王 丹 于金倩 鄭振佳 宋祥云 王岱杰 王 曉*

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 泰安 271018；2. 山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省分析測(cè)試中心，濟(jì)南 250014)

梯度逆流色譜分離純化雪菊中的3, 5-二咖啡?？鼘幩岷蛫W卡寧

王 丹1, 2于金倩2鄭振佳1宋祥云2王岱杰2王 曉2*

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院， 泰安 271018；2. 山東省中藥質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省分析測(cè)試中心，濟(jì)南 250014)

采用梯度逆流色譜技術(shù)快速分離純化雪菊中的3, 5-二咖啡?？鼘幩岷蛫W卡寧，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(2∶8∶2∶8, 2∶8∶4∶6 ; v/v)為溶劑系統(tǒng)，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，轉(zhuǎn)速800 r/min，流速5.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。所得餾分通過電噴霧電離(ESI)質(zhì)譜和核磁共振譜(NMR)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。從200 mg粗提物中一次分離得到兩個(gè)主要化合物：3, 5-二咖啡?？鼘幩?11.2 mg)和奧卡寧(10.7 mg)，且3, 5-二咖啡?？鼘幩釣槭状螐难┚罩蟹蛛x得到；經(jīng)高效液相色譜法分析，其純度分別為92.82%和97.55%。研究結(jié)果表明，應(yīng)用梯度逆流色譜分離雪菊中的生物活性成分快速高效。

雪菊 逆流色譜 梯度洗脫 3, 5-二咖啡?？鼘幩?奧卡寧

雪菊(Coreopsistinctoria)是菊科金雞菊屬一年生草本植物，主要分布于新疆和田地區(qū)海拔2300～3000 m的昆侖山區(qū)，具有治療燥熱、高血壓、心慌、胃腸不適、食欲不振、痢疾及瘡癤腫毒的作用[1]，現(xiàn)今已經(jīng)作為一種茶飲普及?，F(xiàn)代藥理研究表明雪菊主要有抗炎、降脂[2]、降壓[3]、降糖[4，5]、抗氧化[6-8]、抗病毒等活性[1]。雪菊中有效成分的提取、分離研究多集中于黃酮類化合物[9，10]和苯丙素類化合物[11，12]。傳統(tǒng)的分離方法包括大孔吸附樹脂、反相色譜柱、葡萄糖凝膠LH-20和聚酰胺柱色譜法[9,13]等。這些方法制備時(shí)間長(zhǎng)、溶劑消耗大，且會(huì)產(chǎn)生死吸附，導(dǎo)致樣品損失。高速逆流色譜(HSCCC)是沒有固態(tài)載體的液-液分配色譜，根據(jù)樣品在兩相溶劑中分配系數(shù)的不同實(shí)現(xiàn)樣品的分離，具有分離速度快、樣品吸附低、分離重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于天然藥物成分的分離純化[14]。

梯度洗脫可以使很寬極性范圍內(nèi)的混合組分實(shí)現(xiàn)一次性色譜分離[15]，本研究采用高速逆流色譜儀運(yùn)用梯度洗脫的方式從雪菊乙酸乙酯粗提物中成功分離得到3, 5-二咖啡酰奎寧酸和奧卡寧(結(jié)構(gòu)式如圖1)，建立了高效、方便和快速分離方法，為其他食品中活性成分的分離提供了有效參考。

圖1 雪菊中兩種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

TBE 300C高速逆流色譜儀(上海同田生物技術(shù)有限公司)；Waters2695高效液相色譜系統(tǒng)(配有PDA檢測(cè)器，美國(guó)Waters公司)。

石油醚、乙酸乙酯和甲醇等均為分析純(天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)；水為去離子水；高效液相色譜用甲醇為色譜純(OCEANPAK ALEXATIVE CHEMICAL. , Ltd)；水為娃哈哈純凈水。

雪菊藥材購(gòu)買于山東舜元藥業(yè)有限公司。

1.2 樣品制備

取雪菊藥材500g粉碎，過40目篩，加80%乙醇90℃回流提取兩次(10倍量，2 h；5倍量，1 h)。抽濾后合并濾液，減壓濃縮得乙醇提取物，加500mL水復(fù)溶，依次用等體積的石油醚、乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，經(jīng)減壓濃縮得乙酸乙酯粗提物13.2 g，用于進(jìn)一步分離研究。

1.3 兩相溶劑系統(tǒng)和樣品溶液的制備

HSCCC的溶劑系統(tǒng)為石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水(體系1為2∶8∶2∶8，v/v；體系2為2∶8∶4∶6，v/v)，分別按比例置于分液漏斗中，震蕩后充分靜置使其分層。分取上下相，上相作為固定相，下相作為流動(dòng)相，超聲除去上下相中的氣泡，待用。

取200 mg乙酸乙酯粗提物，加入上述體系1中上下相各5 mL，超聲溶解，用于HSCCC分離。

1.4 分配系數(shù)KD的測(cè)定

取少量樣品置于10 mL試管中，加入5 mL的下相，取5 μL下相溶液利用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定色譜峰面積A1；取溶有樣品的下相2 mL加入等量的上相，劇烈振蕩1 min，使樣品充分溶解，靜置分層，再取5 μL下相溶液用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，其峰面積為A2，分配系數(shù)KD=(A1-A2)/A2。

1.5 分離和鑒定

1.5.1 HSCCC分離

將體系1中已超聲脫氣的固定相以20 mL/min的流速注入高速逆流色譜儀的螺旋管，待上相充滿整個(gè)螺旋管后，緩慢調(diào)節(jié)主機(jī)轉(zhuǎn)速至800 r/min，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，待轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后，以5.0 mL/min的流速泵入流動(dòng)相，同時(shí)開啟檢測(cè)器和記錄儀，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；當(dāng)有流動(dòng)相從出口流出，即螺旋管中的上下相達(dá)到平衡時(shí)，將樣品溶液從進(jìn)樣圈注入到色譜儀中，流動(dòng)相以5.0 mL/min的流速泵入(0～70 min以體系1的下相為流動(dòng)相，70～250 min以體系2的下相為流動(dòng)相)，根據(jù)色譜圖收集各色譜峰餾分。

1.5.2 HPLC分析和結(jié)構(gòu)鑒定

雪菊乙酸乙酯粗提物和HSCCC所分離得到的各組分均用HPLC進(jìn)行分析。色譜柱：RIGOL Compass C18(250×4.0 mm，5 μm)。檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm。流動(dòng)相：甲醇(A)-0.1%甲酸水溶液(B)；梯度洗脫程序?yàn)?～25 min，30%A～35%A；25～26 min，35%A～40%A；26～36 min，40%A～47%A；36～37 min，47%A～64%A；37～42 min，64%A～73%A；42～55 min，73%A～100%A；55～65 min，100%A。流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。HSCCC分離后各組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)根據(jù)ESI-MS和NMR進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 HSCCC分離條件的優(yōu)化

溶劑體系的選擇是HSCCC分離中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，溶劑體系合適與否是由目標(biāo)化合物在其中的KD來衡量的。本實(shí)驗(yàn)利用TLC初步確定目標(biāo)組分在不同溶劑系統(tǒng)中的分配情況，通過HPLC測(cè)定了目標(biāo)化合物在乙酸乙酯-正丁醇-水和石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水等溶劑體系中的KD。結(jié)果表明，當(dāng)采用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水為兩相溶劑體系時(shí)，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的分離。目標(biāo)化合物在不同比例的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水體系中的KD見表1。

由表1可看出石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水的體積比為4∶6∶4∶6時(shí)，兩種化合物的KD差異較小，各組分會(huì)很快被洗脫出來，很難實(shí)現(xiàn)分離；體積比為3∶7∶3∶7和2∶8∶3∶7時(shí)，兩種化合物的KD差異較大，能保證各組分間具有較好的分離度，但同時(shí)B在固定相中的分配較多，若采用這兩種溶劑體系會(huì)使整體的分離時(shí)間過長(zhǎng)，B有可能不出峰，影響分離效率，因此不適合雪菊粗提物中各物質(zhì)的分離純化。在其他實(shí)驗(yàn)參數(shù)相同的條件下，分別應(yīng)用體積比為2∶8∶2∶8(體系1)與2∶8∶4∶6(體系2)的石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水的體系對(duì)雪菊粗提物進(jìn)行分離純化。結(jié)果表明體系1中目標(biāo)組分A的分配系數(shù)較為理想，體系2中目標(biāo)組分B的分配系數(shù)較為理想。

表1 兩種化合物在不同溶劑體系中的KD值

2.2 HSCCC分離純化的結(jié)果

分別單獨(dú)嘗試使用體系1和體系2進(jìn)行高速逆流色譜分離，結(jié)果表明體系1的A分離效果較好，但300min時(shí)B仍未洗脫出來；體系2的A和B很快在130 min內(nèi)洗脫出來，但A的純度較低。為了節(jié)省溶劑，縮短洗脫時(shí)間，又能分離出高純度的化合物，實(shí)驗(yàn)采用如下梯度洗脫方法：0～70 min以體系1的下相為流動(dòng)相，70～250 min以體系2的下相為流動(dòng)相進(jìn)行梯度逆流色譜分離，在260 min內(nèi)A和B完全洗脫出來，其HSCCC分離譜圖見圖2。

本實(shí)驗(yàn)使用梯度逆流色譜從200mg粗提物中一次性分離得到11.2 mg A和10.7 mg B，經(jīng)HPLC分析，其純度分別為92.82%和97.55%。

圖2 雪菊中3, 5-二咖啡?？鼘幩岷蛫W卡寧的HSCCC色譜圖

2.3 HPLC條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)在HPLC分析雪菊乙酸乙酯粗提物過程中，嘗試了用不同比例的乙腈-水、甲醇-水和甲醇-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相，結(jié)果表明：當(dāng)采用甲醇-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相在65min內(nèi)進(jìn)行梯度洗脫，粗提物中的主要組分可以得到良好分離。

根據(jù)1.5.2所述條件，對(duì)雪菊粗提物及HSCCC分離所得2個(gè)餾分進(jìn)行檢測(cè)分析，所得HPLC譜圖見圖3。

圖3 雪菊粗提物及兩個(gè)餾分的HPLC譜圖

2.4 HSCCC分離得到化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

化合物A：ESI-MS，m/z517 [M+H]+；1H-NMR ( DMSO-d6，400 MHz ) δ：1.92～1.98( 2H, m, 2 X H2), 2.10～2.15 (2H, m, 2 X H6), 3.83 (1H, s, H4), 5.13 (1H, d, J =3.6 Hz, H3), 5.22 (1H, d, J = 8.0 Hz, H5), 6.17 (1H, d, J = 15.6 Hz, H8 ), 6.26 (1H, d,J = 16.0 Hz, H8 ), 6.77 (1H, d, J = 4.0 Hz, H5 ), 6.79 (1H, d, J = 4.4 Hz, H5), 7.01(2H, d, J = 8.0 Hz, H6 , H6 ), 7.07 (2H, d, J = 7.6 Hz , H2 , H2 ), 7.44 (1H, s, H7), 7.49 (1H, d, J = 14.4 Hz, H7); 13C NMR( DMSO-d6，400 MHz ) δ：35.1 (C6), 36.0 (C2), 67.9(C3), 71.0 (C4), 71.3 (C5), 72.9 (C1), 114.6 (C8), 115.2 (C2, C2),115.83(C8),116.2 (C5), 116.3 (C5), 121.6 (C6), 121.8 (C6), 126.0 (C1), 126.1 (C1),145.2 (C7), 145.6 (C7), 146.0 (C3 , C3), 148.7 (C4), 148.8 (C4), 166.0 (C9 ),166.5 (C9), 175.7 (C7)，與文獻(xiàn)[16]中報(bào)道的3, 5-二咖啡酰奎寧酸波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物A為3 , 5-二咖啡?？鼘幩?3, 5-dicaffeoylquinic acid)。

化合物B：ESI-MS，m/z287 [M+H]+；1H-NMR( DMSO-d6，400 MHz) δ：7. 69( 1H，s，H-6′) ，7. 67 ( 1H，s，H-α) ，7. 66 ( 1H，s，H-β) ，7. 28( 1H，s，H-2) ，7. 21 ( 1H，d，J=8. 0 Hz ，H-6 ) ，6. 82 ( 1H，d，J=8. 0 Hz ，H-5) ， 6. 44( 1H，d，J = 8. 8 Hz ，H-5') ；13C-NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ：192.42 (C=O)，153.99 (C-2')，153.19 (C-4')，149.41(C-4), 146.13 (C-3), 144.96 (C-β), 132.93(C-3'), 126.70(C-1), 122.79 (C-6), 121.73 (C-6'), 117.8 (C-α), 116.26 (C-1'), 114.33 (C-5), 113.80 (C-2)，108.18 (C-5')，與文獻(xiàn)[17，18]中報(bào)道的奧卡寧波譜數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物B為奧卡寧( okanin)。

3 結(jié)論

HSCCC在天然產(chǎn)物分離純化方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，它相對(duì)于傳統(tǒng)的固-液柱色譜技術(shù)，具有適用范圍廣、操作靈活、高效、快速等優(yōu)點(diǎn)；而且由于被分離物質(zhì)與液態(tài)固定相之間能夠充分接觸，使得樣品的制備量大大提高，是一種理想的制備分離手段。

本研究采用梯度逆流色譜法對(duì)雪菊中的活性成分進(jìn)行分離純化，并建立了雪菊乙酸乙酯提取物中2種單體化合物的分離純化方法。經(jīng)過溶劑體系的選擇，最終應(yīng)用石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水作為兩相溶劑體系進(jìn)行梯度洗脫分離得到了3, 5-二咖啡?？鼘幩岷蛫W卡寧，為進(jìn)一步研究其在雪菊中的藥理作用奠定了基礎(chǔ)。

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Separation and purification of 3, 5-dicaffeoyl quinic acid and okanin fromcoreopsistinctoriaby high-speed counter-current chromatography using stepwise elution.

Wang Dan1, 2, Yu Jinqian2, Zheng Zhenjia1, Song Xiangyun2, Wang Daijie2, Wang Xiao2*

(1. School of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University, Tai＇an 271018, China; 2. Shandong Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Control Technology, Shandong Analysis and Test Center, Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

The extraction conditions were as follows:solvent system: petroleum ether-ethyl acetate-methanol-water (2: 8: 2: 8，2: 8: 4: 6; v/v), rotation speed: 800 r / min , flow speed:5.0 mL/min, detection wavelength:254 nm.The obtained fractions were identified by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS),1H-nuclear magnetic resonance(NMR) and13C-NMR. Two main compounds, 3, 5-dicaffeoyl quinic acid (11.2 mg) and okanin (10.7 mg) were separated from 200 mg crude extract, whose purities were 92.82% and 97.55% and analyzed by HPLC. And 3, 5-dicaffeoyl quinic acid was separated fromCoreopsistinctoriafirstly. Experimental results indicate that the method is rapid and highly efficient.

coreopsistinctoria; counter-current chromatography; stepwise elution; 3, 5-dicaffeoyl quinic acid; okanin

山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2014GZX219003, ZR2016YL006)；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(21506119)

王丹，女，1989年出生，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分離純化。

＊通訊作者：王曉，男，1971年出生，研究員，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分離純化，E-mail: wangx@sdas.org 。

10.3936/j.issn.1001-232x.2017.02.005

2016-11-23