宋雪皎 李 巖 張春慶

(作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，泰安 271018)

非損傷微測技術(shù)及其應(yīng)用

宋雪皎 李 巖*張春慶*

(作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，泰安 271018)

非損傷微測技術(shù)(Non-invasive Micro-test Technique，NMT)是用來測量和研究生命體外微環(huán)境中離子/分子流的一種技術(shù)。該技術(shù)利用選擇性電極，在不接觸被測樣品的情況下，即在保證被測樣品完整性和近似實(shí)際生理環(huán)境狀態(tài)下，對進(jìn)出樣品的各種離子/分子流進(jìn)行三維、實(shí)時、動態(tài)的測量，從而獲得離子/分子流的濃度、流速和運(yùn)動方向信息，是生理和分子機(jī)理研究的有力工具。本文就NMT技術(shù)的原理、特點(diǎn)、應(yīng)用領(lǐng)域等方面進(jìn)行了較為詳細(xì)的綜述。

非損傷微測技術(shù) 跨膜流動 離子/分子流

非損傷微測技術(shù)(Non-invasive Micro-test Technique，NMT)起源于美國海洋生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，由神經(jīng)科學(xué)家Jaffe發(fā)明，1990年正式問世，是用來測量和研究生命體外微環(huán)境中離子/分子流的一種技術(shù)。該技術(shù)涵蓋包括掃描離子選擇性電極技術(shù)(Scanning Ion-selective Electrode Technique，SIET)、微電極離子流技術(shù)(Microelectrode ion flux estimation technique，MIFE)等在內(nèi)的多種微電極技術(shù)。該技術(shù)依托由計(jì)算機(jī)以及顯微成像、屏蔽防震、信號采集、視頻轉(zhuǎn)換和精密運(yùn)動控制等設(shè)備組成的一整套NMT系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)，并以其特有的時間和空間高分辨率，可以更加全面、直接和方便地獲取離子/分子流信息，對現(xiàn)有的電生理技術(shù)(如膜片鉗技術(shù))做出了重要補(bǔ)充，是鑒定或驗(yàn)證某些生物膜運(yùn)輸系統(tǒng)功能的有力工具。

1 NMT技術(shù)原理

1.1 測試原理

NMT技術(shù)以Fick第一擴(kuò)散定律為基礎(chǔ)，通過前端灌充液體離子交換劑(liquid ion exchanger, LIX)的離子選擇性電極和極譜分子電極分別實(shí)現(xiàn)待測離子和分子的選擇性測定。圖1以測量進(jìn)出根尖的Cd2+為例來說明NMT技術(shù)測試原理[1，2]。選擇性電極在待測Cd2+濃度梯度中以已知距離dx進(jìn)行兩點(diǎn)測量，獲得電壓V1和V2。兩點(diǎn)間的濃度差dc可通過V1和V2和已知的該電極的電壓濃度校正曲線和Nernst方程計(jì)算獲得，將它們帶入Fick第一擴(kuò)散定律公式J0=-D(dc/dx) (其中，D為擴(kuò)散常數(shù))可計(jì)算獲得Cd2+跨膜流動的速度和方向。

1.2 電學(xué)工作原理

NMT技術(shù)通過測定進(jìn)出樣品離子/分子產(chǎn)生的電壓值/電流值，從而獲得兩點(diǎn)間的濃度差dc。因此電學(xué)原理是整個NMT系統(tǒng)的工作基礎(chǔ)。選擇性電極進(jìn)行檢測時，檢測信號首先輸入到前置放大器，經(jīng)由信號處理器到達(dá)數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，由微測軟件iFluxes進(jìn)行數(shù)據(jù)的記錄、顯示和處理，且可以多通道顯示和分析記錄的數(shù)據(jù)；同時，測量過程中iFluxes軟件通過數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)與顯微成像裝置連接，可在測試過程中對被測材料和離子/分子選擇電極進(jìn)行實(shí)時圖像的捕捉和監(jiān)控(圖1)；另外，測量過程中iFluxes軟件與運(yùn)動控制器連接，運(yùn)動控制器與位移傳遞架上的驅(qū)動器連接，通過驅(qū)動器實(shí)現(xiàn)對離子/分子選擇電極的三維運(yùn)動控制(圖2)。

圖1 NMT技術(shù)原理(以測量進(jìn)出根尖的Cd2+為例)[2]

圖2 NMT系統(tǒng)工作流程

2 NMT技術(shù)特點(diǎn)

NMT技術(shù)的特色與優(yōu)勢詳見表1。首先，NMT技術(shù)保證了生物樣品的完整性和生理活性。NMT技術(shù)通過計(jì)算機(jī)控制選擇性微電極，在近似被測樣品實(shí)際生理?xiàng)l件的液體環(huán)境中，在其周圍進(jìn)行三維運(yùn)動測量，對樣品組織或細(xì)胞內(nèi)部生理活動未造成任何干擾和破壞。其次，NMT技術(shù)具有較高的時間、空間分辨率及測量靈敏度，其對離子和分子的空間分辨率分別可達(dá)0.5μm和2μm，可準(zhǔn)確測量離子/分子在特定位點(diǎn)上的運(yùn)動方向、速率大小以及濃度；可在0.3s檢測到一個樣品的信號，系統(tǒng)軟件可在3.5～5s記錄一個數(shù)值。另外，該技術(shù)可測量同一離子/分子進(jìn)出生物樣品的多個部位，也可同時測量多種離子和分子。Xu等應(yīng)用NMT技術(shù)同時測量麝香百合(Lilium longiflorum)花粉管周圍的H+和O2流速，明確了在花粉管生長過程中二者關(guān)系[3]。

當(dāng)然，該技術(shù)也存在不足，實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)離子選擇性電極和極譜分子電極的校正較難。此外，離子選擇性微電極在測試過程中極易發(fā)生電極尖端LIX泄露、尖端留有氣泡、尖端損壞等異常情況，一旦發(fā)生，都需要重新制作微電極。

3 NMT技術(shù)的應(yīng)用

經(jīng)過二十多年的發(fā)展，NMT技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物學(xué)、動物醫(yī)學(xué)、微生物學(xué)和環(huán)境科學(xué)等眾多領(lǐng)域的基礎(chǔ)性研究，應(yīng)用情況見表2。

表1 NMT技術(shù)的特色與優(yōu)勢

續(xù)上表2

在生態(tài)環(huán)境領(lǐng)域， Xu等利用NMT技術(shù)測定了龍葵(Solanum nigrum)和水茄(Solanum torvum)根部對重金屬Cd2+的吸收，為探索植物對重金屬的耐受性、超富集特性及保持體內(nèi)平衡的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)[24]。Sun等應(yīng)用NMT技術(shù)測量耐鹽和敏感型白楊品種根部及原生質(zhì)體上的H+、Na+和Cl-的流量，揭示了生長在高鹽漬化土壤中白楊的耐鹽機(jī)理[25]。Sanchez等發(fā)現(xiàn)在微量有機(jī)污染物作用下，魚類胚胎的O2內(nèi)流速度發(fā)生顯著變化，可通過檢測魚胚胎O2內(nèi)流速度判斷有機(jī)物污染情況，實(shí)現(xiàn)對水體環(huán)境的監(jiān)測預(yù)警[26]。

4 結(jié)束語

NMT技術(shù)以生物活體材料跨膜流動的離子/分子流速為測定指標(biāo)進(jìn)行生理功能研究，應(yīng)用領(lǐng)域越來越廣泛，如在神經(jīng)元細(xì)胞研究、藥物篩選和藥效評價以及腫瘤、癌細(xì)胞等疾病個體化治療的動物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在綠色農(nóng)業(yè)高產(chǎn)節(jié)肥作物選育的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域、在突發(fā)環(huán)境災(zāi)害預(yù)警的生態(tài)環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域，在能夠極大提高人民生活質(zhì)量的水安全、食品安全和空氣安全等民生領(lǐng)域都將具有廣闊的應(yīng)用前景。

NMT技術(shù)以其非損傷性、高時間和空間分辨率等特有的技術(shù)優(yōu)勢和提供最直觀、最實(shí)時、最真實(shí)數(shù)據(jù)的測量特點(diǎn)，可與膜片鉗技術(shù)、激光共聚焦技術(shù)、顯微注射技術(shù)、活體成像等技術(shù)的相結(jié)合，在細(xì)胞內(nèi)外生物信息傳導(dǎo)方面將具有重要的應(yīng)用。此外，隨著功能基因組學(xué)的迅猛發(fā)展，基因功能的研究由對單一基因的研究轉(zhuǎn)向大規(guī)模、批量分析， NMT技術(shù)在重要基因功能研究方面也必將得到廣泛應(yīng)用。

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Non-invasive micro-test technique and its application.

Song Xuejiao, Li Yan*, Zhang Chunqing*

(State Key Laboratory of Crop Biology, College of Agronomy, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China)

Non-invasive micro-test technique (NMT) is a technique which is used to measure the flux of ions or molecules in the micro-environment outside of the life body. This technique uses selective electrode to measure the influx and efflux of ions or molecules without touching the samples in three-dimensions, real time and dynamic way, and the concentration, flow velocity and directions of ions or molecules are acquired. This technique is a powerful tool in studying physiological and molecular mechanism. This paper summarizes the principles, characteristics and application fields of NMT.

non-invasive micro-test technique; transmembrane flow; ion/molecular flow

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：31101160、31271808);山東省博士后創(chuàng)新項(xiàng)目專項(xiàng)資金(編號：201102038)

宋雪皎，女，實(shí)驗(yàn)師，1977年出生，主要從事作物生理學(xué)方面研究，E-mail: xuejiao500@sohu.com。

李巖，副教授，主要從事種子科學(xué)與技術(shù)方面研究，E-mail: liyan5011@163.com。張春慶，教授，主要從事種子科學(xué)與技術(shù)方面研究，E-mail: cqzhang@sdau.edu.cn。

10.3936/j.issn.1001-232x.2017.02.016

2016-10-13