李玉萍+羅鳳霞+史慧梅

摘要：以春蘭“紫萼”×大花蕙蘭“日本綠”雜交種子萌發(fā)所得的原球莖為材料，采用N6、KC、1/2MS等3種基本培養(yǎng)基配合以6-BA、KT和NAA的不同濃度設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，篩選雜交種原球莖增殖的適宜培養(yǎng)基。結(jié)果表明：基本培養(yǎng)基是影響雜種后代原球莖增殖的首要因素，N6增殖效果最好；3種外源激素對(duì)原球莖的增殖率影響都極顯著，影響由大到小順序?yàn)镹AA>KT>6-BA，NAA與6-BA濃度為1：5或1：15的比例，對(duì)原球莖增殖效果最好；春蘭“紫萼”×大花蕙蘭“日本綠”雜交種原球莖增殖最適宜培養(yǎng)基為N6+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L KT+0.5 mg/L 6-BA或N6+0.1 mg/L NAA+0.1mg/L KT+1.5 mg/L 6-BA。

關(guān)鍵詞：春蘭；大花蕙蘭；原球莖；增殖

中圖分類(lèi)號(hào)：S682.310.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）01-0053-03

雜交育種是蘭花育種最重要的方法，利用該方法已培育出10萬(wàn)多個(gè)洋蘭新品種。春蘭（Cymbidium goeringii）為蘭屬多年生常綠地生草本，花單生，少數(shù)2朵，花葶直立，花小，直徑4～5 cm，花為淺黃綠色、綠白色、黃白色，香濃。春蘭高雅幽香，具有很高的觀賞價(jià)值，在我國(guó)栽培已有2000多年。大花蕙蘭（Cymbidium hybridium）是以蘭屬中的一些附生性較強(qiáng)的大花種為親本獲得的人工雜交種，是對(duì)蘭屬中通過(guò)人工雜交培育出的色澤艷麗、花朵碩大的品種的一個(gè)統(tǒng)稱。全世界蘭屬植物近70種，中國(guó)約49種，目前用來(lái)作雜交親本的原生種有近20種，主要是大花的附生類(lèi)以及少量的地生類(lèi)。蘭屬植物的果實(shí)為蒴果，其形狀、大小常因親本或原生種不同而有較大的差異。但其種子均十分細(xì)小，種子內(nèi)的胚通常發(fā)育不完全，且?guī)缀鯚o(wú)胚乳，在自然條件下很難萌發(fā)，現(xiàn)代育種多采用離體胚培養(yǎng)。大量擴(kuò)繁的有利階段是原球莖的增殖期，本試驗(yàn)采用多因素正交試驗(yàn)，從基本培養(yǎng)基以及外源激素種類(lèi)及其濃度探討了春蘭與大花蕙蘭雜種原球莖增殖的培養(yǎng)基，旨在為春蘭與芳香型大花蕙蘭雜交育種提供基礎(chǔ)。

1材料與方法

以春蘭“紫萼”×大花蕙蘭“日本綠”雜交種子萌發(fā)所得的直徑在0.2～0.3 cm生長(zhǎng)旺盛的原球莖（protocorm like-body，簡(jiǎn)稱PLB）為外植體進(jìn)行增殖培養(yǎng)，對(duì)基本培養(yǎng)基、NAA、6-BA和KT進(jìn)行4因素3水平的L₉（3⁴）正交試驗(yàn)，各因素水平見(jiàn)表1。每處理接種30個(gè)原球莖，重復(fù)3次。

通過(guò)極差分析法找到較好的增殖培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上調(diào)整培養(yǎng)基再次進(jìn)行L₉（3³）正交試驗(yàn)，60 d后再次統(tǒng)計(jì)增殖情況，并用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，以鄧肯氏（Duncans）新復(fù)極差法測(cè)驗(yàn)差異顯著性，以得到更適宜原球莖增殖的培養(yǎng)基配方。

注：以上培養(yǎng)基加入蔗糖30 g/L、瓊脂8 g/L，調(diào)節(jié)pH值5.6，121℃高溫滅菌15 min。培養(yǎng)環(huán)境為溫度（25±2）℃，光照12 h/d，光強(qiáng)2 0001x。接種60 d后統(tǒng)計(jì)原球莖增殖情況，增殖系數(shù)=增殖后的原球莖數(shù)/接種原球莖數(shù)。2結(jié)果與分析

2.1L₉（3⁴）正交試驗(yàn)增殖結(jié)果分析

在培養(yǎng)過(guò)程中，原球莖隨著自身的不斷增殖而逐漸形成簇生型原球莖團(tuán)（圖1），統(tǒng)計(jì)原球莖接種60 d后的增殖情況，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，B4培養(yǎng)基的增殖系數(shù)最高，為6.56，明顯高于其他處理，其次是B1，增殖系數(shù)為4.84，B5培養(yǎng)基和B6培養(yǎng)基的增殖系數(shù)基本一致，差異不明顯，而B(niǎo)7培養(yǎng)基的增殖系數(shù)最小，僅為3.20。極差分析結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基對(duì)原球莖增殖影響最大，其次是NAA、KT，影響最小的因子是6-BA。3種基本培養(yǎng)基中，N6的增殖效果最佳，其次是1/2MS。極差分析結(jié)果表明，4個(gè)因子最佳組合為N6+0 mg/LNAA+1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/LKT，此組合即為B4培養(yǎng)基。試驗(yàn)結(jié)果與極差分析都表明，原球莖增殖效果最優(yōu)的培養(yǎng)基為N6+1.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L KT。

2.2 L₉（3³）正交試驗(yàn)增殖結(jié)果分析

在B4培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步研究各激素水平對(duì)原球莖增殖的影響。以N6為基本培養(yǎng)基，對(duì)NAA、6-BA、KT進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，每處理接種30個(gè)原球莖，重復(fù)3次，60 d后增殖情況統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表3。用SPSS軟件對(duì)增殖數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。對(duì)3因素進(jìn)行多重比較，結(jié)果見(jiàn)表5。

對(duì)正交試驗(yàn)9個(gè)處理進(jìn)行多重比較，其差異顯著性水平與增殖系數(shù)指標(biāo)的比較見(jiàn)圖2。由圖2可知，原球莖增殖系數(shù)最高的培養(yǎng)基是B15，達(dá)到了9.22，增殖系數(shù)最低的為B12，僅為5.07。B13、B14、B15與B10、B11、B12差異極顯著，表明培養(yǎng)基內(nèi)添加適量的NAA可促進(jìn)雜交種原球莖的增殖。B16與B17、B18差異極顯著，表明在NAA濃度相同時(shí)，添加一定量的6-BA和KT可提高原球莖的增殖系數(shù)。

3結(jié)論與討論

蘭花大量擴(kuò)繁的有利階段是原球莖的增殖期，此時(shí)期是提高繁殖系數(shù)的核心?；九囵B(yǎng)基、植物激素的種類(lèi)與濃度等都對(duì)原球莖的增殖有著至關(guān)重要的影響。本試驗(yàn)結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基是影響春蘭“紫萼”×大花蕙蘭“日本綠”雜種后代原球莖增殖的首要因素，這與魯?shù)涎芯看簞εc大花蕙蘭雜交原球莖增殖培養(yǎng)所得試驗(yàn)結(jié)果一致。陳小強(qiáng)等認(rèn)為1/2MS培養(yǎng)基有利于大花蕙蘭原球莖的增殖。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，原球莖在N6、1/2MS、KC等3種培養(yǎng)基上培養(yǎng)，N6的增殖系數(shù)最高，這與陳小強(qiáng)等的研究結(jié)果有所不同。這可能是因?yàn)镹6培養(yǎng)基與1/2MS、KC培養(yǎng)基所含的無(wú)機(jī)鹽成分與離子濃度不同。N6培養(yǎng)基是1974年朱至清等為水稻等禾谷類(lèi)作物的花藥培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的，其特點(diǎn)是離子濃度較低，KNO₃（NH₄）₂SO₄含量高，不含鉬，目前在蘭花類(lèi)組培中也得到了廣泛應(yīng)用。1/2MS培養(yǎng)基雖是將MS培養(yǎng)基大量元素減半，但其離子總量仍相對(duì)較高，不利于原球莖的增長(zhǎng)。同時(shí)KC培養(yǎng)基與1/2MS、N6培養(yǎng)基相比，可能是因其Ca²⁺濃度較高，抑制了原球莖的增長(zhǎng)。

在組織研究中，細(xì)胞分裂素類(lèi)物質(zhì)主要作用是促進(jìn)細(xì)胞分裂和器官分化等，而生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)主要是配合一定比例的細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)不定芽的形成。因此大多研究者認(rèn)為原球莖增殖階段可以適當(dāng)提高6-BA濃度并降低NAA的濃度。梁一池等認(rèn)為KT和NAA 2種外源激素配合使用可以對(duì)內(nèi)源激素產(chǎn)生影響，有利于細(xì)胞分裂。楊玉珍等研究也發(fā)現(xiàn)，相同濃度的NAA配合下，大花蕙蘭對(duì)KT的敏感程度高于對(duì)6-BA的敏感程度，低濃度的KT可明顯促進(jìn)原球莖的增殖。本研究中，NAA、KT、6-BA等3種外源激素對(duì)原球莖的增殖率影響都極顯著，影響順序?yàn)镹AA>KT>6-BA，這與前人研究較一致。陳麗等在對(duì)墨蘭的研究中發(fā)現(xiàn)0.5 m/L NAA+1.0 mg/L 6-BA即1：2的配比，有利于墨蘭根狀莖的增殖，本研究發(fā)現(xiàn)0.1 mg/L NAA+0.5或1.5 m/L 6-BA，即1：5或1：15的比例，對(duì)原球莖增殖效果最好。這可能是因?yàn)椴煌m花種類(lèi)原球莖生長(zhǎng)機(jī)理有所差異，或者是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中添加了較低濃度的KT，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

同時(shí)本研究仍存在一些不足，本研究所用材料來(lái)源于春蘭“紫萼”×大花蕙蘭“日本綠”雜交種胚無(wú)菌播種萌發(fā)形成的原球莖，此類(lèi)原球莖是否與組培中由莖尖、腋芽等誘導(dǎo)出的原球莖有所不同，仍有待以后進(jìn)一步探究。因此，本研究結(jié)果僅適用于春蘭與大花蕙蘭的有性繁殖，在育種實(shí)踐中具有重要的意義。此外由于材料有限，本研究只對(duì)春蘭與大花蕙蘭1個(gè)雜交組合所得原球莖的增殖做了研究，所得原球莖增殖培養(yǎng)基是否適應(yīng)于其他組合，還有待進(jìn)一步確定，但仍可為春蘭與大花蕙蘭雜種原球莖生長(zhǎng)與發(fā)育提供一定參考。