任艷玲 沈志強(qiáng) 馬澤彬 李金林 肖 娜 董文艷 李忠順王建軍 楊占崗 劉吉山*

（①山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 256600 ②山東綠都生物科技有限公司 山東 濱州 ③山東無棣縣車鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站 ④山東省濱州市沾化區(qū)畜牧局 ⑤山東無棣華興渤海黑牛種業(yè)股份有限公司 山東 濱州）

試驗(yàn)研究

中渤海黑牛mtDNA cytb基因遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析

任艷玲①沈志強(qiáng)①馬澤彬④李金林①肖 娜②董文艷②李忠順③王建軍①楊占崗⑤劉吉山①*

（①山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 256600 ②山東綠都生物科技有限公司 山東 濱州 ③山東無棣縣車鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站 ④山東省濱州市沾化區(qū)畜牧局 ⑤山東無棣華興渤海黑牛種業(yè)股份有限公司 山東 濱州）

為了了解無棣華興渤海黑牛原種場渤海黑牛種公牛的遺傳多樣性水平，確定個(gè)體之間的親緣關(guān)系，對(duì)無棣華興渤海黑牛原種場15頭渤海黑牛種公牛的細(xì)胞色素b基因(Cytb)全序列的測序和分析，發(fā)現(xiàn)Cytb基因全長1140bp，共檢測到了10種單倍型、34個(gè)核苷酸的多態(tài)位點(diǎn)，包括15個(gè)單變異位點(diǎn)和19個(gè)簡約信息位點(diǎn)，無插入和缺失。單倍型多樣度(Hd)為0.914，核苷酸多樣度(Pi)為0.01014，表明渤海黑牛具有豐富的遺傳多樣性。NJ系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建的結(jié)果表明15頭渤海黑牛聚為兩大類。

渤海黑牛 線粒體DNA cytb基因 遺傳多樣性 親緣關(guān)系

渤海黑牛(Bohai Black Cattle)原稱“無棣黑?！薄⒂址Q“抓地虎黑?！?，是我國唯一的黑毛黃牛品種，是世界上三大黑毛牛種之一，也是我國八大優(yōu)良地方黃牛品種之一。以被毛、口輪、蹄冠、角、鼻鏡全黑，低身廣軀而聞名，它具有體型結(jié)構(gòu)良好，育肥性能好、屠宰率高等特點(diǎn)。優(yōu)良的肉用性能可以和國外著名肉牛品種相媲美，尤其肉色鮮艷，脂肪雪白并分布均勻，大理石花紋明顯，烹調(diào)后香味濃郁為其它品種所不及，活牛及牛肉行銷香港，素有“黑金剛”的美譽(yù)。

渤海黑牛主要產(chǎn)地為山東省濱州市渤海一帶的無棣、沾化、陽信、惠民等縣。在山東省東營市、濰坊市、淄博市、德州市以及河北省滄州市也有分布，但數(shù)量較少。目前，尤以無棣縣存欄量為最多，質(zhì)量最好。20世紀(jì)的黃牛改良和肉牛改良，給渤海黑牛這一品種帶來很大的沖擊，中心產(chǎn)區(qū)存養(yǎng)量急劇下降，分布范圍日漸縮小。特別是進(jìn)入21世紀(jì)以來，隨著農(nóng)業(yè)機(jī)械化水平的不斷提高，渤海黑牛在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的優(yōu)勢(shì)日趨淡化，再加上養(yǎng)殖成本的增加，農(nóng)戶不再從事渤海黑牛的養(yǎng)殖繁育工作，致使渤海黑牛瀕臨絕種。為保護(hù)渤海黑牛這一畜禽遺傳資源，2002年濱州市畜牧獸醫(yī)局組建了山東省渤海黑牛原種場，2008年被國家農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)為“國家級(jí)渤海黑牛保種場”。2011年10月，遷址到無棣縣車鎮(zhèn)山東無棣華興渤海黑牛種業(yè)股份有限公司，新建牛場位于縣城以北20公里處，靠近大義路，占地203畝?，F(xiàn)存欄渤海黑牛600頭，其中基礎(chǔ)母牛570頭，種公牛30頭。無棣縣以山東省渤海黑牛原種場為依托，充分發(fā)揮渤海黑牛原產(chǎn)地優(yōu)勢(shì)，在碣石山、柳堡和車王等三個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)建立了渤海黑牛保護(hù)區(qū)。2008年被認(rèn)定為“國家級(jí)畜禽遺傳資源保

護(hù)區(qū)”。目前保護(hù)區(qū)內(nèi)渤海黑牛存欄量3000余頭。配種用凍精全部來自于山東省渤海黑牛原種場，保證了渤海黑牛的純種繁育。線粒體Cytb基因是線粒體中重要的蛋白編碼基因，包含從種內(nèi)到種間乃至到科間的進(jìn)化遺傳信息，在系統(tǒng)進(jìn)化和分類研究中有著較強(qiáng)的適用性，被廣泛應(yīng)用于家畜起源進(jìn)化、親緣關(guān)系和群體遺傳結(jié)構(gòu)研究[1,2]。本研究旨在分析華興渤海黑牛原種場內(nèi)的15頭種公牛的線粒體DNA的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，為渤海黑牛保種育種資源保護(hù)提供理論技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物、基因組DNA的提取 15頭渤海黑牛血樣，采自無棣華興渤海黑牛原種場。頸靜脈采血，ACD抗凝，全血基因組試劑盒(Takara，Code D9081)提取基因組DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)Genbank中(EU177868.1)發(fā)布的牛Cytb基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物序列為：P1：5’TGAAAAACCATCGTTGTCAT 3’，P2：5’CAAAGACCT GTCTTCATTTTAGT 3’。

1.3 渤海黑牛Cytb基因擴(kuò)增及測序 PCR反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5μl，dNTP 1.5μl，上下游引物各1μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，模板DNA 1μl，加H2O至總體積25μl；PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，95 30s℃ ，59 30s℃ ，72 30s℃ ，循環(huán)29次，70℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其片段大小與濃度，試劑盒純化回收，由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用ClustalX(1.83)軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，通過DnaSP5.0軟件分析渤海黑牛15條Cytb序列的變異位點(diǎn)及單倍型。用MEGA5軟件構(gòu)建渤海黑牛種公牛的親緣關(guān)系聚類圖。

2 結(jié)果

2.1 渤海黑牛線粒體DNA cytb基因序列 通過克隆測序，獲得15條渤海黑牛線粒體Cytb基因全序列，全長均為1140bp，共檢測到34個(gè)突變位點(diǎn)，約占核苷酸總數(shù)的2.98%，其中包括15個(gè)單變異位點(diǎn)和19個(gè)簡約信息位點(diǎn)，無插入和缺失。15條序列共檢測到10種單倍型，單倍型多樣度Hd為0.914，核苷酸多樣度Pi值為0.01014。

表1 Cytb基因各單倍型變異位點(diǎn)

表2 Cytb基因單倍型的多樣性參數(shù)

2.2 mtDNA Cytb基因核酸組成 利用MEGA5.0基因序列平均核苷酸組成，結(jié)果見表3。渤海黑牛Cytb基因全序列平均堿基含量為T25.3%，C30.0%，A31.3%，G13.4%。其中G的含量低于其它堿基含量。A+T含量(56.6)高于G+C含量(43.4%)，這與動(dòng)物mtDNA富含AT的結(jié)論一致。

表3 Cytb基因序列平均核苷酸組成

2.3 渤海黑牛種公牛親緣關(guān)系聚類圖 用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA5選用Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算15個(gè)種公牛之間的平均遺傳距離，見表4。15個(gè)個(gè)體間遺傳距離為0～0.021，平均值為0.012。引用野牦牛Cytb序列(AY955226)做外群，構(gòu)建了渤海黑牛15個(gè)個(gè)體、NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(附圖)，由圖可知，15頭種公牛聚為2大類。

表4 渤海黑牛15 個(gè)個(gè)體之間的Kimura 雙參數(shù)遺傳距離

附圖 用NJ 法構(gòu)建的渤海黑牛15 個(gè)個(gè)體間的聚類圖

3 討論

3.1 渤海黑牛的遺傳多樣性研究 從分子水平上分析地方品種的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)是實(shí)施保護(hù)和利用的基礎(chǔ)，近年來學(xué)者對(duì)渤海黑牛開展了一些研究。王建英等[3]在渤海黑牛和日本和D-loop區(qū)遺傳變異研究中發(fā)現(xiàn)，渤海黑牛mtDNA D-loop區(qū)具有豐富的遺傳多樣性，二者的親緣關(guān)系很近；渤海黑牛含有普通牛和瘤牛的血統(tǒng)、受到過瘤牛血緣漸滲的影響。周芬娜等[4]和王敏強(qiáng)等[5]分析了渤海黑牛和魯西黃牛的遺傳多樣性，均表明渤海黑牛有豐富的遺傳變異，但是群體遺傳多樣性低于魯西黃牛。但是對(duì)渤海黑牛Cytb基因遺傳多樣性尚未見報(bào)道，本研究通過對(duì)渤海黑牛mtDNA cytb基因分析，15個(gè)渤海黑牛個(gè)體單倍型多樣度Hd為0.914，核苷酸多樣度Pi值為0.01014，亦具有豐富的遺傳多樣性。

3.2 渤海黑牛種公牛親緣關(guān)系與保護(hù)建議 15個(gè)渤海黑牛個(gè)體間的遺傳距離為0～0.021，平均遺傳距離為0.012，說明個(gè)體之間親緣關(guān)系較近。因此應(yīng)該多渠道、多投入，加強(qiáng)品種保護(hù)和利用。（1）渤海黑牛的品種資源保護(hù)和開發(fā)利用是一項(xiàng)高投入、長時(shí)間的系統(tǒng)工程，一方面需要政府加大投入資金，另一方面需要積極吸引社會(huì)資金，鼓勵(lì)企業(yè)和個(gè)人及有關(guān)社會(huì)團(tuán)體參與。（2）擴(kuò)大保種群的數(shù)量，飼養(yǎng)一定數(shù)量的公牛和采取合理的公母比例，以維持渤海黑牛群體內(nèi)的遺傳多樣性。（3）適當(dāng)?shù)膶?dǎo)入外血，通過導(dǎo)入優(yōu)勢(shì)基因，在保護(hù)遺傳多樣性的同時(shí)提高生產(chǎn)性能。

[1] 蔡欣, 陳宏, 雷初朝等. 中國3個(gè)牛種Cytb基因多態(tài)性及其系統(tǒng)發(fā)育研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2007, 35(2): 43-46.

[2] IRWIN D M，KOCHER T D，WILSON A C．Evolution of the eytochrome b gene of mammals[J]. Journal of Molecular Evolution, 1991, 32(2): 128-l44.

[3] 王建英, 張秀美, 蘭鄒然等. 渤海黑牛和日本和牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳變異研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2009,14(3): 75-82.

[4] 周芬娜, 畢偉偉, 王慧等. 魯西黃牛和渤海黑牛群體遺傳多樣性的RAPD分析[J]. 山東畜牧獸醫(yī), 2010, 31: 1-2.

[5] 王敏強(qiáng), 李麗萍, 陳禮學(xué)等. 用20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記研究魯西黃牛和渤海黑牛的遺傳多樣性[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 29(6): 75-81.

S823.2

A

1007-1733(2017)05-0001-02

2017–01–11）

*通訊作者