羅 斌， 劉江濤， 費(fèi)高強(qiáng)， 韓 婷， 王麗娜， 晚亞雄， 張 凱， 王任洪

(蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生研究所， 甘肅蘭州 730000)

不同溫度刺激與大氣PM2.5對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的交互毒性作用研究*

羅 斌△， 劉江濤+， 費(fèi)高強(qiáng)+， 韓 婷， 王麗娜， 晚亞雄， 張 凱， 王任洪

(蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生研究所， 甘肅蘭州 730000)

目的：探究不同溫度刺激與大氣PM2.5對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的交互毒性作用。方法：提取大鼠肺泡巨噬細(xì)胞，分別在18℃、24℃、30℃、37℃、43℃下培養(yǎng)，每個(gè)溫度組下設(shè)置不同濃度PM2.5處理，依次為100 μg/ml、50 μg/ml、25 μg/ml、0 μg/ml。處理8 h后，觀察兩因素對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞存活率和吞噬功能的影響。結(jié)果：同一溫度下,不同劑量PM2.5組的相對細(xì)胞存活率和吞噬功能均顯著低于空白對照組(P<0.05)，且劑量越高，毒性作用越強(qiáng),吞噬功能越弱。而在各溫度組間，37℃組相對細(xì)胞存活率和吞噬功能最高，而隨著溫度的升高或降低，相對細(xì)胞存活率降低，吞噬功能下降。結(jié)論：不同溫度刺激和大氣PM2.5處理均會對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，使其吞噬能力降低，并且溫度與37℃差距越大、PM2.5濃度越高時(shí)毒性作用越明顯。

不同溫度刺激；大氣PM2.5；肺泡巨噬細(xì)胞；交互毒性作用

【DOI】 10.12407/j.cjap.5347.2017.018

PM2.5是指空氣動力學(xué)直徑小于2.5 μm的可吸入顆粒物，它能通過呼吸道被人體吸入，到達(dá)肺部，部分顆粒物可通過氣體交換進(jìn)入血液并到達(dá)各遠(yuǎn)隔器官，引起一系列炎癥反應(yīng)，而這也是大氣PM2.5對人體的主要毒性作用[1]。研究認(rèn)為大氣顆粒物尤其是PM2.5能誘發(fā)和加重呼吸系統(tǒng)疾病，引起患者死亡率和發(fā)病率增加。其機(jī)制可能與PM2.5對肺泡巨噬細(xì)胞的毒性有關(guān)。肺泡巨噬細(xì)胞(alveolar macrophages, AMS)作為肺部的“清道夫”，具有吞噬、分泌和免疫的作用，作為一道屏障保護(hù)著人體[2]。有大量文獻(xiàn)報(bào)道，大氣顆粒物PM2.5進(jìn)入肺部會對肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，使肺泡巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子，并影響其吞噬功能[3]。這些由肺泡巨噬細(xì)胞在接觸到顆粒物時(shí)所釋放的炎癥物質(zhì)能激活肺中其它細(xì)胞，如控制和促進(jìn)白細(xì)胞在肺及氣道內(nèi)募集并引起炎性反應(yīng)。此外，顆粒物還能降低AMs吞噬細(xì)菌能力的氧化自由基介導(dǎo)過程，從而抑制AMs對感染物質(zhì)的反應(yīng)[4-6]。因此，呼吸道疾病患者暴露顆粒物后會促進(jìn)已有炎癥反應(yīng)和抑制抗感染免疫功能，從而加重已有呼吸道疾病。此外，呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)生和加重還與天氣的變化有密切的關(guān)系，氣溫過高或過低都會對其產(chǎn)生嚴(yán)重影響。在實(shí)際環(huán)境中，不同溫度與PM2.5往往同時(shí)存在并影響著人體的健康，并有研究認(rèn)為二者之間存在著交互作用[7, 8]。本團(tuán)隊(duì)的前期動物實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)低溫刺激可能增加大氣PM2.5對大鼠肺組織及系統(tǒng)炎癥的影響[9]。體外實(shí)驗(yàn)方面，H.SALMAN等在體外培養(yǎng)腹腔巨噬細(xì)胞，選擇24℃和乳膠顆粒處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與37℃對照組相比，24℃組腹腔巨噬細(xì)胞的的吞噬能力下降[10]。

本研究通過體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，使用不同濃度PM2.5在不同溫度培養(yǎng)下對其進(jìn)行處理，檢測處理之后肺泡巨噬細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞存活率和吞噬功能，探究不同溫度刺激與大氣PM2.5對肺泡巨噬細(xì)胞的交互毒性作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

1.1.1 主要試劑 胎牛血清(PAN，德國)；RPMI1640培養(yǎng)基(Hyclone，美國)；四甲基偶氮唑鹽(3-(4,5-Dimethyl-2-Thiazolyl)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide，MTT)；中性紅染液(Solarbio，中國)。

1.1.2 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(THERMO，美國)；倒置顯微鏡(Olympus,日本)；酶標(biāo)儀(Biotek,美國)。

1.2 PM2.5采集

于蘭州大學(xué)某實(shí)驗(yàn)樓頂空曠地帶(離地10 m)，利用PM2.5采樣器(TH-150CⅢ型智能中流量懸浮微粒物采樣器，武漢，天虹智能儀表廠)在2015年4月到8月連續(xù)采樣，流量100 L/min，采集于玻璃纖維濾膜。處理時(shí)將濾膜剪為1 cm×1 cm的小塊，收集于干凈的小燒杯內(nèi)，使用雙蒸水將其完全浸沒，利用超聲波清洗儀振蕩洗脫顆粒物，震蕩3次，每次30 min。6層紗布過濾，收集濾液于離心管中，8 000 r/min離心15 min，收集下層沉淀物于培養(yǎng)皿內(nèi)，真空冷凍干燥，顆粒物稱重后避光保存，待用。染毒前，使用RPMI1640培養(yǎng)基將PM2.5配制成濃度為500 μg/ml的母液，超聲振蕩15 min，高溫高壓滅菌15 min，置于4℃冰箱待用。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物及分組

SPF級健康雄性大鼠35只，10周齡，購買于甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，合格證號：SCXK(甘)2004-0006。體重275.34±20.55 g。實(shí)驗(yàn)前利用Excel工作表按體重將實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為5組(n=7)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 肺泡巨噬細(xì)胞的提取 實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食禁水8 h，腹腔注射7%的水合氯醛麻醉大鼠，置于鼠臺，將冰塊堆積于大鼠周圍，開腹并行腹主動脈放血；暴露氣管，插入灌胃針并結(jié)扎、固定，使用10 ml注射器灌注無菌冷PBS溶液8 ml，輕輕按摩肺臟30 s后回收灌洗液，重復(fù)5次。將收集到的灌洗液裝入50 ml離心管中，1 200 r/min，離心15 min，一次性棄上清。使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并使用微量加樣槍吹打混勻2 min，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105cells/ml，接種于96孔板中，每孔100 μl。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，使用滅菌PBS洗去未貼壁細(xì)胞。

1.4.2 PM2.5處理 本實(shí)驗(yàn)共設(shè)置5個(gè)溫度組，分別為18℃、24℃、30℃、37℃、43℃。每個(gè)溫度組設(shè)置4個(gè)PM2.5處理組，依次為高劑量(100 μg/ml)組、中劑量(50 μg/ml)組、低劑量(25 μg/ml)組、空白對照組。在96孔板每孔加入100 μl對應(yīng)濃度的PM2.5溶液，在相應(yīng)溫度、5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)8 h，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。

1.5 細(xì)胞毒性檢測

采用MTT分析法。實(shí)驗(yàn)終止前4 h每孔加入MTT溶液20 μl。4 h后，小心棄上清，每孔加入100 μl DMSO溶液。放置15 min，在酶標(biāo)儀上570 nm測定光密度(OD)值,并與37℃ 0 μg /ml組的OD值做比，得出相對細(xì)胞存活率[11,12]。

1.6 吞噬功能檢測

采用中性紅法。在相應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件下培養(yǎng)后除去培養(yǎng)板的上清液，PBS 洗 1 遍后，加入 200 μl含0.1%中性紅溶液(為防止中性紅結(jié)晶的形成，中性紅溶液在 37℃培養(yǎng)箱過夜，用前過濾器過濾)。孵育 30 min后，吸棄中性紅溶液。PBS 洗 3 次，每次吸凈孔內(nèi)殘留液體。每孔加入無水乙醇和乙酸 1∶1 體積混合液 200 μl，裂解 10 min，充分混勻。酶標(biāo)儀測定550 nm處OD值[13]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 不同溫度與不同濃度PM2.5處理對肺泡巨噬細(xì)胞形態(tài)影響

實(shí)驗(yàn)8 h后，在倒置顯微鏡下觀察大鼠肺泡巨噬細(xì)胞，可見細(xì)胞形狀不規(guī)則，在細(xì)胞胞漿中可見被吞噬的顆粒物，部分細(xì)胞已經(jīng)裂解死亡，有細(xì)胞碎片出現(xiàn)。其中圖1為50 μg/ml PM2.5處理的不同溫度下大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的形態(tài)，提示不同溫度對細(xì)胞的損傷不同；圖2則為37℃下不同濃度PM2.5處理對于大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的影響，可見PM2.5濃度不同，細(xì)胞的存活狀況也不同(圖1、圖2)。

Fig. 1 Photomicrograph of rat alveolar macrophages(AMs)after incubation for 8 h with the ambient PM2.5 in vitro under different temperatures( ×40) A: 18℃； B: 24℃； C: 30℃； D: 37℃； E: 43℃

Fig. 2 Photomicrograph of rat alveolar macrophages(AMs)after incubation for 8 h with the ambient PM2.5 in vitro under different dose( ×40) A: 100 μg/ml； B: 50 μg/ml； C: 25 μg/ml； D: 0 μg/ml

2.2 不同溫度與不同濃度PM2.5處理對巨噬細(xì)胞的毒性作用(MTT法)

不同溫度與不同濃度PM2.5處理對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的毒性作用見表1。在不同溫度條件下，高劑量組、中劑量組、低劑量組的平均OD值均顯著低于空白對照組(P<0.05)，其相對細(xì)胞存活率也低于空白對照組；并在18℃組中，各PM2.5處理組的平均OD值均顯著低于37℃組(P<0.05)；在同一溫度下，隨著PM2.5處理濃度的增大，各組的平均OD值逐漸降低，相對細(xì)胞存活率逐漸下降；在相同PM2.5處理劑量下，37℃各組的平均OD值最高，相對細(xì)胞存活率最高，而隨著溫度的變化，不同溫度各組的平均OD值逐漸降低，相對細(xì)胞存活率降低。不同溫度與不同濃度PM2.5處理各組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行的析因分析并未發(fā)現(xiàn)具有顯著的交互作用,但實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，溫度相對于37℃越低、PM2.5濃度越大，對巨噬細(xì)胞造成的毒性作用越強(qiáng)，相對細(xì)胞存活率越低(P<0.05)。

2.3 不同溫度與不同濃度PM2.5處理對巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

檢測巨噬細(xì)胞吞噬功能的結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，18℃、24℃、30℃、43℃組的吞噬功能均顯著低于37℃組(P<0.05)，且溫度與37℃差距越大，其吞噬功能下降越明顯(P<0.05)； 不同濃度PM2.5組間比較顯示，各PM2.5劑量組的吞噬功能均顯著低于空白對照組(P<0.05)，且劑量越高，吞噬功能越差(P<0.05)；交互作用分析未發(fā)現(xiàn)不同溫度刺激與PM2.5之間存在有交互作用，但數(shù)據(jù)顯示溫度與37℃差距越大、PM2.5濃度越大，巨噬細(xì)胞的吞噬功能越差(P<0.05)。

3 討論

流行病學(xué)研究認(rèn)為，不同溫度刺激和大氣顆粒物均會增加呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和死亡率，并且二者共同作用時(shí)的有害效應(yīng)更加顯著。已有體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，低溫刺激和大氣PM2.5染毒對大鼠肺部和系統(tǒng)炎性因子的影響可能存在交互作用[9]。本研究選用大鼠肺泡巨噬細(xì)胞作為研究對象，給予其不同溫度刺激和不同濃度PM2.5處理。結(jié)果表明，PM2.5濃度越大，對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的毒性作用越大，相對細(xì)胞存活率越小，吞噬功能越弱。在不同溫度組間，37℃組巨噬細(xì)胞的毒性作用最小，吞噬功能最大，隨著溫度升高或降低，毒性作用增大，相對細(xì)胞存活率下降，吞噬功能降低。但對這兩因素進(jìn)行交互作用分析后，并沒有發(fā)現(xiàn)不同溫度刺激和PM2.5處理對于大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的顯著交互毒性作用，但其結(jié)果可提示溫度與37℃差距越大、PM2.5濃度越大，巨噬細(xì)胞的吞噬功能越差，對其毒性作用越強(qiáng)。

Tab. 1 Cytotoxicity different temperatures and ambient PM2.5 on rat alveolar macrophages

*P<0.05vs0 μg/ml;##P<0.05vs37℃ group

Tab. 2 Phagocytic activity of rat alveolar macrophages loaded with different temperature and ambient PM2.5

*P<0.05vs0 μg/ml；##P<0.05vs37℃ group

研究發(fā)現(xiàn)直徑小于2.5 μm的大氣顆粒物可以進(jìn)入肺部到達(dá)肺泡，一部分被吸收入血，一部分會被肺泡巨噬細(xì)胞吞噬[14]。本實(shí)驗(yàn)中，PM2.5處理大鼠肺泡巨噬細(xì)胞8 h后，由于大鼠肺泡巨噬細(xì)胞吞噬了PM2.5顆粒，顆粒物在細(xì)胞內(nèi)占據(jù)了一部分空間，巨噬細(xì)胞吞噬其他顆粒物的能力下降。同時(shí)PM2.5的組成和濃度會影響其對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的毒性，其引起細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)的能力也不同[2,15,16]。在本實(shí)驗(yàn)中，選擇了4個(gè)PM2.5劑量組進(jìn)行染毒，結(jié)果具有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系。大氣PM2.5中含有的不同成分會對巨噬細(xì)胞造成毒性作用，其濃度越大，這種作用越明顯。與此同時(shí)，不同溫度也會對細(xì)胞造成損傷：一方面，不同溫度刺激會對細(xì)胞造成直接損傷；另一方面，會使細(xì)胞分泌系統(tǒng)炎癥因子，降低細(xì)胞功能[17]。本實(shí)驗(yàn)中，溫度低于或高于37℃，細(xì)胞存活率和吞噬功能降低，這正反映了這樣的損傷作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示溫度越低或越高及PM2.5濃度越高，吞噬能力越低，其毒性作用越明顯。此外，在同劑量的PM2.5染毒下，溫度與37℃差距越大時(shí)肺泡巨噬細(xì)胞的吞噬能力越低，由此可見低溫或者高溫都能降低巨噬細(xì)胞的吞噬能力，從而增加PM2.5的呼吸系統(tǒng)毒性作用，從而引起或加重呼吸系統(tǒng)疾病。

本實(shí)驗(yàn)通過體外實(shí)驗(yàn)來研究不同溫度刺激和PM2.5處理對于大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的影響，為了更進(jìn)一步的探討兩者對巨噬細(xì)胞作用的機(jī)制，仍需要進(jìn)一步分析不同溫度刺激和PM2.5染毒對巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)的影響；此外，大氣顆粒物的不同成分的毒性作用存在著差異，未來還要通過研究不同的成分對于巨噬細(xì)胞的毒性作用的差異。

綜上所述，不同溫度刺激和大氣PM2.5處理均會對大鼠肺泡巨噬細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，并使其吞噬能力降低，溫度與37℃差距越大、PM2.5濃度越大時(shí)毒性作用越強(qiáng)，并有一定的交互作用。

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Impact of different temperatures and ambient PM2.5 on the cytotoxicity and cytophagocytic function of alveolar macrophages of rat

LUO Bin△, LIU Jiang-tao+, FEI Gao-qiang+, HAN Ting, WANG Li-na, WAN Ya-xiong, ZHANG Kai, WANG Ren-hong

(Institute of Occupational Health and Environmental Health, School of Public Health,Lanzhou University, Lanzhou 730000, China)

Objective: To investigate the interactive effects of different temperatures and ambient PM2.5 on the rat alveolar macrophages. Methods: The rat alveolar macrophages were collected. The cells were exposed in vitro to 18℃, 24℃, 30℃, 37℃ and 43℃ with PM2.5 at the concentrations of 100 μg/ml, 50 μg/ml, 25 μg/ml and 0 μg/ml respectively. The cells were cultured in the different cases for 8 hours, then cytotoxicity was assessed by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide(MTT)reduction assay and phagocytosis function of macrophages was assessed by neutral red absorption test. Results: The relative survival rate and the cytophagocytic function of alveolar macrophages of rats among the different concentration groups decreased significantly (P<0.05) compared with the blank control group. Both were dose-dependent. The 37℃ group had the highest level of relative survival rate and the cytophagocytic function compared with other different temperatures groups. Interactive effect of different temperatures and ambient PM2.5 was not observed. But the lower temperature and the higher PM2.5 concentration group had stronger toxicity to alveolar macrophages. Conclusion: The results suggested that different temperatures and ambient PM2.5 have cytotoxicity on alveolar macrophages，injuring the phagocytosis. The two factors had some interaction.

different temperatures; ambient PM2.5; cytotoxicity; cytophagocytic; macrophages

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(41405108)；蘭州大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(lzujbky-2015-181)；蘭州大學(xué)“本科教學(xué)工程”國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(201510730159)

2016-03-14 【修回日期】2016-10-26

R122

A

1000-6834(2017)01-071-05

△【通訊作者】Tel: 13919783313; E-mail: luob@lzu.edu.cn;+： 共同第一作者