王榮霞黃 敏陳傅曉譚 圍

（1海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，海南海口570203；2海南省熱帶海水養(yǎng)殖技術(shù)重點實驗室，海南省熱帶海水養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，海南?？?70203；3南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東廣州510275）

棒葉蕨藻變種對重金屬Cu2＋、Pb2＋和Cd2＋脅迫的生理響應(yīng)

王榮霞1，黃 敏1，2，陳傅曉1，3，譚 圍1，3

（1海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，海南海口570203；2海南省熱帶海水養(yǎng)殖技術(shù)重點實驗室，海南省熱帶海水養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，海南?？?70203；3南海生物資源開發(fā)與利用協(xié)同創(chuàng)新中心，廣東廣州510275）

為研究棒葉蕨藻變種（Caulerpa sertularoides f.Longipes）對重金屬離子脅迫的生理響應(yīng)，通過恒溫光照培養(yǎng)方法探討棒葉蕨藻變種在重金屬銅離子（Cu2＋）、鉛離子（Pb2＋）、鎘離子（Cd2＋）的脅迫下對其日特定生長率（SGR）、可溶性蛋白含量、葉綠素a（Chl－a）、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）和超氧化物歧化酶（SOD）等指標(biāo)的影響。結(jié)果顯示，3種重金屬離子的脅迫會影響藻體的正常生長，SGR均出現(xiàn)負增長，可溶性蛋白和Chl－a含量隨處理濃度的增大而呈下降趨勢，其中Cu2＋的影響尤為明顯；重金屬對藻體生長的抑制能力大小為Cu2＋＞Pb2＋＞Cd2＋；3種重金屬離子對SOD和GST影響均表現(xiàn)為先升后降趨勢，除了Cd2＋對SOD影響峰值出現(xiàn)在5.00 mg／L之外，其他處理組的峰值均出現(xiàn)在質(zhì)量濃度為2.50mg／L時。研究結(jié)果可為棒葉蕨藻變種的重金屬脅迫機理研究提供參考。

棒葉蕨藻變種；重金屬；脅迫；生理響應(yīng)

海藻與植物一樣，體內(nèi)產(chǎn)生的活性氧與其清除系統(tǒng)保持著動態(tài)的平衡，當(dāng)環(huán)境中存在逆境脅迫時，抗氧化系統(tǒng)會增強，從而達到對抗逆境的作用［1］。重金屬對水體的污染日漸嚴(yán)重，如果重金屬脅迫長期存在，植物細胞會產(chǎn)生大量自由基損傷細胞膜中不飽和脂肪酸和蛋白質(zhì)，使細胞膜結(jié)構(gòu)松散，嚴(yán)重時會影響細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，對藻體產(chǎn)生巨大傷害甚至死亡［2－4］。國內(nèi)有關(guān)海藻重金屬脅迫下抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)有少量的報道研究，如：鈍頂螺旋藻在CdCl2脅迫下，超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性隨著濃度增加呈現(xiàn)出先上升后下降的規(guī)律［5］；龍須菜隨著Cd2＋濃度的升高，其生長受到抑制，藻紅素、葉綠素a、可溶性蛋白均呈下降趨勢［6］。

棒葉蕨藻變種 （Caulerpa sertularoides f.Longipes）屬于綠藻門，綠藻綱，蕨藻目，蕨藻科，蕨藻屬。對棒葉蕨藻變種的研究主要集中在養(yǎng)殖廢水中的氨氮、硝酸鹽氮的吸收［7］，以及南美白對蝦［8］和番紅硨磲［9］生態(tài)養(yǎng)殖模式構(gòu)建等方面，而其對重金屬離子脅迫的生理響應(yīng)等方面的文獻報道甚少。本研究著重針對棒葉蕨藻變種對重金屬Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋脅迫的生理響應(yīng)，旨在深入探討重金屬對大型海藻藻體內(nèi)的生理生化指征的影響，為重金屬脅迫機理研究以及大型海藻進行養(yǎng)殖廢水處理、改善海區(qū)環(huán)境研究提供應(yīng)用參考。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

棒葉蕨藻變種取自海南省三沙市西沙海域的珊瑚礁盤上，先在室外大量擴繁，再在智能人工氣候培養(yǎng)箱（賽福PRX－350B）中暫養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度25℃，光照度為8 000～9 000 Lx，鹽度31。

1.2 方法

設(shè)置3組培養(yǎng)液：Cu2＋（A組）、Pb2＋（B組）、Cd2＋（C組）。每組培養(yǎng)液設(shè)計一個空白對照（0.00 mg／L）和 5個濃度梯度，分別為 0.05、0.50、2.50、5.00和10.00 mg／L?？瞻讓φ战M分別標(biāo)記為A0、B0和C0，0.05 mg／L實驗組標(biāo)記分別為A1、B1和C1，其他組別以此類推。實驗用1 L燒杯裝800 mL培養(yǎng)液，在每個燒杯中接種3 g健康藻體，每組金屬離子培養(yǎng)液各濃度梯度均設(shè)平行3組，培養(yǎng)6 d，每天對培養(yǎng)的棒葉蕨藻變種進行觀察，并紀(jì)錄表征變化情況。在第6天分別測定日特定生長率（SGR）、可溶性蛋白含量、谷胱甘肽－s轉(zhuǎn)移酶（GST）、超氧化物歧化酶（SOD）活性等指標(biāo)。

特定生長率（SGR）計算公式：

FSGR＝［（Wt／W0）1／t－1］×100%

式中：W0—初始時刻棒葉蕨藻變種的鮮重，g；Wt—t時刻棒葉蕨藻變種的鮮重，g；t—兩次測定間隔時間，d；FSGR—特定生長率，%／d。

葉綠素a測定參照劉濤等［10］方法，可溶性蛋白、谷胱甘肽－s轉(zhuǎn)移酶（GST）、超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定分別采用南京建成生物公司購買的可溶性蛋白、谷胱甘肽－s轉(zhuǎn)移酶（GST）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理。SGR等指標(biāo)在系列濃度重金屬下的變化趨勢采用線性回歸分析（Linear Regression Analysis）方法進行分析。

2 結(jié)果

2.1 藻體的表征變化

A0、B0和C0組連續(xù)培養(yǎng)6 d，藻體正常。A2組和A3組在培養(yǎng)的第2天藻體棒葉開始出現(xiàn)白化，而A4和A5組在培養(yǎng)的第2天藻體棒葉、假根出現(xiàn)白化和變細。至第6天，A1和A2組棒葉、假根白化、變軟；A3、A4和A5組藻體則出現(xiàn)部分白化。在第3天，B3、B4和B5組藻體棒葉、假根開始出現(xiàn)少量白化現(xiàn)象；至第6天，B3、B4和B5組藻體匍匐枝、直立枝、棒葉、假根均出現(xiàn)了白化、脫落，B5組部分藻體出現(xiàn)潰爛，B1和B2組藻體的棒葉、假根開始出現(xiàn)白化和變細；C2、C3、C4和C5組的藻體匍匐枝出現(xiàn)白化、變細，直立枝、棒葉、假根出現(xiàn)白化、脫落。至第6天，C4和C5組的藻體匍匐枝、直立枝、棒葉、假根均出現(xiàn)嚴(yán)重白化、脫落現(xiàn)象；至第6天，C1和C2組藻體的棒葉、假根開始出現(xiàn)白化、變軟。

2.2 日特定生長率的變化

圖1顯示了藻體在培養(yǎng)第6天的FSGR值，其與Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)出負相關(guān)性（R2分別為0.917、0.980、0.978），表明藻體的FSGR隨著Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋質(zhì)量濃度增加而下降，出現(xiàn)了負增長，其中Cu2＋的下降速率（k＝－1.775）大于Pb2＋（k＝－1.040）、Cd2＋（k＝－0.942）。由圖1可以看出，A1組（FSGR＝－3.13%／d）在培養(yǎng)的第6天對藻體的生長起到非常明顯的抑制作用，而B1組（FSGR＝－0.33%／d）和C1組（FSGR＝－0.39%／d）對藻體的抑制作用遠小于A1組。

圖1 SGR隨Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋質(zhì)量濃度變化情況Fig.1 Changes of SGR according to Cu2＋，Pb2＋and Cd2＋concentrations

2.3 可溶性蛋白含量的變化

藻體的可溶性蛋白與Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋質(zhì)量濃度均呈現(xiàn)出負相關(guān)性（R2分別為0.905，0.943，0.976），表明藻體的可溶性蛋白含量隨著Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋質(zhì)量濃度的增大而呈下降趨勢（圖2）。

圖2 不同Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋質(zhì)量濃度下可溶性蛋白含量變化Fig.2 Changes of soluble proteins according to different Cu2＋，Pb2＋and Cd2＋concentrations

其中，A組的下降速率（k＝－0.619）高于B組（k＝－0.588）和C組（k＝－0.550）。在實驗的第6天，A0、B0和C0組的可溶性蛋白含量分別為3.30、3.06和3.14 mg／g；A1、B1和C1組可溶性蛋白含量僅為A0、B0和C0組的59.1%、91.2%和89.6%；而A5、B5和C5組在實驗的第6天分別降至0.11、0.22和0.32 mg／g。

2.4 葉綠素a含量的變化

圖3表明，Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋對藻體Chl－a含量的影響與可溶性蛋白的相似，藻體Chl－a的含量隨著Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋處理濃度的增大而呈下降趨勢，其中A組的下降最為明顯，B組次之。實驗第6天，A0、B0和C0組的Chl－a含量分別為0.53、0.52和0.56 mg／g，是A3組的6.2倍、B3和C3組的2倍。

圖3 不同Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋質(zhì)量濃度下Chl－a的含量變化Fig.3 Changes of chlorophyll－a according to different Cu2＋2＋，Pb2＋and Cd2＋concentrations

2.5 超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋對藻體SOD活性的影響隨著處理濃度的增加呈現(xiàn)出先升后降的趨勢。從圖4中可以發(fā)現(xiàn)，各處理組的SOD值均高于空白對照組（A0、B0和 C0），說明達到0.05 mg／L以上的Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋對藻體均具有脅迫作用。

實驗第6天，當(dāng)A組的濃度≤2.50 mg／L時，SOD與培養(yǎng)液中Cu2＋的濃度呈正相關(guān)；在濃度2.50 mg／L時 SOD值達到峰值（195.54 U／mg prot），為 A0組的 4倍；濃度＞2.50 mg／L時，SOD值有所下降。實驗第6天，B0組的SOD值為37.89 U／mg prot，SOD隨著Pb2＋濃度的增加而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；B3組的SOD值達到峰值（111.24 U／mg prot），為B0組的2.9倍；C組與A和B組不同，其峰值（93.57 U／mg prot）出現(xiàn)在C4組，是C0的2.5倍。

圖4 不同Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋質(zhì)量濃度下SOD的含量變化Fig.4 Changes of SOD concentration according to different Cu2＋，Pb2＋and Cd2＋concentrations

2.6 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）活性的影響

Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋對藻體GST活性的影響隨著處理濃度的增加呈現(xiàn)出先升后降的趨勢。從圖5可以發(fā)現(xiàn)，所有的濃度處理組的GST值均高于空白對照組（A0、B0和C0），表明大于0.05 mg／L的3種重金屬離子對藻體均具有脅迫作用。

圖5 不同Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋質(zhì)量濃度下GST的含量變化Fig.5 Changes of GST concentration according to Cu2＋，Pb2＋and Cd2＋concentrations

實驗第6天，A0組GST為15.11U／mg prot，當(dāng)Cu2＋的濃度≤2.50mg／L時，GST與培養(yǎng)液中Cu2＋的濃度呈正相關(guān)，峰值（104.56 U／mg prot）出現(xiàn)在A3組，是A0組的6.9倍；濃度＞2.50 mg／L時，GST值雖有所下降，但仍高于較低濃度組。實驗第6天，GST隨著Pb2＋濃度的增加而呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，B3組的 GST達到峰值（100.76 U／mg prot），為 B0組的 9倍。實驗第6天，C0組的GST為10.98U／mg prot，當(dāng)Cd2＋的濃度≤2.50 mg／L時，GST與Cd2＋的濃度呈正相關(guān)性，C3組的 GST達到所有實驗組的峰值（158.33 U／mg prot），為C0組的14倍。

3 討論

3.1 對藻體生長的影響

棒葉蕨藻變種是一種適應(yīng)能力非常強的藻類，其生長速度較快，具有吸收養(yǎng)殖廢水中氨氮和硝酸鹽氮的能力［7］。研究表明，重金屬能夠直接或間接作用于生物體DNA，會引起海洋生物的遺傳物質(zhì)發(fā)生突變，引起生長緩慢、異常發(fā)展，降低胚胎、幼體及成體的存活率，通過敏感種的滅絕，導(dǎo)致生態(tài)退化，對生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成直接和間接的威脅［11－13］。本實驗結(jié)果顯示，Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋的脅迫會影響藻體的正常生長。在培養(yǎng)第6天，藻體均出現(xiàn)不同程度的白化和脫落現(xiàn)象，SGR出現(xiàn)負增長，Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋濃度越大對藻體生長的抑制越大，且Cu2＋的毒性大于Pb2＋和Cd2＋，表明重金屬對藻體生長的抑制能力大小依次為Cu2＋＞Pb2＋＞Cd2＋。

3.2 對藻體生化特征的影響

植物在受到重金屬污染時，細胞膜的通透性會改變，對葉綠體、線粒體、細胞核等亞顯微結(jié)構(gòu)有一定程度的破壞［14］。大型海藻是地球重要的生產(chǎn)者之一，光合色素和捕光色素蛋白種類繁多，其中大多數(shù)藻類光能傳遞的順序為類胡蘿卜素→Chl－b→Chl－a。Chl－a的含量能代表海藻的生產(chǎn)力。重金屬的污染會破壞葉綠體膜系統(tǒng)，過量的重金屬甚至?xí)茐娜~綠體的結(jié)構(gòu)，重金屬的存在一定程度上阻礙了植物對其他營養(yǎng)元素的吸收，阻斷了營養(yǎng)元素的運輸，影響了葉綠素的正常合成［14］。本實驗中，隨著Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋濃度的增長，Chl－a含量呈下降趨勢，A組下降尤為明顯。

可溶性蛋白是植物的滲透調(diào)節(jié)劑之一，是植物適應(yīng)環(huán)境、增強抗逆性的基礎(chǔ)［15］。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的Pb2＋對細基江蘺可溶性蛋白的影響不顯著，但高濃度（大于5.00 mg／L）的Pb2＋存在顯著的影響［16］。本實驗中，隨著Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋濃度的增長，可溶性蛋白含量越來越低，說明濃度越高，藻體對環(huán)境的脅迫響應(yīng)越明顯，其中A組的可溶性蛋白含量下降比B、C組明顯。

實驗結(jié)果表明，藻體對重金屬 Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋毒害的生理響應(yīng)機理是隨著重金屬離子濃度的增加，Chl－a和可溶性蛋白含量逐漸下降，這可能是由于重金屬離子影響了藻體葉綠素的合成，或者直接破壞了葉綠體的結(jié)構(gòu)，加劇影響藻體的光合作用。隨著重金屬離子濃度和處理時間的增加，重金屬離子與－SH基結(jié)合導(dǎo)致蛋白變形，也可能是重金屬取代了酶蛋白的活性中心，影響了酶的活性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成受阻。因此，可溶性蛋白隨著實驗組濃度的增加而迅速下降，抗氧化系統(tǒng)的平衡隨之被打破，相應(yīng)的抗氧化酶含量也出現(xiàn)變化。

3.3 對藻體抗氧化系統(tǒng)的影響

超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）是植物抗氧化系統(tǒng)的兩種關(guān)鍵酶。藻體內(nèi)SOD和GST含量的增加表明了藻體對重金屬Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋的脅迫做出了相應(yīng)的生理響應(yīng)，增強了藻體對逆境的耐受力。

SOD是一種酸性蛋白，是清除活性氧反應(yīng)過程中第一個發(fā)揮作用的抗氧化酶，它能催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成O2和H2O，避免由O－2生成破壞力更強大的羥自由基［17］。本實驗結(jié)果顯示，3種重金屬離子對SOD影響的變化趨勢相似，均為先升后降。A、B組以2.50 mg／L為界限，濃度≤2.50 mg／L時SOD呈現(xiàn)正相關(guān)，濃度＞2.50 mg／L時為負相關(guān)（C組SOD影響峰值則出現(xiàn)在C4組）。這是因為Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋能激發(fā)棒葉蕨藻變種自身的抗逆境體系，誘導(dǎo)SOD活性增加，但這種應(yīng)激的調(diào)節(jié)能力是相對有限的，當(dāng)脅迫強度增強至某一閾值時，SOD活力就出現(xiàn)了下降。實驗還發(fā)現(xiàn)，SOD對 Cu2＋的響應(yīng)比 Pb2＋和Cd2＋要靈敏，A3組中Cu2＋的SOD含量分別為B3、C3組的1.75倍和2.5倍，出現(xiàn)這種情況可能與藻體中金屬結(jié)合蛋白 Cu／Zn－SOD有一定的關(guān)系［18］。

GST是動植物重要的解毒酶，其分布廣泛且功能多樣，主要參與外源性有毒物質(zhì)的解毒過程［19］。實驗中，GST的變化與A、B和C組SOD變化相似，以2.50 mg／L為界，濃度≤2.50 mg／L時GST呈正相關(guān)，濃度＞2.50 mg／L的GST呈負相關(guān)。這說明在濃度較低時，藻體在較低濃度的Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋外源有毒物質(zhì)的脅迫下，能增強體內(nèi)的GST活性來緩解有毒物質(zhì)的毒害作用。但隨著有毒物質(zhì)濃度的增大，GST的活性也隨之降低，說明GST對重金屬Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋的耐受力也是相對有限的。GST可以調(diào)控谷胱甘肽（GSH）或親電基團中的巰基、咪唑基和Cd2＋結(jié)合并轉(zhuǎn)移，使得細胞質(zhì)中的Cd2＋保持低濃度［20］。實驗中，C3組GST含量約為B3和A3組的1.56倍，可能是GST參與了細胞對重金屬Cd2＋的轉(zhuǎn)移過程，使得藻體對Cd2＋有一定的耐受力，這可能也是Cd2＋實驗組SOD的峰值出現(xiàn)在C4組的原因之一。

4 結(jié)論

Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋三種重金屬離子的脅迫會影響藻體的正常生長，SGR均出現(xiàn)負增長，可溶性蛋白和Chl－a含量隨處理濃度的增大而呈下降趨勢，其中Cu2＋的影響尤為明顯。重金屬對藻體生長抑制能力大小為Cu2＋＞Pb2＋＞Cd2＋。三種重金屬離子對SOD和GST影響的變化趨勢相似，均表現(xiàn)為先升后降，除了Cd2＋對SOD影響峰值出現(xiàn)在5.00 mg／L處理濃度之外，其他處理組的峰值均出現(xiàn)在濃度為2.50 mg／L時。其中，Cu2＋的處理濃度為2.50 mg／L時，SOD值達到峰值（195.54 U／mg prot）；Cd2＋的處理濃度為2.50 mg／L時，GST達到峰值（158.33 U／mg prot）。本研究結(jié)果可為棒葉蕨藻變種的重金屬脅迫機理研究提供參考。 □

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The physical responses of Caulerpa sertularoides f.Longipes to heavy metal（Cu2＋、Pb2＋、Cd2＋）stress

WANG Rongxia1，HUANG Min1，2，CHEN Fuxiao1，3，TAN Wei1，3
（1 Academy of Marine and Fishery of Hainan Province，Haikou 570203，China；2 Hainan Provincial Key Laboratory for Tropical Seawater Aquaculture Technology，Hainan Provincial Research Center for tropical seawater aquaculture Engineering technology，Haikou 570203，China；3South China Sea Bio－resource Exploitation and Utilization Collaborative Innovation Center，Guangzhou 510275，China）

In order to study the physiological responses of the algaeCaulerpa sertularoides f.Longipesto heavy metal（Cu2＋，Pb2＋，Cd2＋）stress，constant－temperature illuminating cultivation method has been adopted to explore the influence of the stress from Cu2＋，Pb2＋and Cd2＋on the specific growth rate（SGR），content of soluble protein，chlorophyll－a（Chl－a），glutathione－S－transferase（GST）and superoxide dismutase（SOD）of the algae.The results show that stress of the three kinds of heavy metal ions affects the normal growth of the algae；SGR showed negative growth；soluble protein and Chl－a contents decreased when the content of heavy metal ions increased；the influence of Cu2＋was most obvious.The inhibition ability of heavy metals on the growth of algae was as follows：Cu2＋＞Pb2＋＞Cd2＋.Both the SOD and GST contents，under the influence of the three heavy metal ions，increased first and then declined；the peak effect on the SOD concentration appeared when the concentration of Cd2＋was 5 mg／L，but in other treatment groups the peak effect appeared at the concentration of 2.50 mg／L.This study will provide a scientific basis for the study on the mechanism of heavy metal stress toCaulerpa sertularoides f.Longipes.

Caulerpa sertularoides f.Longipes；Heavy metal；stress；physiological responses

10.3969／j.issn.1007?9580.2017.02.005

S955.7

A

1007－9580（2017）02－025－06

2017－01－15

海南省重點研發(fā)計劃項目（ZDYF2017027）；海南省自然科學(xué)基金項目（20164167）

王榮霞（1987—），女，工程師，碩士，研究方向：大型海藻養(yǎng)殖與漁業(yè)生態(tài)環(huán)境。E－mail：103490682＠qq.com

：譚圍（1982—），男，高級工程師，碩士，研究方向：水產(chǎn)經(jīng)濟動物繁殖生物學(xué)。E－mail：tanwei2599＠163.com