喻志東，王紅宇

(自貢市第一人民醫(yī)院兒科，四川 自貢 643000)

髓系抑制細胞、Th17細胞在哮喘患兒外周血中的表達

喻志東，王紅宇

(自貢市第一人民醫(yī)院兒科，四川 自貢 643000)

目的 分析髓系抑制細胞(MDSCs)及Th17細胞在哮喘患兒外周血中的表達情況和臨床意義。方法 選取自貢市第一人民醫(yī)院兒科2013年6月至2015年8月收治的120例哮喘患兒作為觀察組，另外選擇87例健康兒童作為對照組。應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測MDSCs、Th17細胞在哮喘患兒外周血中的表達情況。結(jié)果 和對照組相比，觀察組MDSCs占有核細胞的百分比和Th17細胞占單個核細胞的百分比都顯著升高(Hc值分別為56.14、45.98，均P<0.05)，差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)論 從MDSCs、Th17細胞在哮喘患兒外周血中的表達情況來看，它們可能參與了嬰幼兒哮喘的發(fā)生與發(fā)展過程。

髓系抑制細胞；Th17細胞；哮喘患兒；外周血

眾所周知，哮喘是嬰幼兒最常見的氣道慢性疾病。雖然傳統(tǒng)的治療手段(吸入性糖皮質(zhì)激素或者聯(lián)合應(yīng)用β2受體激動劑)能夠控制大部分輕中度哮喘患兒，但是對于部分哮喘患兒，傳統(tǒng)的治療方法很難達到良好的治療效果。髓系抑制細胞(myeloid derived suppressor cells,MDSCs)的發(fā)現(xiàn)始于20世紀80年代的腫瘤患者體內(nèi)，是一群異質(zhì)性細胞群,主要來源于未成熟的髓細胞及骨髓祖細胞，具有很強的免疫調(diào)節(jié)能力[1-2]，也與哮喘肺部炎癥及氣道重塑的發(fā)生有關(guān)[3-4]。輔助性T細胞17(T helper cell 17，Th17)是一類新的CD4+T細胞亞群，亦與哮喘息性疾病有關(guān)。因此，本文主要分析了MDSCs及Th17細胞在哮喘患兒外周血中的表達情況，同時也探討了二者在嬰幼兒哮喘疾病中的可能作用。

1對象和方法

1.1研究對象

選取自貢市第一人民醫(yī)院兒科2013年6月至2015年8月收治的120例哮喘患兒為觀察組，其中男54例，女66例，年齡3～10歲，平均年齡5.6±2.8歲。同時，選取87例健康兒童為對照組，其中男47例，女40例，年齡3～10歲，平均年齡6.2±2.1歲。對照組兒童無特殊疾病史，在半個月內(nèi)無感染病史。哮喘患兒的納入標準：①以《咳嗽的診斷與治療指南(2009版)》的診斷為依據(jù)，符合哮喘病的診斷標準；②患兒首次診斷為哮喘病，并且在15天內(nèi)沒有呼吸道感染病史；③患兒沒有激素或者免疫調(diào)節(jié)劑用藥史。排除標準：①患兒有心臟或肝腎等重要器官功能不全病史；②患兒有肺部其他疾??；③患兒的氣道有不明原因的發(fā)育畸形。選取的所有研究對象均取得家長同意，同時也符合倫理學標準。

1.2實驗材料

試驗所用儀器和材料：流式細胞儀、低溫高速離心機、熒光顯微鏡、渦旋混合機、酶標儀、自動細胞分類計數(shù)儀、IL-17 ELISA試劑盒、人Ficoll淋巴細胞分離液、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、淋巴細胞分離液。

1.3 MDSCs膜表面的標記與染色

在外周血中，用CD14-HLA-DR-CD33+CD11b+表示MDSC的表達，具體實驗步驟如下：①向流式管中加入100μL抗凝血，同時取出熒光抗體將其放入冰盒中；②分別向?qū)?yīng)的試管中加入單克隆抗體CD33-PE、CD11b-APC、HLA-DR-FITC及CD14-PEcP各2μL，以上步驟均在避光下操作，并反應(yīng)15min；③上述步驟結(jié)束后分別向各個流式管中加入1mL溶血劑，混勻，在避光條件下反應(yīng)10min，然后加入PBS，充分混勻后采用流式細胞儀檢測。為了防止非染色體染色，在同型對照管中加入同型對照抗體，并調(diào)節(jié)電壓及熒光進行補償。

1.4外周血單個核細胞的獲取及Th17細胞檢測

具體實驗步驟如下：①分別收集觀察組及對照組患兒空腹靜脈血3mL，將其用于MDSCs(1mL)及Th17細胞(2mL)的檢測；②首先取2mL靜脈血，以1:1的比例與PBS稀釋混勻，然后將其放入含有等體積的人淋巴細胞分離液的離心管中，離心15min(1 500prm)；③用PBS洗滌吸取出來的云霧層，用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞懸浮液的濃度，然后將其加到養(yǎng)板中，并加入2μL 50μg/mL 聚丙烯酸(pacific maritime association，PMA)，1μL 100ng/mL 伊屋諾霉素(ionomycin)，最終將其放置在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)5h；④在同型對照管中加入1×106/mL的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，并加入10μL CD4-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer ，F(xiàn)ITC)，在避光的條件下孵育40min；⑤孵育后，洗滌上清液后用多聚甲醛將其固定，在室溫的條件下孵育30min，離心取上清液；⑥取出上清液后加入相應(yīng)的對照抗體，在室溫、避光的條件下，孵育15min，PBS洗滌，離心棄上清，加入PBS溶液200μL，充分混勻，流式細胞儀檢測。

1.5統(tǒng)計學方法

2結(jié)果

2.1 MDSCs占有核細胞的百分比

觀察組患兒的外周血中MDSCs占有核細胞的百分比與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(Hc=56.14，P<0.05)，見表1、圖1。

2.2 Th17細胞占單個核細胞的百分比

觀察組患兒的外周血中Th17細胞占單個核細胞的百分比與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(Hc=45.98，P<0.05)，見表1、圖2。

表1 觀察組與對照組MDSCs、Th17百分比結(jié)果[P50(P25，P75)]

Table 1 Proportion of MDSCs and Th17 cells in control group and observation group [P50(P25,P75)]

注：A為對照組，B為觀察組。

圖1 MDSCs占有核細胞的百分比結(jié)果

Fig.1 Percentage of MDSCs in nuclear cells

注：A為對照組，B為觀察組。

圖2 Th17細胞占單個核細胞的百分比結(jié)果

Fig.2 Percentage of Th17 cells in mononuclear cells

3討論

3.1 MDSCs細胞在哮喘患兒外周血中的表達情況

哮喘是一種氣道慢性疾病，隨著對哮喘發(fā)病機制的不斷研究，人們認識到它的發(fā)病機制不應(yīng)該僅僅局限于肺部組織，還應(yīng)該重視全身的反應(yīng)機制。相關(guān)實驗證明哮喘的氣道炎癥與骨髓干細胞密切相關(guān)[5]。MDSCs是一群異質(zhì)細胞群，它不僅在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，而且在膿毒血癥、病毒感染、急慢性非特異性炎癥，以及哮喘等自身免疫性疾病中也扮演著重要的角色。在人體內(nèi)，MDSCs的主要表面標志有兩種，一是CD33+CD11b+CD14-細胞群，二是Lin-HLA-DR-CD33+[6]。本研究中，以CD14-HLA-DR-CD33+CD11b+作為MDSCs的表面標志表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，觀察組患兒體內(nèi)的MDSCs的比例顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義，其原因可能有以下幾點：①有研究報道造成患兒哮喘的主要原因就是呼吸道病毒[7]?？芍狹DSCs不但能促使腫瘤細胞的免疫逃逸，還可以促使呼吸道病毒的免疫逃逸，當病毒在宿主細胞內(nèi)增殖并長期存在后就可以形成呼吸道慢性炎癥;②有研究表明，感染中釋放的一些炎癥因子，例如，白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6等，可以誘導MDSCs的產(chǎn)生[8]，這可能是造成觀察組比對照組MDSCs比例升高的主要原因;③當MDSCs高表達時可誘導一氧化氮合酶，進而生成高濃度的一氧化氮。高濃度的一氧化氮不但能使微血管發(fā)生滲出的情況，還可以使支氣管上皮細胞出現(xiàn)脫落甚至發(fā)生功能性的改變，從而使氣道的炎癥反應(yīng)加劇。

3.2 Th17細胞在哮喘患兒外周血中的表達情況

Th17細胞是一種輔助細胞，它主要通過分泌一些炎癥因子來參與心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)等的疾病的發(fā)生。例如，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、IL-17A/F等都是Th17細胞分泌的炎癥因子。IL-17細胞是一種強大的前炎癥因子，它和中性粒細胞的增殖、分化息息相關(guān)。研究表明：在小鼠肺部炎癥反應(yīng)中，IL-17及Th17細胞的水平都有明顯增高的趨勢[8]。還有研究發(fā)現(xiàn)，Th17細胞參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程，并和哮喘病情呈正相關(guān)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，和對照組相比，觀察組哮喘患兒Th17細胞占單個核細胞的比例顯著升高，其差異有統(tǒng)計學意義，這表明Th17細胞參與哮喘的發(fā)病過程。

綜上所述，MDSCs和Th17細胞在哮喘患兒外周血中的表達可能在嬰幼兒哮喘疾病的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要的角色，但是要想弄清楚它們在哮喘疾病中的具體作用機制還需要做更深入的研究。

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[專業(yè)責任編輯：侯 偉]

Expressions of MDSCs and Th17 cells in peripheral blood of children with asthma

YU Zhi-dong, WANG Hong-yu

(DepartmentofPediatrics,FirstPeople’sHospitalofZigong,SichuanZigong643000,China)

Objective To analyze the expressions and clinical significance of myeloid derived suppressor cells (MDSCs) and Th17 cells in peripheral blood of children with asthma. Methods Totally 120 children with asthma in First People’s Hospital of Zigong from June 2013 to August 2015 were selected in observation group, and 87 healthy children were selected in control group. The expressions of MDSCs and Th17 cells in peripheral blood of children with asthma were detected by flow cytometry. Results Compared to the control group, in the observation group, the percentages of MDSCs cells in nuclear cells and Th17 cells in mononuclear cells were significantly increased (Hc value was 56.14 and 45.98, respectively, bothP<0.05), and the differences were statistically significant. Conclusion Seeing from the expressions of MDSCs and Th17 cells in peripheral blood of children with asthma, we suspect that MDSCs and Th17 cells may involve in the occurrence and development of child asthma.

myeloid derived suppressor cells (MDSCs); Th17 cells; children with asthma; peripheral blood

2016-08-29

喻志東(1979-)，男，主治醫(yī)師，主要從事小兒呼吸內(nèi)科工作。

王紅宇，主任醫(yī)師。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.02.008

R725.6

A

1673-5293(2017)02-0124-02