計 紅, 馬 莉, 張偉宏, 李 悅， 連 帥， 郭文晉， 袁建斌, 郭景茹, 劉艷芝, 甄 莉, 楊煥民

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué), 大慶 163319)

籽鵝不同等級卵泡生殖相關(guān)激素受體基因的表達*

計 紅, 馬 莉, 張偉宏, 李 悅， 連 帥， 郭文晉， 袁建斌, 郭景茹, 劉艷芝, 甄 莉, 楊煥民△

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué), 大慶 163319)

目的：檢測籽鵝不同等級卵泡不同生殖相關(guān)激素受體mRNA的表達。方法：選用1只8月齡產(chǎn)蛋期籽鵝，處死后分離各級別卵泡(F1、F2、F3、F4、F5、SYF、LWF)，采用實時熒光定量PCR方法檢測促卵泡激素受體(FSHR)、促黃體生成素受體(LHR)、雌激素受體α(ERα)、雌激素受體β(ERβ)、生長激素受體(GHR)和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1(IGFBP-1)6種生殖相關(guān)激素受體mRNA的表達量變化。結(jié)果：SYF和LWF中LHR、GHR和IFGBP-1 mRNA表達量較低，而F1-F5級卵泡中表達量較高；SYF和LWF中ERβ mRNA表達量較高，而等級卵泡中表達量較低。結(jié)論：本實驗研究了不同等級卵泡FSHR、LHR、ERα、ERβ、GHR和IGFBP-1 mRNA的變化規(guī)律，為研究禽類產(chǎn)蛋機制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

籽鵝；卵泡；激素受體；表達量

Zi-goose; follicle; hormone receptor; expression

【DOI】 10.12047/j.cjap.5328.2017.014

禽類卵泡的最大特點是很快地從未成熟卵泡變?yōu)槌墒炻雅?，并且呈現(xiàn)明顯的等級。性成熟開始后，禽類卵巢重量不斷地增加。性成熟后，卵巢體積非常大，卵巢上存在大量發(fā)育中的卵泡。卵巢皮質(zhì)含有5～6個體積依次增大的成熟卵泡和一些小卵泡。成熟母雞的卵巢通常包含4～6個按等級順序排列體積依次變小的黃色的排卵期前卵泡(F1、F2、F3、F4、F5、F6)，很多等級前卵泡(小黃卵泡，大白卵泡和小白卵泡)和幾個排卵后卵泡。這些小卵泡還沒有進入卵泡等級庫，根據(jù)尺寸對其進行劃分，直徑小于1 mm的稱為小白卵泡(small white follicle，SWF)，直徑在2～4 mm稱為大白卵泡(large white follicle，LWF)，直徑在5～10 mm的稱為小黃卵泡(small yellow follicle，SYF)[1]。

卵泡的發(fā)育受到多種因素的影響，尤其是下丘腦-腺垂體-性腺軸激素如促卵泡激素(follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH)和促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)等。這些激素若要發(fā)揮調(diào)控卵泡發(fā)育的作用，就必須與卵泡相關(guān)的激素受體結(jié)合，進而引發(fā)相關(guān)調(diào)控反應(yīng)。籽鵝是東北地區(qū)的優(yōu)良地方品種，也是世界上產(chǎn)蛋量最高的鵝品種之一。因此本研究采集產(chǎn)蛋期籽鵝不同等級卵泡，通過實時熒光定量PCR檢測籽鵝不同等級卵泡生殖相關(guān)激素受體促卵泡激素受體(follicle stimulating hormone receptor，F(xiàn)SHR)、促黃體生成素受體(luteinizing hormone receptor，LHR)、雌激素受體α(estrogen receptor alpha，ERα)、雌激素受體β(estrogen receptor beta，ERβ)、生長激素受體(growth hormone receptor，GHR)和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein-1，IGFBP-1) mRNA的表達量，為研究禽類生殖生理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用一只8月齡產(chǎn)蛋期籽鵝，體重4 kg，處死后分離各級別卵泡(F1、F2、F3、F4、F5、SYF、LWF)，將卵黃沖洗干凈，保留卵泡壁，置于液氮中待用。

1.2 目的基因片段擴增

Trizol法提取各樣品總RNA，電泳和核酸定量儀檢測RNA質(zhì)量。提取的RNA達到實驗要求后，將其反轉(zhuǎn)為cDNA。參考NCBI上注冊發(fā)表的原雞、綠頭鴨等多種禽類GAPDH(內(nèi)參)、FSHR、LHR、ERα、ERβ、GHR和IGFBP-1核苷酸序列，設(shè)計相應(yīng)基因的引物。引物均由上海生工合成(表1)。將反轉(zhuǎn)錄cDNA作為模板，分別擴增獲得目的基因片段。將PCR產(chǎn)物進行膠回收、連接、轉(zhuǎn)化及測序鑒定。

Tab. 1 Parameters of primer pairs for the target genes and the PCR products

GenePrimer(5'-3')Productsize/(bp)GAPDHF:GCTGATGCTCCCATGTTCGTGATR:GTGGTGCAAGAGGCATTGCTGAC86FSHRF:TCCTGTGCTAACCCTTTCCTCTAR:AACCAGTGAATAAATAGTCCCATC207LHRF:GTAACACTGGAATAAGGGAATR:GAAGGCTTGACTGTGGATA191ERαF:ACCCAAACAGACCATTCAACGAAR:CGCCAGACTAAGCCAATCATCAG187ERβF:AAGTGGGAATGATGAAATGTGGCR:GGACTGACCGTGCTGAGGAGAAT163GHRF:GCCCCTGCTGACATTTGAGAATR:GGCCACTGCAGAAGATCATCAC115IGFBP-1F:CCTTGTCAGAAGGAGCTCTAR:CATCCAGTGAAGTTTCACACT145

GAPDH： Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase； FSHR： Follicle stimulating hormone receptor； LHR： Luteinizing hormone receptor； ERα： Estrogen receptor alpha； ERβ： Estrogen receptor beta； GHR： Growth hormone receptor； IGFBP-1： Insulin-like growth factor binding protein-1

1.3 基因表達量檢測

提取各樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將前期實驗保存的GAPDH和各基因質(zhì)粒進行梯度稀釋，采用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線對各基因進行定量檢測。

熒光定量PCR反應(yīng)條件分別為：FSHR、ERα、ERβ、IGFBP-1、GHR基因：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。LHR基因：95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s，52℃ 30 s，72℃ 20 s，40個循環(huán)。

熒光定量PCR擴增體系：模板cDNA 0.5 μl，P1 (10 μmol/L) 0.5 μl，P2 (10 μmol/L) 0.5 μl，SYBRPremix Ex TaqTM(2×)，12.5 μl，ddH2O 11.0 μl，總體積 25.0 μl。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，采用ANOVA對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR擴增目的片段

分別用所設(shè)計的引物擴增出FSHR(207 bp)、LHR(191 bp)、ERα(187 bp)、ERβ(163 bp)、GHR(115 bp)及IGFBP-1(145 bp)的基因產(chǎn)物，經(jīng)凝膠電泳的結(jié)果如圖1。

Fig. 1 PCR products of gene

M： DL2000； A： FSHR; B： LHR; C： ERα; D： ERβ; E： GHR; F： IGFBP-1

將FSHR、LHR、ERα、ERβ、GHR與IGFBP-1基因擴增片段的測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫上其他物種相應(yīng)基因進行比對。籽鵝與綠頭鴨基因同源性比對結(jié)果如下： FSHR為99%；LHR為99%；ERα為99%；ERβ為98%；GHR為99%；IGFBP-1為 97%。比對結(jié)果顯示上述基因都有很高的同源性，確定所擴增片段為目的基因，可進行下一步實驗。

2.2 生殖相關(guān)激素受體表達量

經(jīng)過熒光定量PCR檢測，不同等級卵泡生殖相關(guān)激素受體FSHR、LHR、ERα、ERβ、GHR與IGFBP-1 mRNA表達量結(jié)果如表2。

與F1級相比， F2、F3、F5級卵泡FSHR mRNA表達量差異極顯著(P<0.01)。與F2級相比，其他各級卵泡FSHR mRNA表達量差異顯著(P<0.01)。與F3級相比，F(xiàn)5級卵泡FSHR mRNA表達量差異不顯著，其他級別卵泡FSHR mRNA表達量差異極顯著(P<0.01)。F4與F1、SYF、LWF中FSHR mRNA表達量差異不顯著，與其他各組之間差異極顯著(P<0.01)。F5與除F3級卵泡以外的其他各級卵泡FSHR mRNA表達量均差異極顯著(P<0.01)。SYF與F1、F4、LWF級卵泡FSHR mRNA表達量異不顯著。

SYF和LWF中LHR mRNA表達量最低，F(xiàn)5級卵泡LHR mRNA表達量最高。F1與F2級卵泡LHR mRNA表達量差異不顯著，其他不同等級卵泡LHR mRNA表達量差異極顯著(P<0.01)。

F1到F3級卵泡ERα mRNA表達量逐漸升高，而后波動降低至LWF。F3級卵泡ERα mRNA表達量最高，F(xiàn)1級卵泡表達量最低。不同等級卵泡ERα mRNA表達量差異極顯著(P<0.01)。

F1與F3、F4級卵泡ERβ mRNA表達量差異不顯著，與其他各組差異極顯著(P<0.01)。F2與除F5級卵泡以外的其他各組ERβ mRNA表達量差異極顯著(P<0.01)。F3與F1、F4級卵泡ERβ mRNA表達量差異不顯著，與F5差異顯著(P<0.05)，與其他各組差異極顯著(P<0.01)。F4與F5 ERβ mRNA表達量差異顯著(P<0.05)，與F2、SYF及LWF差異極顯著(P<0.01)。F5與與SYF及LWF ERβ mRNA表達量差異極顯著(P<0.01)。SYF、LWF與其他各組ERβ mRNA表達量差異極顯著(P<0.01)。

F1與SYF級卵泡GHR mRNA表達量差異顯著(P<0.05)，與其他各組差異極顯著(P<0.01)。F2與其他各級卵泡GHR mRNA表達量差異極顯著(P<0.01)。F3與除F5級卵泡以外的其他各組GHR mRNA表達量差異極顯著(P<0.01)。F4與其他各級卵泡GHR mRNA表達量差異極顯著(P<0.01)。F5與除F3級卵泡以外的其他各組GHR mRNA表達量差異極顯著(P<0.01)。SYF與LWF中GHR mRNA表達量差異不顯著，與F1級卵泡差異顯著(P<0.05)，與其他各組差異極顯著(P<0.01)。

F1與F2、SYF和LWF中IGFBP-1 mRNA表達量差異不顯著，與其他各級卵泡差異極顯著(P<0.01)。F2與F1、SYF和LWF中IGFBP-1 mRNA表達量差異不顯著，與其他各級卵泡差異極顯著(P<0.01)。F3、F4、F5與其他各級卵泡IGFBP-1 mRNA表達量差異極顯著(P<0.01)。SYF與F1、F2和LWF中IGFBP-1 mRNA表達量差異不顯著，與其他各級卵泡差異極顯著(P<0.01)。

FSHRLHRERαERβGHRIGFBP-1F11.00±0.251.00±0.011.00±0.041.00±0.011.00±0.161.00±0.00F21.58±0.06**1.07±0.02**5.19±0.05**2.65±0.08**3.23±0.25**1.24±0.07F32.11±0.19**##0.71±0.19**10.08±1.15##1.09±0.03##1.92±0.12**##20.84±1.79**##F40.92±0.12##△△1.76±0.10**7.37±0.65△△0.98±0.07##1.59±0.10**##△△6.87±1.49**##F52.09±0.27**##▲▲3.06±0.05**6.38±0.10▲▲2.00±0.50*△▲1.99±0.07**##▲▲4.88±0.64**##SYF1.23±0.10##△△○○0.22±0.09**6.43±0.11○○7.20±0.40**##△△○○0.74±0.11*##△△▲▲○○0.23±0.12△△▲▲○○LWF0.82±0.13##△△○○0.04±0.02**1.95±0.05○○14.75±0.77**##△△○○0.56±0.16*##△△▲▲○○0.36±0.13△△▲▲○○

FSHR： Follicle stimulating hormone receptor； LHR： Luteinizing hormone receptor； ERα： Estrogen receptor alpha； ERβ： Estrogen receptor beta； GHR： Growth hormone receptor； IGFBP-1： Insulin-like growth factor binding protein-1； SYF： Small yellow follicle； LWF： Large white follicle

*P<0.05，**P<0.01vsF1 group;###P<0.01vsF2 group;#△P<0.05，△△P<0.01vsF3 group;#▲P<0.05，▲▲P<0.01vsF4 group;#○○P<0.01vsF5 group

3 討論

FSH和LH是下丘腦-腺垂體-性腺軸上不可或缺的一部分，它們參與調(diào)控類固醇激素的合成和配子產(chǎn)生。雌性哺乳動物卵泡內(nèi)膜細(xì)胞在LH作用下產(chǎn)生的雄烯二酮和睪酮，通過擴散進入顆粒細(xì)胞，顆粒細(xì)胞在FSH作用下使芳香化酶活性增強，進而使雄烯二酮轉(zhuǎn)變?yōu)榇仆?，睪酮轉(zhuǎn)變?yōu)榇贫糩2]，進而調(diào)控生殖系統(tǒng)。張靜等研究也表明，F(xiàn)SH具有較強的上調(diào)竇前期的顆粒細(xì)胞端粒酶活性的作用[3]。腺垂體分泌FSH和LH后，二者可結(jié)合相應(yīng)受體完成信息傳遞功能。

周等研究表明紹鴨各級卵泡(F1、F3、F5和LWF)顆粒層FSHR表達量之間差異不顯著。Liu等對雞卵巢卵泡進行研究，發(fā)現(xiàn)LWF、SYF到F5級卵泡FSHR表達量逐漸升高，F(xiàn)5級最高；然后逐漸下降到F1級卵泡[2]，提示FSHR的在不同等級卵泡的表達差異可能與促性腺激素對禽類卵泡的調(diào)節(jié)尤其是等級卵泡的選擇有重要關(guān)系。上述結(jié)果提示，禽類FSH與較小排卵前卵泡SYF和FSHR結(jié)合，主要是促進小卵泡迅速生長發(fā)育，細(xì)胞快速增殖；與大卵泡結(jié)合，可能是與其他激素協(xié)同作用，抑制未成熟卵泡的排卵，因此F1級卵泡FSHR表達量最低，以減少對FSH的反應(yīng)性，從而促進排卵的發(fā)生。

LH是禽類卵泡發(fā)育和排卵非常重要的激素。在卵泡臨近成熟時，孕酮增加，促使LH達到峰殖，引起排卵。Liu等[4]對雞卵泡LHR基因表達量進行研究，發(fā)現(xiàn)雞LWF到SYF中LHR mRNA表達量升高，F(xiàn)5級卵泡迅速下降，然后逐漸升高至F1級卵泡達到最高。周等研究顯示從小卵泡到F1級卵泡顆粒細(xì)胞層LHR mRNA是逐漸增高，但是膜層沒有顯著變化[5]。本實驗中，LHR mRNA表達量在F5級卵泡最高，與一些學(xué)者的研究結(jié)果不完全一致。但總體上籽鵝等級卵泡LHR表達量顯著高于等級前卵泡，提示LH對禽類卵泡的作用主要是與等級卵泡LHR結(jié)合，進而促進卵泡細(xì)胞增殖和排卵。

雌激素受體的兩種亞型ERα和ERβ，目前已知卵巢中ERβ的表達量高于ERα，屬于優(yōu)勢表達的雌激素受體。本實驗結(jié)果顯示從LWF到F3級卵泡ERα mRNA表達量逐漸升高，F(xiàn)2、F1級卵泡表達量降低，提示ERα可能部分介導(dǎo)雌激素在卵泡生長發(fā)育中的作用。Couse等研究發(fā)現(xiàn)，雌激素可與ERβ結(jié)合使FSH發(fā)揮促進顆粒細(xì)胞分化的作用，且ERβ缺失鼠排卵前卵泡存在結(jié)構(gòu)缺陷[6]，這些都提示ERβ對于雌激素發(fā)揮功能非常重要。等級前卵泡ERβ mRNA表達量較高，而等級卵泡ERβ表達量低，這提示雌激素作用到等級前卵泡時可能主要與ERβ結(jié)合，在等級卵泡的選擇中發(fā)揮作用。此外，我們也發(fā)現(xiàn)在最大排卵前卵泡(F1級卵泡)雌激素兩種受體表達量都非常低，這與禽類排卵前的雌激素分泌水平一致。

生長激素可以影響卵母細(xì)胞成熟，增加卵泡生成過程中對促性腺激素應(yīng)答的受體表達量[5]。資料顯示，GHR缺陷鼠排卵率和竇卵泡數(shù)量降低，閉鎖卵泡數(shù)量增加，說明GH對卵巢可能具有直接作用；與切除卵巢鼠再進行雌激素誘導(dǎo)相比較，GHR基因敲除鼠血液指標(biāo)對促性腺激素LH的反應(yīng)性下降[7]，這也提示GHR在細(xì)胞對LH的反應(yīng)性方面具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2級卵泡GHR mRNA表達量最高，LHR表達量也最高，這與Sirotkin和Chandrashekar等的研究結(jié)果一致。而資料顯示的GHR缺陷的鼠閉鎖卵泡數(shù)量增加，本研究中發(fā)現(xiàn)SYF和LWF中GHR表達量相對較低，這與禽類在小卵泡發(fā)育階段細(xì)胞凋亡率較高，而到等級卵泡階段凋亡率較低的現(xiàn)象一致。

盡管研究顯示GH對卵巢可能具有直接作用[8]，但是較多研究仍顯示GH對卵巢的作用更多是間接的，主要是通過IGF-1進行作用。IGF-1能參與調(diào)節(jié)雞等級前卵泡正常啟動、生長、發(fā)育、優(yōu)勢卵泡選擇、排卵等活動，IGFBP-1則主要與IGF結(jié)合進而調(diào)節(jié)IGF的功能[9]。對體外培養(yǎng)的牛卵泡顆粒細(xì)胞進行實驗，發(fā)現(xiàn)IGF-1可以劑量依賴式的增加顆粒細(xì)胞DNA含量，但是這種作用可以被IGFBP-1抑制[10]。本實驗中SYF和LWF中IGFBP-1表達量非常低，提示其對IGF-1的抑制作用影響較小，也說明等級前卵泡快速增殖階段IGF-1也發(fā)揮了較大的作用，這與Zaczek等的研究結(jié)果一致。而賈等研究表明，IGF-I能顯著提高等級前SYF顆粒層和膜層的厚度以及細(xì)胞密度，這與本實驗等級前卵泡IGFBP-1表達量低是一致的[11]。F5到F3級卵泡IGFBP-1表達量較高，說明其對IGF-1的抑制作用增強，但是F5到F3級卵泡顆粒細(xì)胞層厚度逐漸增加，這與IGFBP-1的高表達是不一致的，這可能是由于等級卵泡顆粒細(xì)胞的增殖受到多種因素調(diào)節(jié)，IGFBP-1在等級卵泡顆粒細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)中并未起到主要作用或者IGFBP-1對等級卵泡有其他途徑的作用，具體原因有待于深入研究。

本研究建了不同等級卵泡生殖相關(guān)激素受體FSHR、LHR、ERα、ERβ、GHR、IGFBP-1 mRNA表達量的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為研究禽類產(chǎn)蛋機制奠定基礎(chǔ)。

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國家自然科學(xué)基金項目資助(31302052)；黑龍江省自然科學(xué)基金項目(C180103)

2015-07-07 【修回日期】2016-06-28

S83

A

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