胡明珠， 李 磊， 曹 蕾， 張一梅， 羅海華， 胡水旺， 劉愛華， 姜 勇△

(1 南方醫(yī)科大學病理生理學教研室， 廣東省蛋白質(zhì)組學重點實驗室， 2南方醫(yī)院呼吸科， 廣東 廣州 510515)

PXD101 誘導(dǎo)人前列腺癌細胞PC3凋亡的線粒體信號通路*

胡明珠1， 李 磊1， 曹 蕾1， 張一梅1， 羅海華1， 胡水旺1， 劉愛華2， 姜 勇1△

(1南方醫(yī)科大學病理生理學教研室， 廣東省蛋白質(zhì)組學重點實驗室，2南方醫(yī)院呼吸科， 廣東 廣州 510515)

目的： 探討PXD101(又稱belinostat)誘導(dǎo)人前列腺癌PC3細胞凋亡的線粒體通路。方法: PXD101以不同刺激時間和劑量處理PC3細胞，CCK-8法檢測細胞的活力；流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡率和線粒體膜電位；Western blot檢測線粒體凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、細胞色素C(Cyt C)和Bax； caspase-3活性檢測試劑盒檢測caspase-3活性。結(jié)果: PXD101能以時間和劑量依賴的方式抑制PC3細胞的存活(P<0.05)，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明PXD101處理后PC3細胞的凋亡率明顯增加(P<0.01)。PXD101能時間依賴性致線粒體膜電位降低和Bcl-2 蛋白含量明顯下降，Bax蛋白含量上升，促進線粒體釋放Cyt C 蛋白，caspase-3活性明顯增強。結(jié)論: PXD101通過線粒體途徑誘導(dǎo)人前列腺癌細胞系PC3細胞凋亡。

前列腺癌； PXD101； 細胞凋亡； 線粒體； PC3細胞

前列腺癌在歐洲等國家居男性惡性腫瘤發(fā)病率的首位，致死率一直位居前3名，而在中國，近幾年前列腺癌發(fā)病率也呈上升趨勢[1-3]。

癌細胞凋亡在抑制前列腺癌疾病進展過程中起著關(guān)鍵性作用[4-5]。PXD101(又稱belinostat)是一種有效的異羥肟酸類組蛋白脫乙酰酶(histome deacetylase， HDAC)抑制劑，在體外是有細胞毒性的，這種毒性增強了化療作用[6-7]，且可以延遲卵巢癌和結(jié)腸癌中腫瘤的生長[8-9]。然而，PXD101在前列腺癌進展過程中的作用及其機制研究甚少，弄清PXD101誘導(dǎo)前列腺癌細胞凋亡的機制是突破點。現(xiàn)以PC3細胞為模型，探究PXD101誘導(dǎo)前列腺癌細胞凋亡的線粒體信號通路，為臨床治療前列腺癌提供參考。

材 料 和 方 法

1 細胞培養(yǎng)

人前列腺癌細胞系PC3由本實驗室保存，采用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，待細胞生長至80%～90%融合度時進行傳代。

2 主要試劑

PXD101(Denmark)；RPMI-1640培養(yǎng)液和血清(Gibco)；CCK-8活力檢測試劑盒(南京恩晶生物科技有限公司)；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡雙染試劑盒(凱基公司)；JC-1染液(Molecular Probes)；抗Bcl-2和Bax抗體(Cell Signaling Technology)；caspase-3活性檢測試劑盒(Sigma)；兔抗caspase-3抗體(Sigma)；抗β-actin mouse mAb(HRP Conjugate)及HPR標記的抗鼠IgG購自CST； HPR標記的羊抗兔IgG購自Proteintech；其它試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

3 主要方法

3.1 CCK-8法檢測細胞活力 將PC3細胞以每孔5 000個接種于96孔板中，每孔100 μL培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h后，向培養(yǎng)板中加入100 μL培養(yǎng)基，給予不同濃度PXD101(0、1、10和100 μmol/L)刺激48 h或10 μmol/L PXD101刺激不同時間(0、12、24和48 h)，空白組為不含細胞的培養(yǎng)基，每組設(shè)3個復(fù)孔。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)到達相應(yīng)時點后，除去原有培養(yǎng)基，并用新的培養(yǎng)基洗滌細胞2次，然后加入新的培養(yǎng)基和10 μL CCK-8，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀下測定450 nm波長處的吸光度(A)。

3.2 流式細胞術(shù)檢測PC3細胞凋亡 PC3細胞以每孔1×105個接種于6孔板，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基，給予10 μmol/L的PXD101刺激不同時間(0、24和28 h)。收集細胞及上清，根據(jù)試劑盒操作說明進行流式細胞定量分析。

3.3 線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential， MMP)的測定 取對數(shù)生長期的PC3細胞，以每孔1×105接種于6孔板內(nèi)。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h后更換培養(yǎng)基，給予10 μmol/L的PXD101刺激不同時間(0、24、28 h)。以終濃度為5 μmol/L JC-1，充分混勻后37 ℃孵育15 min，DPBS清洗去除殘余的JC-1后，流式細胞儀測定樣本。其中激發(fā)波長488 nm，應(yīng)用側(cè)向散射光(SSC)和前向散射光(FSC)圈定要分析的細胞后，每個樣本獲取10 000個細胞。應(yīng)用流式細胞儀軟件分析數(shù)據(jù)。

3.4 Western blot檢測蛋白表達 取對數(shù)生長期PC3細胞， 以每孔2×105接種于6孔板中。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h后更換培養(yǎng)基，給予10 μmol/L的PXD101刺激不同時間(0、12、24和48 h), 收集各組細胞，用DPBS 洗2次，加入150 μL RIPA裂解液，置于冰上30 min。13 000×g離心10～15 min， 取上清，BCA蛋白定量后，加5×上樣緩沖液，98 ℃變性5 min，采用12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，之后電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h，加入I 抗4 ℃孵育過夜。用TBST漂洗膜3次后，加入辣根過氧化酶標記的 II抗，室溫孵育1 h。用TBST 漂洗3次，經(jīng)SuperSignal West Pico化學發(fā)光底物顯色，利用Kodak IS4 000R圖像工作站進行化學發(fā)光檢測。圖片掃描后使用Gelpro軟件測量蛋白條帶的灰度值。

3.5 Caspase-3蛋白活性的檢測 取對數(shù)生長期PC3細胞， 以每孔2×105接種于6孔板中。37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基，給予10 μmol/L的PXD101刺激不同時間(0、8、12和24 h), 收集各組細胞，按照caspase-3活性檢測試劑盒說明書進行操作。以488 nm激發(fā)光，525 nm發(fā)射光的M5酶標儀進行檢測。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較行SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 PXD101對細胞活力的影響

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，PXD101能夠引起PC3細胞的活力下降，抑制細胞的生長，并且呈現(xiàn)劑量和時間依賴性，10 μmol/L PXD101刺激24 h能夠引起PC3細胞的活力下降36.3%(P<0.01)，見圖1。

2 PXD101誘導(dǎo)PC3細胞凋亡

流式細胞術(shù)結(jié)果表明，PXD101刺激24 h組的凋亡率為18.01%±2.37%，刺激48 h組的凋亡率為48.27%±5.10%，與對照組(3.85%±1.22%)相比，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)，見圖2。

3 PXD101引起PC3細胞線粒體膜電位的變化

本研究中采用熒光探針JC-1的單體JC-1/聚合率比率這一指標反映線粒體膜電位。結(jié)果表明PXD101刺激后，單體JC-1/聚合率比例有所增加，PXD101刺激24 h組比例增加至對照組的(5.65±0.41)倍，刺激48 h組比例增加至對照組的(30.14±2.00)倍，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)，見圖3。

Figure 1.The effect of PXD101 on PC3 cell viability detected by CCK-8 assay. A: the viability of the PC3 cells treated with PXD101 at different doses; B: the dynamic change of PC3 cell viability induced by 10 μmol/L PXD101 treatment for different time. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group；##P<0.01vs0 h group.

圖1 PXD101對PC3細胞活性的影響

Figure 2.The effect of PXD101 on the apoptotic rate of PC3 cells detected by flow cytometry. Mean±SD.n=3.##P<0.01vs0 h group.

圖2 PXD101對PC3細胞凋亡的影響

Figure 3.The effect of PXD101 on the mitochondrial membrane potential of PC3 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vs0 h group.

圖3 PXD101對PC3細胞線粒體膜電位的影響

4 PXD101通過線粒體通路介導(dǎo)PC3細胞發(fā)生凋亡

為更進一步研究PXD101誘導(dǎo)PC3細胞發(fā)生凋亡的分子機制，采用Western blot對線粒體介導(dǎo)的凋亡通路所涉及的一系列信號分子進行檢測，并提取了PC3細胞的胞質(zhì)和線粒體蛋白測定細胞色素C(cytochrome C， Cyt C)的表達，結(jié)果表明，PXD101刺激后，隨著時間的延長，Bcl-2 蛋白含量明顯下降，Bax蛋白含量上升，線粒體Cyt C 蛋白從線粒體釋放入胞漿，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖4。

Figure 4.The expression of mitochondrial apoptosis pathway-related proteins Bcl-2, Bax, cytoplasmic cytochrome C (cyto-Cyt C) and mitochondrial cytochrome C (mito-Cyt C) determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 h group.

圖4 PXD101對PC3細胞線粒體通路相關(guān)蛋白表達的影響

5 PXD101引起PC3細胞caspase-3活性改變

Caspase-3活性檢測表明，PXD101刺激PC3細胞后，隨著時間的延長，caspase-3活性逐漸增強，刺激24 h時檢測A值增加至0 h的(6.66±0.94)倍，差異有統(tǒng)計學顯著性(P<0.01)，見圖5。

Figure 5.Effects of treatment with PXD101 for different time on the changes of caspase-3 activity in the PC3 cells. Mean±SD.n=3.##P<0.01vs0 h group.

圖5 PXD101對PC3細胞caspase-3酶活性的影響

討 論

前列腺癌是常見的非皮膚癌，近幾年隨著研究的深入與技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究表明表觀遺傳學的改變在癌細胞中起著重要作用[10]，所以通過乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化或三磷酸腺苷核糖基化來修飾組蛋白是一個重要的治療途徑，而在這些修飾中，組蛋白N末端尾部賴氨酸殘基的乙?；軌蝻@著降低組蛋白對DNA的親和力，導(dǎo)致與腫瘤抑制和(或)分化相關(guān)基因的表達[11]。這就提示我們HDAC抑制劑對于治療癌癥具有非常重要的意義和前景。有研究表明，HDAC在前列腺癌中的活性升高，這也促進了HDAC抑制劑作為抗腫瘤藥物的研發(fā)[12-13]，但是目前用于臨床的HDAC抑制劑只有辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)，而且僅用于皮膚T細胞淋巴瘤。而近幾年關(guān)于新型羥肟酸類 HDAC 抑制劑PXD101研究越來越多，而對于它促進癌細胞凋亡的機制尚不完善。為了探討PXD101對前列腺癌細胞凋亡的影響，本課題選取人前列腺癌細胞系PC3，采用CCK-8法檢測了不同濃度及不同處理時間下，PXD101對PC3細胞活性的影響，結(jié)果表明，PXD101能夠明顯降低PC3細胞活性，并且呈現(xiàn)劑量與時間依賴性。進一步研究PXD101所導(dǎo)致的PC3細胞活性下降是否與細胞凋亡相關(guān)，流式細胞技術(shù)分析結(jié)果顯示，PXD101能夠顯著地引起PC3細胞發(fā)生凋亡。

研究表明，PXD101促進癌細胞凋亡與Bcl-2蛋白家族有關(guān)[14-15]，而Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡的線粒體途徑中起著重要作用，因此我們進一步研究PXD101促進前列腺癌細胞凋亡是否是通過線粒體途徑。流式細胞術(shù)結(jié)果表明，PXD101呈時間依賴性地致MMP降低，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Bcl-2 蛋白含量明顯下降，Bax蛋白含量上升，線粒體Cyt C從線粒體釋放到胞漿。Caspase-3活性檢測試劑盒檢測caspase-3 活性增強。這提示PXD101誘導(dǎo)PC3細胞凋亡是通過線粒體凋亡通路的。

綜上所述，PXD101通過線粒體途徑誘導(dǎo)人前列腺癌細胞系PC3細胞凋亡，從而阻止前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。本研究針對臨床治療前列腺癌提供了新的思路。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

PXD101 induces apoptosis of human prostate cancer cell line PC3 by mitochondrial signal pathway

HU Ming-zhu1, LI Lei1, CAO Lei1, ZHANG Yi-mei1, LUO Hai-hua1, HU Shui-wang1, LIU Ai-hua2, JIANG Yong1

(1DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofProteomicsofGuangdongProvince,SouthernMedicalUniversity,2DepartmentofRespiratoryDisease,NanfangHospital,Guangzhou510515,China.E-mail:jiang48231@163.com)

AIM: To explore the mitochondrial pathway in the apoptosis of PC3 cells induced by PXD101 (also named as belinostat). METHODS: PC3 cells were treated with PXD101 at different doses or stimulated with PXD101 for different time. The effect of PXD101 on the viability of PC3 cells was measured by CCK-8 assay. The apoptotic rates and the mitochondrial membrane potential (MMP) were analyzed by flow cytometry. The protein levels of Bcl-2, Bax and cytochrome C (Cyt C) were determined by Western blot. The caspase-3 activity were tested by caspase-3 activity assay kit.RESULTS: The viability of the PC3 cells was inhibited by PXD101 in a dose- and time-dependent manner. Flow cytometric analysis showed that the apoptotic rates were increased in the cells treated with PXD101 (P<0.01). At the same time, PXD101 induced the decreases in MMP and Bcl-2, the release of Cyt C, and the increase in caspase-3 activity. CONCLUSION: PXD101 induces the apoptosis of human prostate cancer cell line PC3 by mitochondrial signal pathway.

Prostate cancer; PXD101; Apoptosis; Mitochondria; PC3 cells

1000- 4718(2017)05- 0793- 05

2017- 01- 05

2017- 03- 15

國家自然科學基金資助項目(No. 81372030)； 南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院院長基金(No. 2015Z005)

R363.21； R730.23； R737.25

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2017.05.005

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△通訊作者 Tel: 020-61648231； E-mail: jiang48231@163.com