霍金海+孫國(guó)東+董文婷+王偉明

[摘要]采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析不同采集時(shí)期北青龍衣有效成分動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。用MarkerView軟件對(duì)6個(gè)采集時(shí)期18批樣品測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，差異性化合物通過(guò)Peakview 2.0/Masterview1.0軟件，依據(jù)精確質(zhì)量數(shù)和同位素峰度比確定分子式，再通過(guò)對(duì)照品及數(shù)據(jù)庫(kù)的二級(jí)譜圖比對(duì)、裂解規(guī)律分析，結(jié)合已有文獻(xiàn)報(bào)道，確定結(jié)構(gòu)式。結(jié)果表明不同采集期萘醌類有效成分含量發(fā)生了明顯的變化，鑒定或推斷了北青龍衣中38個(gè)萘醌類化合物結(jié)構(gòu)，隨著采收時(shí)間的變化大部分萘醌類成分含量逐漸下降。該方法快速、準(zhǔn)確，為北青龍衣的化學(xué)成分鑒定與分析提供一種新的策略，為揭示不同生長(zhǎng)期北青龍衣有效成分動(dòng)態(tài)變化規(guī)律及確定其藥材合理采收期提供基礎(chǔ)資料。

[關(guān)鍵詞]液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜；北青龍衣；萘醌；動(dòng)態(tài)變化

北青龍衣為胡桃科胡桃屬植物核桃楸Juglansmandshurica Maxim.未成熟果實(shí)的外果皮。民間多年來(lái)一直用于治療惡性腫瘤，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行了大量的報(bào)道。目前，從青龍衣中分離得到的化合物有萘醌類、黃酮類、二芳基庚烷類、萜類、鞣質(zhì)類、多糖類、有機(jī)酸類及揮發(fā)油等，其中萘醌類是公認(rèn)的抗腫瘤主要成分。

胡桃科Juglandaeeae共9屬71種植物，其中以胡桃楸J.mandshurica及胡桃J.regia L.作為藥用植物報(bào)道較多。但不同標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的藥用部位及采收時(shí)期差異較大。其中《黑龍江省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》收載的北青龍衣為核桃楸未成熟果實(shí)的外果皮?！吨兴幋筠o典收載》收載的核桃楸果為核桃楸的未成?！叭乱痍愃脑螺?，五月六月當(dāng)柴燒”是古人對(duì)中藥采收期精辟的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，過(guò)季則有藥無(wú)性。尤其是果實(shí)成熟期青龍衣萘醌類成分含量極低，作為食用核桃采收時(shí)的廢棄副產(chǎn)品，以低廉的價(jià)格大量充斥市場(chǎng)，勢(shì)必影響臨床療效。

本課題組前期研究表明不同采收時(shí)期青龍衣有效成分含量差異較大，但關(guān)于不同采收時(shí)期青龍衣中胡桃醌含量變化的報(bào)道結(jié)論不一致，這可能與萘醌類成分之間相互轉(zhuǎn)化有關(guān)。單一測(cè)定一個(gè)或幾個(gè)成分的含量難以全面體現(xiàn)藥材的內(nèi)在質(zhì)量。因此，亟需一種分析手段全面反映北青龍衣不同采集時(shí)期有效成分的動(dòng)態(tài)積累規(guī)律，為藥材采收期的確定提供科學(xué)依據(jù)。

超高效液相色譜（UPLC）通過(guò)在色譜柱上使用小顆粒填料以及其他部件的改進(jìn)，具有更高的分離度、更快的分析速度和更大的峰容量等優(yōu)點(diǎn)。四級(jí)桿.飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（Q-TOF）為高分辨質(zhì)譜儀，不僅具有高分辨、高選擇性的特點(diǎn)，通過(guò)精確的相對(duì)分子質(zhì)量快速確定化合物分子式。還可以通過(guò)高低能碰撞掃描，提供豐富的二級(jí)質(zhì)譜信息，再通過(guò)對(duì)照品比對(duì)及裂解規(guī)律分析，從而鑒定或推斷化合物結(jié)構(gòu)。近年來(lái)，將液相色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度相結(jié)合，尤其是與高分辨質(zhì)譜和多級(jí)質(zhì)譜聯(lián)合使用的技術(shù)手段，已廣泛應(yīng)用于中草藥成分的全面分析。也為研究天然產(chǎn)物動(dòng)態(tài)積累規(guī)律開(kāi)辟了全新的途徑，但該領(lǐng)域的研究報(bào)道較少。

本研究采用超高效液相色譜一四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)對(duì)不同采集期北青龍衣進(jìn)行在線分離分析研究，通過(guò)化學(xué)計(jì)量學(xué)模式確定其主要化學(xué)成分變化。利用UPLC一維的保留時(shí)間鎖定化合物，通過(guò)二維的精確質(zhì)量數(shù)和同位素峰度比確定分子式，再通過(guò)對(duì)照品比對(duì)或質(zhì)譜裂解規(guī)律分析確定或推斷其結(jié)構(gòu)式，通過(guò)有效成分動(dòng)態(tài)變化分析，以期為北青龍衣的采收期的確定提供科學(xué)依據(jù)，亦為胡桃屬藥用植物萘醌類成分的質(zhì)譜裂解途徑研究提供借鑒和參考。

1材料

1.1儀器

ACQUITY UPLC（美國(guó)Waters公司，包括二元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱）；ABSCEIX Triple-TOFT 5600 質(zhì)譜儀（AB SCIEX，USA，配有ESI源和APCI源），數(shù)據(jù)采集軟件：Analyst TF1.6software（AB SCEIX，USA）；數(shù)據(jù)處理軟件系統(tǒng)：Peakview 2.0/Masterview1.0 software（AB SCEIX，USA），Markerviewl.2.1（AB SCEIX，USA）；WatersAcquity UPLC BEH C¹⁸色譜柱（2.1mmx100mm，1.7μm），AQUITY UPLC BEH C18 VanGuard Pre-Column預(yù)柱（2.1mmx5 mm，1.7μm）。

KQ-300DB型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA224S-CW型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器公司）；LGl6-W型高速離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）。

1.2試劑

甲醇（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），乙腈（色譜純，Merck，Germany），甲酸（色譜純，F(xiàn)isher，USA），蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

1.3藥材與對(duì)照品

北青龍衣分別于2015年6月29日，7月15日，8月1日，8月16日，9月1日，9月15日采自哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)（東經(jīng)126°7334.9”，北緯45°7488.6”），每采集期（1～6號(hào)采集期）以10棵核桃楸為1組樣本，共計(jì)3組。上述樣品均經(jīng)初東君主任藥師鑒定為胡桃科植物核桃楸J.mandshurica的果實(shí)。剝?nèi)⊥夤ぃL(fēng)處陰干。

胡桃醌（供含量測(cè)定用，成都瑞芬思生物科技有限公司提供，批號(hào)H-075.131230）；胡桃酮（自制，HPLC面積歸一化法測(cè)定純度>98%）。

2方法

2.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱取胡桃醌、胡桃酮對(duì)照品適量，加甲醇制成50mg·L^-1的溶液作為對(duì)照品溶液。

2.2供試品溶液的制備

取不同采集時(shí)期北青龍衣藥材1.0g，加甲醇25mL，精密稱定，超聲處理30min（功率300w，頻率40kHz），放冷，補(bǔ)足甲醇，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液于一80℃凍存，分析前恢復(fù)室溫，13000r·min^-1離心10min，取上清液，即得，樣品標(biāo)號(hào)為BQLY。