李白 李軍 沈亞強

（浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學研究院（所），嘉興 314016）

三株土壤解磷細菌的分離及其解磷效果分析

李白 李軍 沈亞強

（浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學研究院（所），嘉興 314016）

旨為解決農(nóng)業(yè)面源污染問題，分離鑒定土壤解磷微生物并開發(fā)復合微生物菌劑。以有機磷農(nóng)藥及無機難溶磷作為篩選磷源，對土壤中具有解磷能力的微生物進行分離、鑒定并對其解磷效果進行分析。從土壤中分離得到3株解磷細菌，分別命名為菌株W、Y、B；3個菌株均是革蘭氏陰性菌；W菌株對敵百蟲的降解能力最強，達到17.39%，B菌株對毒死蜱的降解率最強，為23.06%；3個菌株對固態(tài)難溶磷的解磷效果顯著，其中B菌株解磷量最高，為96.31 mg/L；復合菌的解磷效果明顯優(yōu)于單菌，另外復合菌對稻田、大棚土壤解磷的促進效果顯著，分別增加18.38 mg/L、14.08 mg/L。分離得到3株有效土壤解磷細菌，有一定的有機磷農(nóng)藥降解能力，對無機磷溶解效果較強，構建的復合菌劑對土壤解磷的促進效果顯著。

有機磷農(nóng)藥；無機磷；復合微生物；解磷細菌

當今，農(nóng)業(yè)面源污染已成為重要的環(huán)境問題。農(nóng)業(yè)源總氮（TN）、總磷（TP）分別占全國排放總量的57.2%和67.4%，已超過工業(yè)污染［1］。肥料和農(nóng)藥是農(nóng)業(yè)面源污染重要來源，一方面直接污染水源，另一方面通過促進藻類過度增殖而污染水源。藻類的過度繁殖會使水體產(chǎn)生顯著的臭氣物，且“藻毒素”含量超標。流行病學調查發(fā)現(xiàn)，飲水中的微囊藻毒素（MC-LR）與肝癌的地區(qū)高發(fā)性及原發(fā)性肝細胞癌的病人數(shù)有關［2］。殘留的農(nóng)藥進入水體后，會通過食物鏈在水產(chǎn)品中富集，引發(fā)質量安全問題。2006年浙江省嘉興市由于晚稻田害蟲防治，使用大量農(nóng)藥，污染了環(huán)境，引發(fā)家蠶大面積中毒事件［3］。

針對農(nóng)業(yè)面源污染，楊林章等［4］提出了“4R”防治理論，即：源頭減量，過程截斷，末端修復，循環(huán)利用。而環(huán)境微生物技術在“4R”階段中的應用，將進一步提升防治效果［5］。研究表明，微生物對受污染的土壤、水體具有良好的修復效果［6-10］。此外，一些微生物進入環(huán)境中，對作物的生長有促進作用，段秀梅等［11］研究發(fā)現(xiàn)，用兩株解磷菌，黏質沙雷氏菌（Serratia marcescens）和產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）處理玉米，結果株高、根干重、植株干重分別比未處理組高29.9%、16.7%、24.2%，類似的微生物肥料在耕地質量提升中具有重要作用［12］。這類微生物菌肥可以增加土壤中養(yǎng)分的綜合利用，減少化肥的施用和流失，在源頭階段減少污染量。

本研究結合了農(nóng)業(yè)面源污染與作物促生問題，以雙功能菌種的分離作為切入點，從環(huán)境中獲得能降解有機磷農(nóng)藥，并能溶解無機磷的菌種，并建立以該類菌株為核心的復合微生物菌劑，探索該菌劑應用于分解有機磷農(nóng)藥、溶解無機難溶磷的綜合方法和效果，為其在農(nóng)業(yè)面源污染及作物促生中的應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和培養(yǎng)基 敵百蟲標準品（100 μg/mL u=3%）購自阿拉丁公司，毒死蜱標準品（99.0%）購自上海將來實業(yè)有限公司，海博細菌生化鑒定試劑盒購自青島海博生物技術有限公司，其他試劑為分析純。

改良蒙金娜液體培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g、（NH4）2SO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MnSO4·H2O 0.03 g、CaCO35 g、酵母提取物1 g，純水定容至1 000 mL，pH 7.0。

改良蒙金娜無機磷培養(yǎng)基：1 000 mL蒙金娜液體培養(yǎng)基中加入5 g Ca3（PO4）2。

改良蒙金娜固體培養(yǎng)基：1 000 mL蒙金娜液體培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂。

1.1.2 菌種 有效微生物（Effective microorganisms，EM）液體，購自山西天意生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離 取樣：土樣取自浙江省嘉興市農(nóng)科院露天菜地土壤。接種：土樣用無菌水1∶100（W/V）稀釋后，以2%體積比接種于蒙金娜液體培養(yǎng)基（同時含0.02%有機磷農(nóng)藥、0.01%毒死蜱、0.01%敵百蟲）。培養(yǎng)：30℃、150 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)5 d后取培養(yǎng)后菌液以2%體積比接種，重復培養(yǎng)2次。涂布：取培養(yǎng)后的菌液，按10-3-10-7梯度稀釋，取200 mL涂布于蒙金娜無機磷固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)5 d。劃線：篩選具有明顯解磷圈的菌落劃線分離純化3次，斜面培養(yǎng)基4℃保存，液體培養(yǎng)基-80℃保存。

1.2.2 有機磷農(nóng)藥降解測定 將分離菌株W、Y、B稀釋至OD600=1.0，以2% 體積比分別接種到含0.01%毒死蜱的蒙金娜液體培養(yǎng)基和含0.01%敵百蟲的蒙金娜液體培養(yǎng)基，30℃、150 r /min的搖床上振蕩培養(yǎng)72 h，用分光光度法快速測定敵百蟲［13］、毒死蜱［14］含量，實驗重復3次，分別計算敵百蟲、毒死蜱降解率，農(nóng)藥降解率（%）=（培養(yǎng)前濃度-培養(yǎng)后濃度）/培養(yǎng)前濃度×100%。

1.2.3 固態(tài)難溶磷溶解測定 分離菌株W、Y、B分別以2%體積比接種到蒙金娜無機磷液體培養(yǎng)基，30℃、150 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)72 h，用鉬銻抗比色法測定可溶無機磷含量，試驗重復3次，計算解磷量，解磷量=培養(yǎng)后濃度-培養(yǎng)前濃度，磷凈增加量為前后磷濃度差。

1.2.4 分離菌的生化特征 分離菌株W、Y、B的主要生化特征用海博細菌生化鑒定試劑盒檢測21個典型生化指標。

1.2.5 分子鑒定 用分離菌株W、Y、B 培養(yǎng)液對16S rDNA序列PCR擴增。培養(yǎng)的菌液用無菌水洗滌、重懸，懸液用沸水浴處理5 min，再冰浴冷卻1 min，經(jīng)10 000 r/min 離心后取上清為模板。菌液PCR引物：27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和1 492R：5'-GHTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反應體系（50 mL）為：2×PCR mix 25 mL，無菌水22 mL，引物27F（10 mmol/L）和1492R（10 mmol/L）各1 mL，模板1 mL。PCR擴增條件為：94℃預變性4 min；94℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，30個循環(huán)；72℃最后延伸5 min。反應產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，測序由上海賽默飛世爾科技有限公司完成。

1.2.6 溫度、初始pH值對分離菌株增殖的影響 將-80℃保存的分離菌株W、Y、B分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，30℃、150 r/min 復蘇培養(yǎng)24 h，至OD600=1.5，再以1%體積比接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，分別在20、25、30、35、40和45℃下150 r/min 培養(yǎng)48 h，試驗重復3次，測定菌液OD600值。

將復蘇的菌液以1%體積比接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的初始pH值分別為3、4、5、6、7、8、9、10、11和30℃、150 r/min 培養(yǎng)48 h，實驗重復3次，測定菌液OD600值。

1.2.7 復合菌的解磷效果 將W、Y、B 3個分離菌株稀釋至OD600=1.0，EM菌（液體）稀釋至OD680=1.0。將W、Y、B單一菌株、EM菌及復合菌劑（表1）分別以2%體積比接種到蒙金娜無機磷培養(yǎng)基，30℃、150 r/min 的搖床上振蕩培養(yǎng)24 h，用鉬銻抗比色法測定無機P含量，實驗重復3次，分析解磷量。

表1 復合菌中各分離菌株比例

1.2.8 復合菌對土壤解磷的促進 采集浙江省嘉興市農(nóng)科院內稻田、露天菜地、大棚耕層土樣，參照陳貴等［15］的方法測定土樣全氮、堿解氮、速效磷、速效鉀、有機質及pH值，樣品理化性狀見表2。土樣用無菌水按1∶100（W/V）稀釋，土壤懸液以2%體積比接種于蒙金娜無機磷培養(yǎng)基。試驗組將復合菌H2以1%體積比添加到土壤懸液中，30℃、150 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)72 h，用鉬銻抗比色法測定無機P含量。對照各組土壤懸液中未添加復合菌H2，培養(yǎng)、測定條件與實驗組相同。實驗重復3次，解磷增量=H2組培養(yǎng)后濃度-相應對照組培養(yǎng)后濃度。

表2 不同耕層土壤理化性狀

2 結果

2.1 解磷菌株的分離

菜地土壤經(jīng)有機磷農(nóng)藥、無機磷培養(yǎng)基雙重篩選后，分離純化得到白色、黃色及藍色3個菌株，分別命名為W、Y、B。培養(yǎng)5 d后，10-5稀釋的3個菌株均能在蒙金娜無機磷培養(yǎng)基上形成清晰解磷圈（圖1）。

圖1 W、Y、B分離菌株的形態(tài)特征及解磷圈

2.2 分離菌株對有機磷農(nóng)藥的降解

進一步測定了3個分離菌株對有機磷農(nóng)藥的降解能力。敵百蟲和毒死蜱降解測定結果（圖2）表明，3個菌株對有機磷農(nóng)藥都有一定的降解能力。其中W菌株對敵百蟲的降解能力最強，經(jīng)過72 h培養(yǎng)，敵百蟲濃度由102.05 mg/L降到84.30 mg/L，降解率為17.39%。B菌株對毒死蜱的降解率最強，經(jīng)過72 h培養(yǎng)，毒死蜱濃度由103.42 mg/L降到79.58mg/L，降解率為23.06%。

圖2 分離菌株W、Y、B對敵百蟲和毒死蜱的降解

2.3 分離菌株對固態(tài)難溶磷的溶解

解磷測定結果（圖3）表明，3個分離菌株解磷能力穩(wěn)定，效果顯著?？扇軣o機磷初始濃度由3.05 mg/L先下降，再逐步上升。培養(yǎng)24 h與培養(yǎng)4 h相比，W菌株解磷凈增加量較低，為5.28 mg/L，B菌株為6.06 mg/L，Y菌株解磷量較高，為6.75 mg/L。培養(yǎng)72 h與培養(yǎng)24 h相比，W、Y菌株解磷凈增加量為87.51 mg/L、86.92 mg/L，B菌株較高，為92.89 mg/L，與初始相比，提高了96.31 mg/L。

圖3 W、Y、B菌株對無機磷的溶解能力測定

2.4 菌株生理生化特征分析

利用海博細菌生化鑒定試劑盒對W、Y、B三個分離菌株的21個典型生化指標進行測定，結果（表3）表明，3個株菌非腸道微生物，偏好氨基酸、有機酸。

2.5 分離菌株的分子鑒定

經(jīng)菌液PCR擴增后，分離菌株W、Y、B 均擴增得到1 500 bp左右的條帶（圖4）。測序后，經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對表明，W為皮氏羅爾斯頓菌（Ralstonia pickettii），相似度99%，Y為棲稻假單胞菌（Pseudomonas oryzihabitans），相似度100%，B為油菜假單胞菌（Pseudomonas brassicacearum），相似度100%。

圖4 分離菌株W、Y、B的16S rRNA PCR擴增

表3 分離菌株W、Y、B的生理生化特性

2.6 溫度、初始pH對菌種增殖的影響

不同溫度下W、Y、B菌體增殖變化情況如圖5。W及Y菌株的最適培養(yǎng)溫度為35℃，培養(yǎng)24 h后，OD600分別達到1.49及2.24；B菌株的最適培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)24 h后，OD600達到2.18。

圖5 溫度對分離菌株W、Y、B生長的影響

初始pH是影響菌株生長的化學因子，不同初始pH下菌株W、Y、B生長變化如圖6。結果表明，3個菌株培養(yǎng)的最適初始pH值均為7-8，培養(yǎng)24 h后，W、Y、B 3個菌株的OD600分別達到1.83、2.33及2.50。初始pH低于5或高于10，3個菌株生長明顯減弱。

圖6 初始pH值對菌種增殖的影響

2.7 復合菌的解磷效果

單一菌株（圖3）與復合菌株（表1）解磷試驗結果（圖7）表明，24 h解磷效果復合菌株優(yōu)于單一菌株。培養(yǎng)24 h后，單一菌株中Y菌株解磷量較高，為6.75 mg/L；雙菌株復合以W、Y菌株混合解磷效果最好，解磷量為5.67 mg/L；單菌與雙菌解磷量差異較小，但W、Y、B 3菌株復合菌解磷量高于單、雙菌株，達到17.40 mg/L；W、Y、B3菌株與EM混合后，解磷量達到119.46 mg/L。復合菌較單菌株解磷能力強，可能與復合菌內菌種間互利作用有關。

圖7 復合菌株解磷實驗

圖8 多菌株不同比例的解磷實驗

多菌株不同比例（表1）解磷實驗（圖8）表明，適當增加W、Y、B復合菌中B菌株的比例，解磷量由3.54 mg/L上升到169.13 mg/L。以適當比例加入EM，解磷量由123.18 mg/L上升到322.64 mg/L。 EM、W+Y+B復合菌、W+Y+B+EM復合菌之間相比較，解磷量分別能達到46.91 mg/L、169.13 mg/L、322.64 mg/L，菌種越豐富、解磷量越高。

2.8 復合菌的土壤解磷效果分析

稻田土、露天菜地、大棚土壤懸液經(jīng)H2處理后，可溶無機磷濃度比未添加復合菌的對照組均有一定提升（圖9）。培養(yǎng)液初始磷濃度為3.61 mg/L，處理組中露天菜地組解磷量比對照提升了1.96 mg/L，效果較弱，可能該土壤已具有類似解磷菌系；水稻田、大棚組比對照解磷量的提升分別為18.38 mg/L、14.08 mg/L，效果顯著，可能受單一施肥及封閉條件影響，水稻田、大棚土壤中解磷類菌系結構簡單，解磷能力弱。

3 討論

本研究從土壤中分離到3個有機磷降解菌株，鑒定結果表明，它們分別為皮氏羅爾斯頓菌、棲稻假單胞菌、油菜假單胞菌。3個菌株都是葡萄糖非發(fā)酵革蘭氏陰性桿菌，條件致病，人的感染較少見［16］。皮氏羅爾斯頓菌屬于羅爾斯頓菌屬，耐貧營養(yǎng)環(huán)境，能修復受污染的環(huán)境。冷守琴等［17］發(fā)現(xiàn)1株降解氯苯的皮氏羅爾斯頓菌，在適宜條件下，3 d內對220 mg/L的氯苯去除率可達99%。Ryan等［18］綜述了該菌對多種工業(yè)污染物如甲苯和三氯乙烯等的修復能力。棲稻假單胞菌屬于惡臭假單胞菌屬，道能增強纖維素水解酶的活性［19］。油菜假單胞菌屬于假單胞菌屬，是植物防病和促生菌，它被報道能拮抗棉花黃萎病菌、惡疫霉菌、番茄細菌性潰瘍病菌亞種、果膠桿菌等植物病菌［20-22］。3個菌種對環(huán)境修復和植物促生都有各自獨特的功能，以此為核心構建的復合微生物將繼承這些優(yōu)勢。

圖9 復合菌對稻田、露天菜地、大棚土壤解磷效果

有機磷農(nóng)藥毒死蜱、敵百蟲的降解實驗表明，本研究獲得的3個菌株都有耐受性，并具有一定的有機磷農(nóng)藥降解能力。其中，W菌株對敵百蟲的降解能力最強，B菌株對毒死蜱的降解率最強，降解能力在20%左右，比報道的專一降解有機磷農(nóng)藥的菌種較低。一方面降解有機磷農(nóng)藥可能需要多種菌種參與，而菌株的純化過程破壞了菌種之間的互作關系；另一方面本研究分離的菌種兼具修復污染和植物促生兩方面功能，單一降解能力較其他菌種弱。這種不足可以通過轉基因的方式定向改良。張揚等［9］發(fā)現(xiàn)皮氏羅爾斯頓菌能降解三氯吡啶醇（毒死蜱降解的中間產(chǎn)物），但不能有效地降解毒死蜱，他通過轉基因構建了能完全礦化毒死蜱的工程菌。有機磷農(nóng)藥的降解需要一系列降解酶的參與，這些酶在自然環(huán)境下可能分布在不同的微生物體內，可以通過轉基因技術把這系列基因聚合在一起，令菌株具有完全的礦化多種農(nóng)藥的能力，提高環(huán)境微生物技術的適用性與穩(wěn)定性

純化后的菌株W、Y、B解磷實驗表明，3個菌株可以單獨溶解固態(tài)難溶磷，而且解磷效果穩(wěn)定，其中4 h可溶無機磷濃度較初始值降低，解磷量＜0，可能培養(yǎng)初期菌種的增殖消耗了培養(yǎng)液中少量可溶磷。溶解Ca3（PO4）2實驗中，W、Y、B處理組的可溶無機磷濃度上升后，其培養(yǎng)液pH值為3-4（初始pH7），推測其分泌的有機酸起到了溶解固態(tài)無效磷的作用。但在中性LB中培養(yǎng)后，其pH仍為中性，推測產(chǎn)酸酶為誘導酶，低濃度磷是其誘導因子。多個研究顯示解磷菌溶磷能力與pH之間相關性仍存在爭議［23-27］，本研究發(fā)現(xiàn)兩者之間存在一定相關性。自然環(huán)境中解磷細菌可能存在多種溶磷機制，可以通過產(chǎn)酸溶解固態(tài)磷，也可能通過其他途徑。

EM菌是由多種微生物組成的復合菌劑，包含酵母菌、乳酸菌、光合細菌、放線菌等，具有修復土壤、凈化水質、促進植物生長等功能［7，28］。本研究發(fā)現(xiàn)，EM也有一定的解磷能力，與W、Y、B菌株復配后，溶磷效果顯著提升，當EM在復合菌中的比例適宜時，能進一步提升整體解磷效果。侯佳奇等［29］通過復配菌株，各個菌株間通過相互促進，協(xié)同共生效果最佳，顯著提高了解磷量。適當提高復合菌中微生物種類，可促進菌間互作，有利于核心菌群發(fā)揮功能。

由W、Y、B、EM組成的復合菌劑與水稻田、露天菜地、大棚的土壤懸液混合后，對土壤中磷的溶解促進效果不同。菌劑與水稻田、大棚土壤混合后促進效果最好，可能這類土壤中缺乏溶磷微生物，添加復合菌劑后，促進效果顯著。而露天菜地中溶磷微生物可能較豐富，添加復合菌劑后促進效果不明顯。這表明復合菌劑對不同土壤的溶磷促進作用與土壤自帶的微生物有關。添加的菌肥與環(huán)境土著微生物互作良好，將促進土壤肥力；互作較弱甚至拮抗，將無法提升肥力，甚至降低土壤活性。微生物菌肥的施用，在測土配方的基礎上，再根據(jù)土壤自身菌群情況下選擇，能獲得更好的預期效果。

4 結論

本研究從土壤中分離到3個有機磷降解菌株，并證實其具有一定的有機磷農(nóng)藥降解能力，對無機磷溶解效果較強，構建的復合菌劑對土壤解磷的促進效果顯著。

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（責任編輯 狄艷紅）

Isolation and Characterization of Three Bacterial Strains Capable of Phosphate-solubilizing from Soil

LI Bai LI Jun SHEN Ya-qiang
（Jiaxing Academy of Agricultural Sciences，Jiaxing 314016）

This work is to isolate and identify the phosphate-solubilizing microorganisms and develop microbial complex agents targeting for solving the problems of agricultural non-point source pollution. The organic phosphorus pesticide “chlorpyrifos”，“trichlorfon” and insoluble inorganic phosphorus Ca3（PO4）2were used as phosphorus source to screen and identify the phosphate-solubilizing microbe from soil，as well as analyze their phosphate-solubilizing capacity. The result showed that three phosphate-solubilizing bacterial strains（W，Y and B）were isolated from the soil. All three strains were gram-negative strains. The degradation results of organophosphorus pesticides showed that strain W had the strongest degradation rate of trichlorfon with 17.39%，and strain B had the strongest degradation rate of chlorpyrifos with 23.06%. All three strains solubilized significantly solid insoluble phosphate，and the B strain had the highest phosphorus-solubilizing capacity of 96.31 mg/L. The solubilizing phosphate results of single strain and compound strains showed that the effect of compound strains was significantly better than single strain. When W，Y，and B strains mixed with EM，the phosphorus-solubilizing capacity rose to 119.46 mg/L，and the phosphorussolubilizing capacity in paddy fields and greenhouse soil was improved to 18.38 mg/L and 14.08 mg/L，respectively. In conclusion，three strains isolated from soil have the abilities of degrading organic phosphorus pesticide and solubilizing inorganic phosphorus Ca3（PO4）2. The compound strains significantly improved the phosphorus-solubilizing capacity of soil significantly.

organophosphorus pesticides；inorganic phosphorus；compound microbial；phosphate-solubilizing bacteria

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0915

2016-09-29

嘉興市科技計劃項目（2014AY21001）

李白，男，農(nóng)藝師，研究方向：生物技術；E-mail：libaia@yeah.net

李軍，男，副研究員，研究方向：生物技術；E-mail：lijunjx1@163.com