王 佳， 徐秀娟， 馬明波， 周文龍

( 浙江理工大學(xué) 材料與紡織學(xué)院， 浙江 杭州 310018 )

天然棕色棉的抗菌性能

王 佳， 徐秀娟， 馬明波， 周文龍

( 浙江理工大學(xué) 材料與紡織學(xué)院， 浙江 杭州 310018 )

為探究天然棕色棉的抗菌特性，以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別作為革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的代表，通過平板菌落計(jì)數(shù)法和比濁法測(cè)試了棕色棉纖維的抗菌性能，并用暈圈法、熒光顯微鏡以及掃描電子顯微鏡分析了棕色棉色素提取物的抗菌活性及抗菌機(jī)制。結(jié)果表明：棕色棉纖維對(duì)2種細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖都有良好的抑制作用，抗菌率分別為87.9%和79.5%；常規(guī)的堿精練和酶精練可在一定程度上提高棕色棉纖維的抗菌性能；棕色棉纖維的抗菌性能來(lái)源于其色素，色素可通過與細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的結(jié)合來(lái)破壞細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，進(jìn)而破壞細(xì)菌正常的生長(zhǎng)和繁殖過程，達(dá)到殺死細(xì)菌的效果。

天然棕色棉； 色素； 抗菌機(jī)制； 細(xì)胞膜

天然彩色棉具有天然的色彩，其在紡織加工過程中避免了染色工序，不但減少了織物染色時(shí)化學(xué)試劑的使用，而且更降低了殘留有毒化學(xué)物質(zhì)的排放，基本可做到化學(xué)物質(zhì)的零使用、零排放及對(duì)環(huán)境的零污染，符合環(huán)保主題[1-2]。天然彩色棉以其天然的色彩、綠色環(huán)保和健康保健等優(yōu)點(diǎn)[3-4]，具有很好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

天然棕色棉的基本形態(tài)和結(jié)構(gòu)與白色棉相似，成熟的纖維呈扁平扭曲帶狀，橫截面呈腰圓形，纖維結(jié)構(gòu)也是由初生胞壁、次生胞壁和中腔3部分組成[5]。與普通白色棉不同的是，棕色棉中腔內(nèi)含有色素，這使其表現(xiàn)出與眾不同的特性，如抗氧化性、抗菌防霉、阻燃、防紫外線等[6]。棕色棉的優(yōu)異性能引起了學(xué)者們對(duì)其色素的研究興趣。羅少宏等[7]用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇/水溶液對(duì)棕色棉色素組分進(jìn)行提取發(fā)現(xiàn)，體積分?jǐn)?shù)為90%以上的乙醇溶液不能對(duì)色素進(jìn)行有效的提取，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇/水溶液提取的色素物質(zhì)組成有所差異。詹少華等[8]用不同的溶劑對(duì)棕色棉色素進(jìn)行提取，并進(jìn)行色素的純化和化學(xué)物質(zhì)的鑒定，推斷棕色棉色素化學(xué)結(jié)構(gòu)含有雙鍵和酚羥基。馬明波等[9]用液相色譜法對(duì)棕色棉色素的種類及分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，棕色棉色素是由一系列結(jié)構(gòu)相似的同系多酚類化合物組成的。

在自然界中，多酚類化合物大都具有較好的抗菌活性，如黃酮類、單寧類、花色素等[10]，因此，本文對(duì)于棕色棉纖維的抗菌性能進(jìn)行了評(píng)估，并對(duì)其抗菌機(jī)制進(jìn)行了研究。首先選用平板菌落計(jì)數(shù)法和比濁法對(duì)棕色棉纖維的抗菌性進(jìn)行定量分析，并用暈圈法和熒光顯微鏡對(duì)色素的抗菌活性進(jìn)行定性研究，在此基礎(chǔ)上，通過掃描電子顯微鏡對(duì)色素的抗菌機(jī)制進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要原料與試劑

天然棕色棉、普通白色棉纖維，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供；氫氧化鈉、氯化鈉，天津市永大化學(xué)試劑有限公司提供；蛋白胨、牛肉膏、瓊脂，杭州百思生物技術(shù)有限公司提供；堿性果膠酶，和氏璧生物技術(shù)有限公司提供；C8-10醇聚氧乙烯6醚，臨沂市蘭山區(qū)綠森化工有限公司提供；熒光顯色劑，天津市大邱莊宏達(dá)化工有限公司提供。

1.2 棉纖維預(yù)處理

白色棉和棕色棉纖維的精練處理參照文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行。

原樣：由于原棉纖維疏水性高，菌液難以被纖維吸收，所以用表面活性劑處理了纖維樣品。纖維于常溫下在質(zhì)量濃度為2 g/L的滲透劑中浸泡1 min，浴比為1∶20，洗滌后置于35 ℃烘箱內(nèi)烘干，白色棉纖維作為對(duì)照樣。

堿處理：100 ℃的質(zhì)量濃度為20 g/L的氫氧化鈉溶液煮沸30 min，浴比為1∶20，洗滌后置于35 ℃烘箱內(nèi)烘干。

酶處理：果膠酶溶液，浴比為1∶20，在55 ℃水浴中恒溫振蕩1 h。其中酶溶液的具體參數(shù)為：滲透劑JFC 2 mL/L、堿性果膠酶2 g/L、pH值調(diào)節(jié)至8.0～9.0。

1.3 棕色棉的抗菌性

根據(jù)AATCC 100—2004《后整理抗菌織物的抗細(xì)菌性評(píng)價(jià)：菌數(shù)測(cè)定法》的平板菌落計(jì)數(shù)法，將接觸各纖維樣本的細(xì)菌液稀釋適當(dāng)梯度，取100 μL細(xì)菌稀釋液均勻涂覆在瓊脂平板上培養(yǎng)，記錄菌落個(gè)數(shù)。

比濁法：用適量生理鹽水洗出接觸纖維樣本的細(xì)菌，以生理鹽水為參照樣，得到的細(xì)菌液在UV754紫外可見分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司)上測(cè)試波長(zhǎng)值為600 nm處的光密度(OD)值。

1.4 棕色棉色素的提取

色素提取參照文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行。取適量棕色棉纖維，磨成粉末，溶于30%乙醇水溶液中，在溫度低于50 ℃的水浴中超聲24 h。經(jīng)過濾濃縮后，冷凍干燥為棕色棉色素粉末。

1.5 抗菌活性測(cè)試方法

根據(jù)AATCC90—1997《紡織材料抗菌活性的評(píng)定方法：瓊脂平皿法》的暈圈法，將細(xì)菌液稀釋適當(dāng)梯度，取100 μL細(xì)菌稀釋液均勻涂覆在瓊脂平板上，依次貼上含有質(zhì)量濃度為30、20、10、5 g/L和不含色素的藥敏紙片，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

熒光顯色法：取1 mL細(xì)菌液，加入色素溶液，置于37 ℃下培養(yǎng)2 h，用去離子水洗滌若干次，離心分離。用異硫氰酸熒光素/磺化丙啶(FITC/PI)雙染色法對(duì)細(xì)菌染色，并在激發(fā)波長(zhǎng)為543、488 nm下拍攝熒光圖。

1.6 色素抗菌性能測(cè)試

取1 mL細(xì)菌液，加入質(zhì)量濃度為30 g/L的色素溶液，置于37 ℃下培養(yǎng)2 h，用去離子水洗滌若干次，離心分離。再依次按30%、50%、70%、85%、90%、100%乙醇脫水后滴加在載玻片上，乙醇揮發(fā)后將樣品鍍金，采用S- 4800場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察并拍攝圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 棕色棉的抗菌性分析

平板菌落計(jì)數(shù)法是常用的記錄菌落個(gè)數(shù)的方法，直觀地表征了接觸不同棉花樣本后細(xì)菌的存活情況。由于細(xì)菌個(gè)數(shù)和其吸光度(在一定的濃度范圍內(nèi))呈線性關(guān)系，因此可用細(xì)菌液的OD值表征細(xì)菌的濃度。本文選取金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌的代表。棕色棉相對(duì)于白色棉的抗菌性能測(cè)試結(jié)果如表1所示?？煽闯?，與普通白色棉相比，天然棕色棉具有明顯的抗菌性，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌率分別為64.8%和53.6%。經(jīng)堿處理和果膠酶處理后，棕色棉抗菌性顯著增加，抗菌率分別增加到79.3%和68.5%。研究表明：未處理的棕色棉纖維色素主要分布在中腔內(nèi)；經(jīng)果膠酶和堿處理后，色素發(fā)生轉(zhuǎn)移，在纖維中分布得更加均勻[11]。與未處理的棕色棉相比，堿處理和酶處理后，色素更易與細(xì)菌直接接觸，增強(qiáng)了其抗菌性。而堿處理由于反應(yīng)劇烈，雜質(zhì)基本被去除，甚至破壞了纖維的部分結(jié)構(gòu)，色素更易遷移到纖維表面，因而其抗菌性比果膠酶處理略好。

表1 利用平板菌落計(jì)數(shù)法和比濁法測(cè)得的 棉纖維樣本的抗菌性能Tab.1 Antimicrobial properties of cotton fiber samples characterized by plate colony-counting and turbidimetry

注：抑菌率=(未接觸樣本的細(xì)菌液OD值-接觸樣本后細(xì)菌液OD值)/未接觸樣本的細(xì)菌液OD值。

2.2 棕色棉色素的抗菌性

馬明波等[12]研究棕色棉的色素發(fā)現(xiàn)，棕色棉良好的抗菌性能主要源于其纖維中的抗菌成分—色素。由于前人沒有對(duì)色素的抗菌活性進(jìn)行定量研究，所以本文通過以不同質(zhì)量濃度的色素所形成抑菌圈的大小來(lái)表征色素的抗菌活性。圖1示出以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為測(cè)試菌，不同質(zhì)量濃度的色素形成的抑菌圈圖。從圖中可明顯地看出，與對(duì)照樣相比，含有色素溶液的藥敏紙片周圍形成了大小不等的抑菌圈，質(zhì)量濃度為30 g/L的色素溶液在涂有金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的平板中形成的抑菌圈直徑分別為24.8 mm和18.3 mm，質(zhì)量濃度為20 g/L的色素形成的抑菌圈直徑分別為21.4 mm和13.2 mm，隨色素質(zhì)量濃度的降低，形成的抑菌圈直徑逐漸減小，不含色素的藥敏紙片周圍細(xì)菌正常生長(zhǎng)，這表明色素對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，與文獻(xiàn)[12]研究結(jié)果一致。

注：a—空白對(duì)照；b—30 g/L色素溶液；c—20 g/L色素溶液； d—10 g/L色素溶液；e—5 g/L色素溶液。圖1 不同質(zhì)量濃度的色素抑菌活性Fig.1 Growth inhibition of bacteria by different concentrations of pigment extracts. (a) S.aureus; (b) E.coli

除抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，殺菌能力對(duì)抗菌紡織材料來(lái)說(shuō)也是至關(guān)重要的。FITC/PI雙染色法[13-14]可用來(lái)研究棕色棉色素的殺菌效果。FITC可使所有細(xì)菌染色，在熒光顯微鏡下顯示綠色，而PI只能使死細(xì)胞顯示紅色。圖2示出金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在接觸棕色棉色素前后細(xì)菌的存活情況?？煽闯觯佑|棕色棉色素前，細(xì)菌(如圖2(a)、(c)所示)基本全部存活，而在接觸棕色棉色素2 h后，大部分細(xì)菌死亡，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率分別為87.9%和79.5%(如圖2(b)、(d)所示)。圖2結(jié)果證明了棕色棉色素具有顯著的殺菌活性。

圖2 接觸棕色棉色素前后細(xì)菌的熒光圖Fig.2 Fluorescence images of bacteria before and after contacting pigment extract.(a) S.aureus before contacting; (b) S.aureus after contacting pigment extract for 2 h; (c) E.coli before contacting; (d) E.coli after contacting pigment extract for 2 h

2.3 抗菌機(jī)制

抗菌性包括抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)和徹底殺死細(xì)菌。棕色棉及色素的抗菌性已得到證明，而研究棕色棉色素的抗菌機(jī)制有助于更好地利用棕色棉的抗菌性能。圖3示出金黃色葡萄球菌和大腸桿菌在接觸棕色棉色素前后的電鏡照片。

圖3 接觸棕色棉色素前后細(xì)菌的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.3 SEM images of bacteria before and after contacting pigment of brown cotton.(a) S.aureus without contacting pigment of brown cotton； (b) S.aureus after contacting pigment of brown cotton；(c) E.coli without contacting pigment of brown cotton； (d) E.coli after contacting pigment of brown cotton

從圖3可看出：接觸色素前，細(xì)菌細(xì)胞的表面比較光滑平整，結(jié)構(gòu)緊湊(見圖3(a)、(c))，而接觸色素2 h后，金黃色葡萄球菌細(xì)胞表面粗糙，并且有小顆粒生成(見圖3(b))；大腸桿菌細(xì)胞表面變得疏松，出現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)紋路(見圖3(d))，表明棕色棉色素與細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生結(jié)合，破壞細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，進(jìn)而破壞細(xì)菌正常的生長(zhǎng)和繁殖過程。這很可能是棕色棉色素抑制和殺滅細(xì)菌的主要原因。由于天然棕色棉的抗菌性和其具有的色素直接相關(guān)，因而色澤的深淺、色素的組成以及不同產(chǎn)地的棕色棉都可能影響抗菌性能。天然棕色棉具體抗菌機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

3 結(jié) 論

天然棕色棉相比普通白色棉具有良好的抗菌性，經(jīng)過堿處理和果膠酶處理后抗菌性得到增強(qiáng)，但綜合考慮后，果膠酶處理棕色棉纖維效果更好。

棕色棉纖維的抗菌性主要源于其色素物質(zhì)，色素可通過與細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生結(jié)合來(lái)破壞細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，進(jìn)而破壞細(xì)菌正常的生長(zhǎng)和繁殖過程，以達(dá)到殺死細(xì)菌的效果。

FZXB

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Antimicrobial properties of natural brown cotton

WANG Jia， XU Xiujuan， MA Mingbo， ZHOU Wenlong

(CollegeofMaterialsandTextiles,ZhejiangSci-TechUniversity,Hangzhou,Zhejiang310018,China)

To explore the antimicrobial properties of natural brown cotton, plate colony counting method and turbidimetry method were used to test the antimicrobial properties against gram-positive bacteriaS.aureusand gram-negative bacteriaE.coli. Meanwhile, the antimicrobial activity and antimicrobial mechanism of the pigment extract were also studied by disk diffusion method, fluorescence microscopy and scanning electron microscopy. The results showed that brown cotton fibers have good inhibitory effect on the growth of two test bacteria and its antimicrobial ratio are 87.9% and 79.5%, respectively, showing significant antimicrobial properties of brown cotton fibers. Conventional alkali scouring and enzyme scouring can improve the antimicrobial properties of brown cotton fibers to a certain extent. Brown cotton fibers′ antimicrobial properties derive from its pigment. The pigment may destroy the transport capacity of cell membrane by combination with membrane structure of bacteria and then inhibit the normal growth and reproduction process of bacteria to achieve the effect of killing bacteria.

natural brown cotton； pigment； antimicrobial mechanism； cell membrane

2016-03-07

2016-08-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51373156)

王佳(1991—)，女，碩士生。研究方向?yàn)樾滦图徔棽牧霞熬G色紡織品。周文龍，通信作者，E-mail: wzhou@zstu.edu.cn。

10.13475/j.fzxb.20160301705

TS 190.2

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