹上，這幾個不同物種的Akirin2蛋白分成3支，牛和羊先聚在一起，然后又與豬和人聚成其中一支，小鼠和大鼠聚成另外一支，雞則單獨在一支上。結(jié)果顯示，豬Akirin2蛋白與人、牛和羊的親緣關系比其與小鼠和大鼠的近，與雞的親緣關系最遠。

3結(jié)論與討論

目前已經(jīng)報道了akirin基因在免疫、發(fā)育及肌肉再生等方面發(fā)揮了重要的生物學功能。本研究克隆了豬akirin2基因的編碼區(qū)全序列，該序列包含612個核苷酸，由此推測編碼203個氨基酸。人、牛、羊的akirin2基因的ORF的核苷酸序列也都是612 bp，編碼203個氨基酸；小鼠和大鼠的akirin2基因的ORF包含609個核苷酸，編碼201個氨基酸，雞的akirin2基因的ORF僅有573 bp，編碼191個氨基酸，比豬、牛、羊和人的少36 bp，共計12個氨基酸。大鼠和小鼠的akirn2連續(xù)缺少6 bp，氨基酸序列中連續(xù)缺少2個氨基酸殘基，雞連續(xù)缺失36 bp、12個氨基酸，缺失部分都不在α-螺旋區(qū)。由于氨基酸的缺失使得豬Akirin2氨基酸的序列同源性與大鼠和小鼠較近；而雞Akirin2氨基酸殘基缺失，導致豬與雞的同源性最遠，而氨基酸數(shù)目同樣多的豬、牛、羊和人的同源性更近。人、牛、羊、大鼠、小鼠和雞的Akirin2蛋白在其N-端都有一段保守的核定位信號序列，序列分析發(fā)現(xiàn)，豬Akirin2蛋白與其他物種的Akirin2蛋白一樣，也含有1個核定位信號序列，這與報道的Akirin2是在細胞核中發(fā)揮功能的核蛋白相符合。此外，這一核定位信號序列在豬Akirin1蛋白中也能找到。應用SABLE在線軟件對豬Akirin2蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進行預測分析，結(jié)果顯示，豬Akirin2的二級結(jié)構(gòu)中含有2個α-螺旋，靠近C-端的α-螺旋在豬、牛、羊、人、小鼠、大鼠及雞中都有，該區(qū)域的保守性顯示此區(qū)域可能對Aki-rin2發(fā)揮功能具有重要作用。

從豬akirin2基因組織分布的試驗結(jié)果中可以看出，該基因在不同組織中的分布和表達水平明顯不同。檢測的18個組織中，心臟、十二指腸、直腸、皮膚、胸腺等組織中幾乎檢測不到該基因的mRNA表達，只在大腦中檢測到相對較高的表達。Man等在研究不同日齡雞的akirin2基因的組織表達譜時發(fā)現(xiàn)，在雛雞和成年雞16個組織中的akirin2基因表達存在差異，在3日齡雞的11個組織肝臟、胸腺、腎臟、肌胃、心臟、皮膚、大腦、小腸、脾臟、肺和肌肉中該基因均有明顯的表達，然而在成年雞的某些組織如心臟、肝臟、大腸、腹脂和胰腺中則幾乎檢測不到該基因的表達，說明該基因的表達具有一定的時間特異性。該試驗在雛雞和成年雞的大腦中都檢測到了較高水平的akirin2 mRNA，這與本研究在豬的腦組織中檢測到較高水平akirin2基因的表達結(jié)果一致。此外，豬akirinl（mighty）基因在腦中也顯示有較高水平的表達。腦中akirin基因相對較高的表達水平具有的意義仍需要試驗進行深入研究。與豬akirin1（mighty）基因在豬不同組織中的表達譜相比較發(fā)現(xiàn)，akirin1基因在各種組織中都有表達，而akirin2只在少數(shù)幾個組織中檢測到有表達，由于本研究沒有檢測蛋白水平的表達情況，導致豬akirin2基因表達差異的可能原因較多，由此推測豬akirin2在不同組織中的分布差異可能與該基因在不同組織中的功能有關。本研究成功克隆了豬的akirin2基因，并對其序列進行分析，檢測豬akirin2基因在18個組織中的分布和表達情況，這些數(shù)據(jù)為進一步研究豬akirin2基因的功能奠定基礎。