鄭翔楊何寶胡美榮劉春卯吳芳彤曹倩榮

（1. 河北省微生物研究所酶工程室，保定 071051；2. 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所微生物生理與代謝工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101）

一種新型蛋白酶的酶學(xué)特性及脫毛應(yīng)用

鄭翔1楊何寶1胡美榮2劉春卯1吳芳彤1曹倩榮1

（1. 河北省微生物研究所酶工程室，保定 071051；2. 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所微生物生理與代謝工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101）

蛋白酶可作為清潔化產(chǎn)品應(yīng)用在制革脫毛工藝，旨在明確枯草工程菌株WB800N/pHT43-npr發(fā)酵生產(chǎn)重組中性蛋白酶（JW-3蛋白酶）的脫毛效果及脫毛工藝條件，為清潔化脫毛制革工藝提供技術(shù)參考。研究了JW-3蛋白酶的熱穩(wěn)定性、pH耐受性，金屬離子及化學(xué)試劑對(duì)酶活力的影響，酶解膠原蛋白的能力，同時(shí)對(duì)酶法與傳統(tǒng)灰堿法黃牛皮脫毛效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，JW-3蛋白酶的耐高溫能力差，40℃保存1 h酶活力便開始衰減；在pH6、pH7穩(wěn)定性良好；Ca2+、Mn2+對(duì)酶活力有激活作用；在表面活性劑Triton X-100、Tween20、Tween80中穩(wěn)定；JW-3蛋白酶不具有水解膠原蛋白的能力，與傳統(tǒng)灰堿法脫毛的皮粒面效果相當(dāng)，且可以回收完整的動(dòng)物毛發(fā)再利用。JW-3酶法可替代灰堿法脫毛實(shí)現(xiàn)清潔化脫毛制革工藝。

制革業(yè)；清潔化技術(shù)；蛋白酶；酶學(xué)性質(zhì)

傳統(tǒng)的制革工藝會(huì)產(chǎn)生大量污染，制革排放的特色四廢分別是：廢水、污泥、廢氣和固體廢棄物［1］。其中各類污染的排放以水場(chǎng)部分的傳統(tǒng)灰堿法脫毛環(huán)節(jié)為甚，灰堿毀毛脫毛法脫毛效果好，但被溶解的毛被、表皮與灰堿等污染物占制革廢水總污染物的40%。近年來研究的清潔脫毛工藝主要有酶法脫毛［2］、灰堿法基礎(chǔ)上的保毛脫毛、有機(jī)胺脫毛、過氧化氫氧化脫毛和其他脫毛方法［3］。

中性蛋白酶（Neutral protease）是在中性pH條件下作用于蛋白質(zhì)肽鍵的酶類，能將蛋白質(zhì)水解成氨基酸、多肽以及游離氨基酸，可廣泛用于動(dòng)植物蛋白水解，皮革脫毛、軟化，羊毛絲綢脫膠等［4，5］。蛋白酶法脫毛制革因脫毛條件溫和，對(duì)真皮中角蛋白水解少，且毛從表皮分離回收，是目前為止最有可能代替灰堿法實(shí)現(xiàn)清潔脫毛工業(yè)化的方法［6］。1398、2709蛋白酶制劑在20世紀(jì)初期曾作為脫毛酶應(yīng)用在制革工藝中［7］，但因其酶系中含有水解皮膠原的膠原蛋白酶，在大規(guī)模應(yīng)用中如工藝控制不嚴(yán)會(huì)造成松面、爛皮現(xiàn)象［8］；而純化去除膠原蛋白酶所增加的工藝成本超出了制革廠的負(fù)荷，進(jìn)而限制了蛋白酶制劑在皮革工業(yè)中的應(yīng)用。有研究表明［9-11］枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis S14、Bacillus subtilis P13）及沙福芽孢桿菌（Bacillus safensis LAU13）等菌株發(fā)酵生產(chǎn)的角蛋白酶對(duì)膠原蛋白水解能力相對(duì)較差，但在脫毛工藝中仍需要嚴(yán)格控制酶用量及脫毛時(shí)間，否則依舊會(huì)損傷成革質(zhì)量。因此，亟需研制一種理想的脫毛用酶產(chǎn)品。

針對(duì)以上蛋白酶制劑在脫毛工藝中應(yīng)用的局限性，本實(shí)驗(yàn)室前期將枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis AS1.398）的中性蛋白酶基因npr重組到宿主菌WB800N中，構(gòu)建一株脫毛用基因工程菌WB800N/ pHT43-npr，該菌株經(jīng)驗(yàn)證發(fā)酵產(chǎn)物中不含有膠原蛋白酶，并初步明確其發(fā)酵生產(chǎn)的JW-3蛋白酶脫毛效果優(yōu)于1398蛋白酶［12］，但JW-3蛋白酶能否達(dá)到灰堿法對(duì)皮塊的脫毛效果及其脫毛工藝條件等還未明確。對(duì)JW-3蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，明確該酶在脫毛環(huán)節(jié)的各項(xiàng)工藝指標(biāo)，同時(shí)與傳統(tǒng)灰堿法對(duì)黃牛皮的脫毛效果進(jìn)行比較評(píng)價(jià)，為清潔化脫毛制革工藝提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 枯草芽孢桿菌工程菌Bacillus subtilis（WB800N/pHT43-npr），由本研究室與中國(guó)科學(xué)院微生物研究所共同構(gòu)建，保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，CGMCC No.11625。工程菌WB800N/ pHT43-npr的發(fā)酵液經(jīng)固液分離獲得上清液后，用截流分子量為10 kD的超濾柱除去小分子雜質(zhì)后即為JW-3蛋白酶，酶活力單位為3 000 U/mL。

1.1.2 試劑 膠原蛋白酶II（Collagenase Type II）購(gòu)自Gibco公司；1398蛋白酶、I-膠原蛋白（Collagen Type I）來源于牛腱，購(gòu)自TSolarbio試劑公司；鹽腌黃牛皮購(gòu)自蠡縣留史毛皮市場(chǎng)；其它試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶的溫度穩(wěn)定性 用0.2 mol/L pH7.5磷酸鹽緩沖液稀釋JW-3蛋白酶液至終濃度為500 U/mL，按照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》標(biāo)準(zhǔn)，采用 Folin-酚法（下同）分別在20、30、40、50、60、70和80℃下孵育0.5、1、2、4和24 h后，檢測(cè)其殘余酶活，得到其他相對(duì)酶活，以未保溫的酶活性作為100%。

1.2.2 蛋白酶的pH耐受性 分別用pH5、6、7、8、9、10的緩沖液稀釋JW-3蛋白酶液至終濃度為500 U/mL，在相應(yīng)的pH緩沖液內(nèi)孵育0.5、1、2、4和24 h后，檢測(cè)其殘余酶活，得到其他相對(duì)酶活，以pH7.5緩沖液孵育處理的酶活性作為100%。

1.2.3 不同金屬離子對(duì)蛋白酶活力的影響 在酶活力為500 U/mL的JW-3蛋白酶液中分別加入終濃度為5 mmol/L的不同金屬離子（Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+和Fe2+），保持1、3、6和24 h后測(cè)定殘余酶活性，以無(wú)任何添加物下的酶活性作為100%［13］。

1.2.4 螯合劑、不可逆抑制劑、表面活性劑、還原劑、漂白劑對(duì)蛋白酶活力的影響 在酶活力為500 U/mL的JW-3蛋白酶液中分別加入終濃度為5 mmol/L的螯合劑EDTA（Ethylenediam- inetetraacetic acid）、不可逆抑制劑PMSF（Phenylmethylsulfonyl fluoride）和1%的還原劑β-Me（β-巰基乙醇），表面活性劑SDS（5 mmol/L）、Triton X-100（1%）、Tween20（1%）、Tween80（1%）、洗滌靈（1%）和30%的漂白劑H2O2（1%），保持1、3、6和24 h后測(cè)定殘余酶活性，以無(wú)任何添加物下的酶活性作為100%。

1.2.5 對(duì)不同底物的水解特性 在2%濃度的I-膠原蛋白溶液中分別加入終濃度為50 U/mL的JW-3蛋白酶、1398蛋白酶、膠原蛋白酶，在30℃條件下酶解過夜后加入0.4 mol/L的三氯乙酸終止反應(yīng)；離心、取上清在200-400 nm波長(zhǎng)區(qū)間內(nèi)測(cè)定酶解產(chǎn)物紫外掃描曲線，以底物I-膠原蛋白最后加入的樣品作為對(duì)照［14］。底物酪蛋白的酶解反應(yīng)過程同上。

1.2.6 與傳統(tǒng)灰堿法原皮脫毛效果對(duì)比 取冷凍保藏的鹽腌黃牛皮加入浸水劑恢復(fù)鮮皮狀態(tài)后用表面活性劑除脂，沿脊背線左右對(duì)稱取樣，將牛皮裁剪約為4 cm×4 cm的正方形小塊備用。

酶法脫毛：將酶活力為50 U/mL的JW-3蛋白酶在30℃、液比為1∶6、pH范圍6-7.5的條件下對(duì)上述皮塊進(jìn)行脫毛處理?；覊A法脫毛：取2%的硫化鈉和8%的石灰在25℃、液比為1∶2.5的條件下對(duì)上述皮塊進(jìn)行脫毛處理。待兩種方案脫毛結(jié)束后，對(duì)比脫毛后皮塊粒面的顯微形態(tài)及脫毛后牛毛的質(zhì)量，最后通過比較脫毛工藝中總氮（TNb）、總固形物（TS）、懸浮固體物（SS）、浴液pH、粒面感官等指標(biāo)對(duì)兩種方法脫毛效果進(jìn)行對(duì)比評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 蛋白酶的溫度穩(wěn)定性及pH耐受性

制革的脫毛環(huán)節(jié)采用的是有溫有浴脫毛法。灰堿法脫毛只需滿足浴液中化學(xué)試劑的濃度適宜即可，而酶法脫毛需要控制浴液的溫度及酸堿度才能保證酶分子有效的進(jìn)行催化作用。研究表明酶脫毛全程約3-6 h，為保證在脫毛全程有較高的殘余酶活力，本文對(duì)酶性質(zhì)的研究采取定時(shí)取樣測(cè)定至24 h結(jié)束，綜合時(shí)間因素分析各項(xiàng)條件對(duì)酶保存活性的影響。

前期實(shí)驗(yàn)表明JW-3蛋白酶在50℃時(shí)具有最佳的催化活性，但該酶的耐熱性能較差。圖1顯示，JW-3蛋白酶在30℃及以下溫度放置24 h后，酶活保存率在95%以上；但在40℃放置1 h以上時(shí)酶活迅速衰減；在70℃放置30 min后酶活性完全喪失。因酶法脫毛工藝受脫毛時(shí)間的限制，為保證此酶在全程發(fā)揮催化作用，應(yīng)將酶脫毛的體系溫度從傳統(tǒng)的38-40℃的范圍降低到30-32℃，同時(shí)能在一定程度上降低企業(yè)的能耗。

圖1 JW-3蛋白酶在不同溫度下的保存穩(wěn)定性

圖2 顯示，JW-3蛋白酶在pH 6和pH 7的緩沖液孵育下酶活有10%幅度的提升，其中在pH6時(shí)酶穩(wěn)定性表現(xiàn)最佳。在pH5、8和9的條件下保存24 h仍有40%以上殘余酶活，且后期衰減趨勢(shì)不明顯；但在pH10及以上緩沖液中保存30 min后，酶活力完全喪失。故在有溫有浴酶法脫毛工藝中，脫毛浴液的pH應(yīng)在中性條件下才能保證在脫毛過程中有較高的殘余酶活力。

圖2 JW-3脫毛酶在不同pH緩沖液中的保存穩(wěn)定性

2.2 金屬離子對(duì)蛋白酶活性的影響

金屬離子可作為酶的激活劑、可逆性抑制劑及不可逆性抑制劑，篩選對(duì)酶活性有促進(jìn)作用或是穩(wěn)定酶分子構(gòu)象的金屬離子具有重要意義。圖3顯示，隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活力因金屬離子的加入呈現(xiàn)曲線變化趨勢(shì)，其中升降趨勢(shì)均在3 h左右到達(dá)高峰，此時(shí)Ca2+、Mn2+能顯著增加酶活力分別為27%和9%，而Fe2+和Zn2+明顯抑制酶活性，Mg2+對(duì)酶活性影響不大。Ca2+和Mn2+可作為穩(wěn)定助劑添加到液體酶制劑中。

圖3 金屬離子對(duì)JW-3蛋白酶活性的影響

2.3 螯合劑、抑制劑、表面活性劑、還原劑、氧化劑對(duì)蛋白酶活性的影響

表面活性劑在制革工藝中可以用來乳化和分散脂肪，進(jìn)而促使酶分子滲透到皮層毛囊完成脫毛過程。圖4顯示，JW-3蛋白酶在不同試劑中保存后酶活差異明顯，其中在Triton X-100、Tween20、Tween80中保存24 h酶活力有小幅度的上升；SDS幾乎完全抑制酶活性；而在洗滌靈中保存3 h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。該酶在強(qiáng)氧化劑H2O2中保存6 h，剩余酶活力可達(dá)到90%以上；表明JW-3脫毛酶可以協(xié)同H2O2應(yīng)用在氧化脫毛工藝中完成脫毛過程；而還原劑β-巰基乙醇可抑制約30%的酶活性。EDTA為金屬蛋白酶抑制劑、PMSF是絲氨酸蛋白酶抑制劑，該酶在 EDTA 作用下酶活力僅剩5%，而PMSF可抑制約80%的酶活性；說明該酶的活性中心可能有金屬離子，且屬于絲氨酸蛋白酶家族。

圖4 化學(xué)試劑對(duì)JW-3蛋白酶活性的影響

2.4 不同底物的酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果

前期研究中明確工程菌株WB800N/pHT43-npr發(fā)酵產(chǎn)物中不含有膠原蛋白酶，但其發(fā)酵生產(chǎn)的酶液對(duì)皮膠原蛋白的水解能力未明確。選取適量同等活力的膠原蛋白酶Ⅱ、1398中性蛋白酶、JW-3蛋白酶，分別酶解底物Ⅰ-膠原蛋白和酪蛋白，酶解產(chǎn)物在200-400 nm波長(zhǎng)范圍的紫外掃描曲線結(jié)果如圖5所示。圖5-A表明，3種蛋白酶可不同程度酶解酪蛋白生成酪氨酸，在275 nm處有最大吸收峰，而在250 nm處酶解產(chǎn)物暫不明確。圖5-B表明，膠原蛋白酶和1398蛋白酶可酶解膠原蛋白，酶解產(chǎn)物在250 nm左右有較高的吸收峰，而JW-3蛋白酶在該波長(zhǎng)僅有微弱的吸收峰，表明該酶非特異性水解Ⅰ-膠原蛋白的能力較差。實(shí)驗(yàn)所用膠原蛋白來源于牛腱組織，與動(dòng)物皮的膠原蛋白成分接近，該酶不損傷皮膠原蛋白與1398蛋白酶脫毛相比具有顯著的優(yōu)勢(shì)。

圖5 不同底物酶解后的紫外掃描曲線

2.5 酶法脫毛與灰堿法脫毛效果比較

2.5.1 脫毛后黃牛毛的結(jié)構(gòu)比較 酶法脫毛的機(jī)理是蛋白酶水解毛根鞘與毛袋之間的粘蛋白和類粘蛋白，從而使毛從毛孔脫落，如圖6-A所示，JW-3酶法黃牛皮脫毛后，牛毛的外觀狀態(tài)完整；且從顯微狀態(tài)來看，酶法脫毛后黃牛毛根部完整，未見明顯損傷（圖7-A）。而灰堿法脫毛的機(jī)理是化學(xué)試劑溶解毛被和表皮，由圖6-B所示，灰堿法黃牛皮脫毛后，牛毛被分解成彎曲的片段；從顯微狀態(tài)來看，牛毛被分解成不同長(zhǎng)度的片段且能明顯看出斷裂的橫斷面（圖7-B）。酶法脫毛屬于保毛脫毛法，毛發(fā)完整脫離皮層，在脫毛工藝中可經(jīng)濾布過濾回收利用，為JW-3蛋白酶回收制革廢棄動(dòng)物毛發(fā)應(yīng)用在紡織行業(yè)開辟了新方向。

圖6 不同工藝脫毛后的黃牛毛狀態(tài)觀察

圖7 不同工藝脫毛后黃牛毛顯微狀態(tài)觀察

2.5.2 黃牛皮脫毛感官效果對(duì)比 研究表明，1398、2709、166等因酶制劑中膠原蛋白酶的存在，易造成皮粒面損傷及成革松面的現(xiàn)象。經(jīng)脫毛實(shí)驗(yàn)表明JW-3蛋白酶對(duì)黃牛皮脫毛后皮粒面光滑、干凈，未見小毛的存在，粒面及肉面的顏色均呈現(xiàn)淡粉色（圖8-A3、A4）；灰堿法脫毛后毛被被溶解、粒面干凈呈現(xiàn)棕褐色，但毛囊周圍的褐色細(xì)胞雜質(zhì)未清除干凈，肉面因硫化鈉的作用呈現(xiàn)淡藍(lán)色，水洗不掉（圖8-B3、B4）。兩種工藝脫毛后的皮粒面顯微觀察見圖9，其中圖9-A中酶脫毛后毛孔清晰，邊緣光滑無(wú)損傷；而灰堿法脫毛也觀察到邊緣清晰的毛孔，但毛孔中明顯看到毛根的存在。脫毛試驗(yàn)感官結(jié)果表明JW-3蛋白酶能夠達(dá)到灰堿法脫毛干凈、粒面光滑的效果，且酶法脫毛能夠去除毛根，獲得完成動(dòng)物毛發(fā)。

2.5.3 脫毛過程中各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)比 由表1可看出JW-3酶法脫毛浴液及皮塊表面的pH均在中性左右，廢水中pH指標(biāo)顯著優(yōu)于灰堿法脫毛；總固含物（TS）與懸浮固體物（SS）是重要的污染指標(biāo)，而酶法脫毛浴液中的TS及SS指標(biāo)顯著低于灰堿法；總氮（TNb）反應(yīng)了脫毛的進(jìn)程，兩種工藝浴液中總氮相當(dāng)，而灰堿法脫毛水平略高，可能是浴液中有少量牛毛水解后的角蛋白的加入。由于硫化鈉的加入使灰堿法脫毛皮塊膨脹利于后期的剖層，而JW-3酶法脫毛皮塊厚度僅為前者的1/2，后期剖層工藝需要加入堿進(jìn)行膨脹。綜合比較兩種脫毛工藝，雖感官比較中兩種方法脫毛效果略有差異，但均能完成脫毛過程，且酶法脫毛未有爛面情況發(fā)生。但酶法脫毛所產(chǎn)生的污染負(fù)荷更小且能從毛根處脫毛，獲得完整的動(dòng)物毛發(fā)，雖在后期需要堿膨脹后剖層，但綜合評(píng)價(jià)，JW-3酶法脫毛可以成為灰堿法脫毛的清潔化替代工藝。

3 討論

隨著制革業(yè)對(duì)清潔化生產(chǎn)工藝的需求，酶法脫毛制革因酶制劑來源廣泛、易獲得、無(wú)毒害、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)成為替代傳統(tǒng)灰堿法脫毛工藝的首選［15，16］。目前市場(chǎng)中的脫毛酶如1398中性蛋白酶、2709堿性蛋白酶、角蛋白酶等均可以完成脫毛工藝，但因酶制劑中膠原蛋白酶的存在，需對(duì)酶脫毛工藝嚴(yán)格要求，稍有控制差錯(cuò)便會(huì)造成皮塊爛面；而純化酶系，祛除膠原蛋白酶的工藝無(wú)疑增加使用成本［17］，使得酶法脫毛始終不能在制革工藝中規(guī)?；茝V。

本研究對(duì)前文構(gòu)建工程菌株WB800N/pHT43-npr發(fā)酵生產(chǎn)JW-3蛋白酶的性質(zhì)進(jìn)行研究，明確該酶與灰堿法脫毛后的皮粒面效果相當(dāng)，且產(chǎn)生的污染負(fù)荷小并可獲得完整的動(dòng)物毛發(fā)；同時(shí)建立了JW-3蛋白酶的脫毛工藝，并明確了潛在的有利于脫毛的化學(xué)助劑。本機(jī)構(gòu)曾研發(fā)JW-1、JW-2脫毛酶推廣應(yīng)用至河北的制革區(qū)，皆因酶制劑對(duì)皮膠原的破壞而中斷應(yīng)用。目前對(duì)清潔化脫毛工藝的研究集中在無(wú)硫、少硫化學(xué)脫毛方法［18］，脫毛用酶的研究熱度下降，本研究首次報(bào)道了工程菌株生產(chǎn)的一種新型蛋白酶用于制革脫毛環(huán)節(jié)，解決了1398、2709等現(xiàn)有蛋白酶制劑在脫毛工藝的局限性［8］，用其替代傳統(tǒng)灰堿法脫毛工藝實(shí)現(xiàn)清潔化脫毛制革，緩解制革業(yè)的重污染現(xiàn)狀，也為該酶處理制革中的含毛固體廢棄物及紡織行業(yè)中動(dòng)物毛發(fā)的獲取途徑提供了新的思路［19］。但研究發(fā)現(xiàn)工程菌株發(fā)酵產(chǎn)酶水平較低［20］，且液體酶制劑的穩(wěn)定性差、保質(zhì)期相對(duì)較短，通過基因工程手段提升蛋白酶基因的表達(dá)水平及穩(wěn)定性將更有利于JW-3蛋白酶推廣至制革區(qū)應(yīng)用［21］。

圖8 不同工藝脫毛黃牛裸皮粒面觀察

圖9 不同工藝脫毛后黃牛裸皮粒面顯微觀察

表1 不同工藝脫毛后相關(guān)指標(biāo)對(duì)比

4 結(jié)論

酶學(xué)性質(zhì)試驗(yàn)表明JW-3蛋白酶在30℃、中性pH條件下及化學(xué)試劑Ca2+、Mn2+、Triton X-100、Tween20、Tween80中保存穩(wěn)定性較好。經(jīng)脫毛應(yīng)用比較表明JW-3酶法脫毛可以成為替代灰堿法脫毛制革的清潔化生產(chǎn)工藝。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Enzymatic Characteristics of a Novel Protease and Its Application for Dehairing

ZHENG Xiang1YANG He-bao1HU Mei-rong2LIU Chun-mao1WU Fang-tong1CAO Qian-rong1
（1. Enzyme Preparation Office，Institute of Microbiology，Hebei Academy of Sciences，Baoding 071051；2. CAS Key Laboratory of Microbial Physiological and Metabolic Engineering，Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100010）

Protease can be applied in dehairing process of leather industry as an eco-friendly product. We aim to clear the dehairing performance and the process of enzymatic dehairing of JW-3 protease produced by recombinant strain WB800N/pHT43-npr，and to provide technical support for clean technology of leather manufacture. The thermostability and pH value tolerance of JW-3，as well as the effects of metal ions and chemicals on its enzyme activity were investigated. Meanwhile，the ability of enzymatic hydrolysis on collagen，and the comparison between enzymatic dehairing and lime-sulfide dehairing process on cowhide were evaluated. Results showed that JW-3 protease was in poor thermal resistance that enzyme activity began to decay after remaining 1 h at 40℃，and presented solid stability at pH 6 and 7，and was stable in the surfactant of Triton X-100，Tween20，Tween80；moreover，metal ions of Ca2+，Mn2+activated its activity. Furthermore，JW-3 protease was incapable of hydrolyzing collagen，and showed the equivalent dehairing performance with lime-sulfide process，also by which nondestructive depilated hair could be recycled. Thus，JW-3 protease can complete cowhide hair removal process，but not hydrolyze the collagen of cowhide，and can be used as an environmentally friendly alternative to the conventional chemical process.

leather manufacture；clean-technology；protease；enzymatic properties

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1098

2016-12-05

河北省省級(jí)省校科技合作開發(fā)資金項(xiàng)目（2016049819）

鄭翔，男，碩士，研究方向：酶制劑的開發(fā)與應(yīng)用；E-mail：569186912@163.com