駱琦，李娜，李楠，趙芳，劉常金

（天津科技大學(xué)，天津300457）

雞湯中一株耐熱菌的分離與鑒定

駱琦，李娜，李楠，趙芳，劉常金*

（天津科技大學(xué)，天津300457）

實(shí)驗(yàn)室自制肉制品（雞肉湯）中分離得到一株耐熱菌，進(jìn)行菌落形態(tài)、生理生化特征鑒定，并采用Biolog快速鑒定結(jié)合16S r DNA序列分析兩種方式鑒定，16S r DNA序列分析結(jié)果表明此菌株屬于芽孢桿菌屬，Biolog快速鑒定結(jié)果顯示此菌株屬于芽孢桿菌屬中的枯草芽孢桿菌。因此導(dǎo)致雞湯高溫加熱后仍腐敗變質(zhì)的菌株為枯草芽孢桿菌。

芽孢桿菌；16S r DNA鑒定；Biolog

食品的腐敗變質(zhì)是影響食品安全問(wèn)題的重要因素，而微生物的繁殖又是食品腐敗變質(zhì)的主要原因。尤其是魚(yú)、肉、乳等高蛋白食品，在腐敗微生物及微生物所分泌酶的作用下，復(fù)雜的高分子物質(zhì)逐漸分解為低分子物質(zhì)，改變?cè)瓉?lái)的色澤及形態(tài)，并產(chǎn)生異常氣味，同時(shí)產(chǎn)生有毒物質(zhì)，進(jìn)而損害人體健康。

我國(guó)有“寧可食無(wú)肉，不可飯無(wú)湯”的說(shuō)法。雞湯是消費(fèi)者青睞的滋補(bǔ)佳品，其中的短肽、氨基酸、膠質(zhì)物質(zhì)、維生素等營(yíng)養(yǎng)成分容易被人體消化吸收[1]。隨著生活節(jié)奏的加快，商品化雞湯有著廣闊的發(fā)展空間。目前關(guān)于雞湯商品化生產(chǎn)及其品質(zhì)特征的研究還不多，雞湯產(chǎn)業(yè)鏈的保藏技術(shù)不夠完善。本試驗(yàn)從雞湯中腐敗微生物入手，將分離得到的一株耐熱菌株進(jìn)行鑒定，以便進(jìn)行殺菌手段的研究，對(duì)雞湯的商品化有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞湯：食品學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品物流保鮮與加工實(shí)驗(yàn)室自制，105℃高溫加熱20 min，然后80℃保溫30 min[2]。

1.2 主要試劑

Biolog培養(yǎng)基、96孔ECO板：美國(guó)Biolog公司；革蘭氏染色液、孔雀綠染液、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：天津化學(xué)試劑一廠；測(cè)序試劑：Miseq PE250：美國(guó)Illumina公司；DNA提?。篞IAamp Fast stool DNA kit：德國(guó)QIAGEN公司；捕獲磁珠 ：AmpureBeads：美國(guó)Beckman公司；Qubit定量：Quant-iTTMPicoGreendsDNA Assay Kit：美國(guó)Life公司；純水及其它生化試劑。

1.3 設(shè)備與材料

電熱恒溫培養(yǎng)箱：常州普天儀器制造有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；H-3微型旋渦混合儀：美國(guó)SI公司；Miseq高通量測(cè)序儀：美國(guó)Illumina公司；冷凍離心機(jī)：美國(guó)Scan speed公司；MD酶標(biāo)儀：美國(guó)MD公司；電泳儀：中國(guó)天能公司；凝膠成像系統(tǒng)：中國(guó)天能公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 耐熱菌的分離

取雞湯在36℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，取腐敗肉湯5 mL于85℃水浴休克15 min后做梯度稀釋，將適合濃度涂布在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48 h。挑取生長(zhǎng)快單菌落劃線分離，挑取單菌落。分離純化后的菌株制成107cfu/mL的菌懸液，90℃熱休克處理30min后涂布在牛肉膏蛋白胨平板上，37℃培養(yǎng)24h[3]。對(duì)經(jīng)過(guò)耐熱篩選后的菌株進(jìn)行菌落形態(tài)，生理生化的初步鑒定，于－20℃保存。

1.4.2 形態(tài)及生理鑒定

1.4.2.1 生理生化測(cè)定

用革蘭氏染色法、芽孢染色法、掃描電鏡等方法觀察菌體形態(tài)特征。

接觸酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、明膠液化、VP實(shí)驗(yàn)、淀粉水解、吲哚試驗(yàn)，根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行鑒定[4]。

1.4.2.2 Biolog生理鑒定

1）BUG培養(yǎng)基的配制：稱取5.7 gBUG培養(yǎng)基，定容至90 mL，煮沸溶解，冷卻至25℃后調(diào)整pH值至7.3±0.1，121℃下滅菌20 min，冷卻至45℃后加入10 mL已滅菌的麥芽糖溶液，濃度為2.5%，混勻，冷卻后倒平板。

2）巰基乙酸鈉8滴+3 mL蒸餾水，用棉簽涂在平板上[5]。

3）晾干后，十字交叉的方法輕輕涂菌，30℃培養(yǎng)10 h。

在BUG+M+T培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后接種到Biolog專用接種液中制備成均一的菌懸液，轉(zhuǎn)接到微孔板上進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)4 h～6 h和16 h～24 h時(shí)在讀數(shù)儀上讀取菌株的代謝指紋特征，在Biolog數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性比對(duì)，查找最接近的結(jié)果[6－7]。

1.4.3 16S r DNA鑒定

1.4.3.1 DNA抽提

參照DNA提取試劑盒說(shuō)明方法進(jìn)行DNA提取。

1.4.3.2 DNA質(zhì)檢

1）取1 μLDNA提取物，MD酶標(biāo)儀定量；

2）根據(jù)定量結(jié)果，取50 ng 1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。

1.4.3.3 16s文庫(kù)構(gòu)建流程

1）PCR第一輪擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增程序如下：94℃，3 min；20循環(huán)（94℃，10 s；55℃，15 s；72℃，30 s），72℃ 7min，10℃保溫。

2）PCR產(chǎn)物純化

樣品與磁珠1∶1（各22 μL）充分混勻，室溫放置10 min；然后靜置于磁力架上，加200 μL 80%乙醇，30 s后去上清，重復(fù)洗滌一次；將樣品置于室溫晾干，加22 μL的ddH2O充分懸浮，室溫放置5 min后置于磁力架上至完全分離，取20 μL上清進(jìn)行Qubit定量；進(jìn)一步將純化產(chǎn)物進(jìn)行第二輪PCR及純化[8]。

1.4.3.4 生物信息學(xué)分析

根據(jù)MiSeq測(cè)序數(shù)據(jù)的低質(zhì)量分?jǐn)?shù)集中于末端的分布特點(diǎn)，首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，利用Trimmomatic軟件進(jìn)行去雜，獲得最終用于分析的優(yōu)化序列，利用uparse軟件以16S rRNA基因序列進(jìn)行操作分類單元（OTU）聚類，總結(jié)相似度大于等于97%的OTU中序列幾乎歸類于同一個(gè)屬[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果

通過(guò)分離、篩選及純化，得到了1株經(jīng)85℃、30min水浴后長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株LQ－1。LQ－1革蘭氏染色呈陽(yáng)性；菌體桿狀或橢球狀；在牛肉膏培養(yǎng)基上菌落白色或微黃色，邊緣放射狀，成熟菌落有火山狀褶皺，直徑約4 mm～6 mm，生長(zhǎng)較快。表1為生理生化鑒定結(jié)果。LQ－1的形態(tài)見(jiàn)圖1。

表1 LQ-1生理生化鑒定Table 1 Biochemical and physiological characteristics of LQ-1

圖1 LQ-1的形態(tài)Fig.1 The morphology of LQ-1

結(jié)合該菌的生理生化特征及菌落形態(tài)，根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，可初步鑒定出LQ－1屬于芽孢桿菌屬中的枯草芽孢桿菌。

2.2 Biolog鑒定

根據(jù)菌株的生理生化特性，將菌分別接種到BUG+M+T培養(yǎng)基上，16 h后用棉簽將菌落沾起，分散到GN/GP－IF專用接種液中，制備成均一的菌懸液，調(diào)整濁度到（52±2）%，接種到GN鑒定板上，接種量150 L，30℃培養(yǎng)。對(duì)菌株在鑒定板上培養(yǎng)4 h～6 h和16 h～24 h的結(jié)果讀取數(shù)據(jù)，鑒定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Biolog鑒定結(jié)果Table 2 The result of Biolog identification

根據(jù)LQ－1的代謝指數(shù)，經(jīng)過(guò)Biolog鑒定分析，在4 h～6 h，該菌與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）的SIM比較高，分別為0.57和0.29，16 h～24 h讀數(shù)顯示，與枯草芽孢桿菌相似性為0.61。圖2給出了Biolog96孔板鑒定16 h～24 h代謝指紋特征圖。

圖2 菌株的指紋代謝特征圖Fig.2 The metabolic characteristics of cultures

2.3 16S r DNA測(cè)序分析

高通量測(cè)序結(jié)果顯示，從樣本中獲得197 92條高質(zhì)量16S r DNA序列，平均長(zhǎng)度465.6 bp，連接后的序列長(zhǎng)度分布圖見(jiàn)圖3。

圖3 接后的序列長(zhǎng)度分布圖Fig.3 Lenth distribution

表3 LQ-1 16S r DNA鑒定結(jié)果Table 3 The result of 16S r DNA analysis

經(jīng)同源性分析發(fā)現(xiàn)，LQ－1屬于芽孢桿菌屬，同源性達(dá)97%以上。結(jié)合以上生理生化鑒定結(jié)果，推測(cè)該菌為枯草芽孢桿菌。

3 結(jié)論與討論

本研究對(duì)從雞湯分離出的耐熱產(chǎn)芽孢菌通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特征分析、16S r DNA序列分析推測(cè)其為枯草芽孢桿菌。Biolog系統(tǒng)規(guī)定：細(xì)菌培養(yǎng)4 h～6 h其SIM≥0.75，培養(yǎng)16 h～24 h SIM≥0.5，系統(tǒng)自動(dòng)給出鑒定結(jié)果為種名，當(dāng)SIM＜0.75（4 h～6 h）或0.5（16 h～24 h），自動(dòng)給出的鑒定結(jié)果為屬名。Biolog快速鑒定與分子生物學(xué)的鑒定結(jié)果一致且鑒定時(shí)間只需要2 d。

國(guó)內(nèi)對(duì)鮮肉、高溫肉制品微生物的研究較多，主要是好氧性微生物以及乳酸菌、芽孢桿菌和酵母等[10]；國(guó)外對(duì)低溫肉制品研究較多，主要有假單胞菌、腸桿菌、乳酸菌[6]、致病菌株單增李斯特氏菌[11]、梭菌屬[12]、肉桿菌屬[13]、沙門(mén)氏菌屬[14]等，其中芽孢桿菌、梭菌屬、肉桿菌屬中的菌種能產(chǎn)生芽孢。由于芽孢含水量低（40%）、含有耐熱小分子酶類、富含大量特殊的吡啶二羧酸鈣和待用二硫鍵的蛋白質(zhì)以及具有多層次厚而致密的芽孢壁等原因，較營(yíng)養(yǎng)體呈現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，故一般加熱法不能將其殺死，外界刺激比如加熱可能促使其萌發(fā)成營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞，導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)。產(chǎn)芽孢細(xì)菌致死的溫度通常在100℃～130℃之間，此溫度可顯著破壞雞湯中的營(yíng)養(yǎng)成分和呈味物質(zhì)。因此，低溫肉制品逐漸成為我國(guó)肉制品發(fā)展的趨勢(shì)，但是，由于低溫肉制品加工的中心溫度在68℃～72℃之間，一些芽孢桿菌會(huì)存活下來(lái)，產(chǎn)品易產(chǎn)生漲袋、出油等變質(zhì)現(xiàn)象，需進(jìn)一步研究。

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Isolation and Identification of One Heat-resisting Strains in Chicken Soup

LUO Qi，LI Na，LI Nan，ZHAO Fang，LIU Chang-jin*
（Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

One heat-resisting strains，isolated by our lab-made meat product（chicken soup），was identified by colony morphology，physiological and biochemical characteristics，16S r DNA sequence analysis and Biolog Microstation System.The results from 16S r DNA sequence analysis shown that strains LQ-1 was belong to Bacillus genus.It indicated that it was belong to Bacillus subtilis spores with Biolog Microstation System. Therefore it is the Bacillus subtilis spores that resulted in the putrescence after chicken soup exposed to superheat for more than 10 minutes.

Bacillus；16S r DNA；Biolog

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.039

2016－08－18

駱琦（1991—），女（漢），在讀碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。

*通信作者：劉常金（1969—），男，碩士生導(dǎo)師，博士，研究方向：農(nóng)副產(chǎn)品生物轉(zhuǎn)化及資源開(kāi)發(fā)。