胡建鋒+尹松梅+謝雙鋒

[摘要] 目的 了解丙戊酸對(duì)HL-60/HT細(xì)胞P27Kip1的影響。方法 建立白血病耐藥細(xì)胞株HL-60/HT，MTT法檢查丙戊酸作用前后細(xì)胞增殖情況及對(duì)Ara-c耐藥性的改變，流式細(xì)胞儀檢測(cè)HL-60、HL-60/HT細(xì)胞P27Kip1、P170的表達(dá)。結(jié)果VPA能增加HL-60、HL-60/HT細(xì)胞P27Kip1的表達(dá)水平（P<0.05），而不影響P170的表達(dá)（P>0.05）；Ara-c不能影響HL-60、HL-60/HT細(xì)胞的P27Kip1、P170的表達(dá)（P>0.05）；VPA與Ara-C聯(lián)用能增加HL-60、HL-60/HT細(xì)胞P27Kip1的表達(dá)水平（P<0.05），不影響P170的表達(dá)（P>0.05）。結(jié)論 HL-60/HT細(xì)胞P27Kip1低于HL-60，丙戊酸能增加HL-60/HT細(xì)胞P27Kip1的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 白血??；丙戊酸；HL-60/HT細(xì)胞；耐藥性

[中圖分類號(hào)] R733.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 2095-0616（2017）06-151-04

[Abstract] Objective To understand the impact of valproic acid to expression level of P27Kip1 and P170 of HL-60/HT cells. Methods Leukemia resistant cell line HL-60/HT was established. MIT method was used to deteccell proliferation before and after valproic acid and its changes to drug resistance of Ara-c. Flow cytometry was used to detect the expression of P27Kip1 and P170 of HL-60 and HL-60/HT cells. Results VPA could increase the expression level of P27Kip1 of HL-60 and HL-60/HT cells（P<0.05）. It did affect the expression of P170（P>0.05）. Ara-c could not affect the expression level of P27Kip1 of HL-60 and HL-60/HT cells（P<0.05）. VPA combined with Ara-C can increase the expression level of P27Kip1 of HL-60 and HL-60/HT cells（P<0.05）. It did affect the expression of P170（P>0.05）. Conclusion P27Kip1 of HL-60/HT cells is lower than HL-60 cells. Valproic acid can the expression of P27Kip1 of HL-60/HT cells.

[Key words] Leukemia； Valproic aci； HL-60/HT cell； Drug resistance

近年白血病發(fā)病率有所上升，其治療方法多采用聯(lián)合化療[1]，60%～70%患者經(jīng)治療后癥狀緩解后復(fù)發(fā)。白血病細(xì)胞固有或獲得的多藥耐藥性是在治療過(guò)程中出現(xiàn)失敗的重要原因[2-5]。多耐藥基因mdr-1表達(dá)產(chǎn)物P170起著重要作用。P27Kip1能調(diào)控mdr-1基因的轉(zhuǎn)錄，減少P170表達(dá)，逆轉(zhuǎn)多耐藥細(xì)胞的耐藥性[6-7]。丙戊酸（VPA）是常用的抗癲癇藥物，治療癲癇具有很好的效果，是一種組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）抑制劑，通過(guò)調(diào)節(jié)染色質(zhì)構(gòu)象和轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而影響基因表的的活性藥物。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)丙戊酸能降低HL-60/HT細(xì)胞對(duì)Ara-c的耐藥性[8]，而丙戊酸是否通過(guò)P27Kip1、P170途徑起作用呢？本研究進(jìn)一步分析了丙戊酸對(duì)HL-60、HL-60/HT細(xì)胞P27Kip1、P170表達(dá)的影響。

1 材料與試劑

本研究所需試劑與材料有RPMI1640培養(yǎng)基、二甲基亞砜、四氮唑藍(lán)、VPA、淋巴細(xì)胞分離液、HEPES、羥乙基哌嗪乙磺酸、VCR、HT、Ara-C、HL-60細(xì)胞，均由正規(guī)公司及企業(yè)購(gòu)買。

2 方法

2.1 正常人單個(gè)核細(xì)胞的分離

選擇10名健康的體檢者，取空腹血置肝素抗凝管，加入D-HankS液平鋪于液面上，混勻后離心約20min，離心后試管內(nèi)分為3層，吸取單個(gè)核細(xì)胞層，置另一試管中，加入5倍以上容量的D-HankS液，洗滌細(xì)胞，最后一次離心后去上清液，然后加入PBS緩沖液，重懸細(xì)胞后留用。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及建立耐藥株

將HL-60細(xì)胞接種于RPMI-1640完全培養(yǎng)基上，37℃、5%CO2培養(yǎng)增菌，換液1次/2d，4～5d傳代一次。

采用極限稀釋法篩選耐藥的細(xì)胞克隆。具體方法為：將對(duì)數(shù)期HL-60細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中，建立HL-60/HT耐藥細(xì)胞株。HT濃度為0.005μg/mL，2d后換培養(yǎng)液，清洗，去除藥物，繼續(xù)培養(yǎng)2d。經(jīng)3次初始濃度的培養(yǎng)后，藥物濃度增為原來(lái)的2倍。5個(gè)月后測(cè)定HL-60/HT耐藥細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50），對(duì)多藥耐藥細(xì)胞進(jìn)行確認(rèn)。

2.3 藥物對(duì)兩種細(xì)胞的增殖抑制率

通過(guò)MTT法檢測(cè)Ara-c抑制HL-60/HT、HL-60細(xì)胞的增殖情況。取重懸的細(xì)胞接種于96孔平板，每孔200μL，約20 000個(gè)細(xì)胞，5%CO2、37℃條件下孵育24h，然后加入Ara-C。兩組均有無(wú)培養(yǎng)液和無(wú)藥對(duì)照組。48h后每孔加入20μL濃度為5g/L MTT，繼續(xù)孵育4h后除去培養(yǎng)液，每孔加150μL DMSO，置震蕩儀上振蕩10min，采用酶標(biāo)儀，以無(wú)細(xì)胞組調(diào)零，測(cè)595nm和492nm處的吸光度。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（無(wú)藥對(duì)照組吸光度均值-實(shí)驗(yàn)組吸光度均值）/無(wú)藥對(duì)照組吸光度均值×100%[9]。計(jì)算各種藥物的IC50。

2.4 耐藥的穩(wěn)定性測(cè)定

用無(wú)藥RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HL-60/HT子代細(xì)胞兩個(gè)月，并檢測(cè)對(duì)HT的IC50值，具體方法參照2.3，確定HL-60/HT細(xì)胞耐藥穩(wěn)定性。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定P27Kip1、P170的表達(dá)

設(shè)HL-60和HL-60/HT細(xì)胞組，又各分正常人單個(gè)核細(xì)胞組、藥物（Ara-c、VPA單獨(dú)或聯(lián)合）作用前和作用后。將重懸細(xì)胞的密度調(diào)整為l×l06/mL，取100μL破膜液A加入到50μL細(xì)胞懸液中，并放置于避光的溫室內(nèi)，用2mL PBS緩沖液以1000×g轉(zhuǎn)速離心5min洗滌，棄上清，于細(xì)胞懸液中加入破膜液B 100μL和5μL抗P27Kip1也可以是P170抗體，PBS緩沖液洗滌。加入FITC標(biāo)記二抗5μL，靜置15min后離心洗滌。取1%濃度的多聚甲醛450μL，固定30min，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。將P27Kip1或P170抗體換成PBS即可進(jìn)行空白對(duì)照。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)量數(shù)據(jù)的描述用（）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Ara-c對(duì)HL-60、HL-60/HT細(xì)胞的IC50

Ara-C對(duì)HL-60細(xì)胞的中位抑制濃度是0.20μg/mL，對(duì)HL-60/HT細(xì)胞的中位抑制濃度是0.73μg/mL，耐藥倍數(shù)3.65倍。

3.2 HL-60細(xì)胞耐藥穩(wěn)定性檢測(cè)

HL-60/HT耐藥株傳代后，用無(wú)藥的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)其子代細(xì)胞，測(cè)定其對(duì)HT的IC50，結(jié)果無(wú)明顯改變，細(xì)胞株的耐藥性能穩(wěn)定。

3.3 細(xì)胞表達(dá)P27Kip1、P170水平

正常細(xì)胞、HL-60細(xì)胞及HL-60/HT細(xì)胞中P27Kip1表達(dá)水平依次降低，兩組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；HL-60/HT細(xì)胞的P170表達(dá)水平明顯高于正常細(xì)胞及HL-60細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

3.4 VPA與Ara-c對(duì)不同細(xì)胞P27Kip1、P170表達(dá)水平的影響

HL-60細(xì)胞予1mmol/L VPA、0.2μg/mL Ara-c，HL-60/HT細(xì)胞予1mmol/L VPA、0.7μg/mL Ara-c各培養(yǎng)48h，流式細(xì)胞儀測(cè)定P27Kip1、P170的表達(dá)水平。結(jié)果提示VPA能增加HL-60、HL-60/HT細(xì)胞P27Kip1的表達(dá)水平（P<0.05），但對(duì)P170表達(dá)水平無(wú)顯著影響（P>0.05）；Ara-c對(duì)P27Kip1、P170的表達(dá)水平均無(wú)顯著影響（P>0.05），見(jiàn)表1。

3.5 比較VPA與Ara-c聯(lián)用對(duì)不同細(xì)胞的P27Kip1、P170表達(dá)水平影響

HL-60細(xì)胞用0.20μg/mL Ara-C，1mmol/L VPA共同培養(yǎng)48h，HL-60/HT細(xì)胞用0.70μg/mL Ara-C，1mmol/L VPA共同培養(yǎng)48h，流式細(xì)胞儀測(cè)定P27Kip1、P170的表達(dá)水平。結(jié)果顯示VPA與Ara-C聯(lián)用，能增加敏感HL-60細(xì)胞、耐藥HL-60/HT細(xì)胞P27Kip1的表達(dá)水平（P<0.05），不影響P170的表達(dá)（P>0.05），見(jiàn)表2。進(jìn)一步分析VPA、Ara-c在聯(lián)用用藥中各自對(duì)對(duì)HL-60、HL-60/HT細(xì)胞P27Kip1的影響，結(jié)果提示無(wú)論在HL-60細(xì)胞還是HL-60/HT細(xì)胞，Ara-C對(duì)P27Kip1的表達(dá)水平無(wú)影響（均有P>0.05），VPA單用或聯(lián)用Ara-c均增加P27Kip1的表達(dá)水平（均P<0.05），見(jiàn)表3。

4 討論

白血病是血液病中較為常見(jiàn)的疾病，主要是由于造血干細(xì)胞異?？寺⌒约膊。陙?lái)，隨著免疫學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)的進(jìn)步與發(fā)展，加強(qiáng)了對(duì)白血病患者的診斷，對(duì)白血病的本質(zhì)有了更加深刻的認(rèn)識(shí)。白血病患者的白細(xì)胞形態(tài)學(xué)具有特異性，可以依靠白細(xì)胞的形態(tài)學(xué)直接診斷，非典型白血病發(fā)病原因多樣，癥狀復(fù)雜，很難及時(shí)診斷。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，白血病的漏診率為20%～36%，為此加強(qiáng)細(xì)胞學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)具有重要的診斷意義。

本研究進(jìn)一步分析VPA與P27Kip1、P170的關(guān)系，了解VPA發(fā)揮作用的可能機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤惡性度增加，P27Kip1的表達(dá)逐漸減低[10-12]。本研究也發(fā)現(xiàn)在正常細(xì)胞、HL-60細(xì)胞、HL-60/HT細(xì)胞中，P27Kip1的表達(dá)逐漸減低，提示P27Kip1表達(dá)與細(xì)胞惡性程度、耐藥情況呈負(fù)相關(guān)[13-14]，可以監(jiān)測(cè)P27Kip1的表達(dá)，判斷疾病惡性程度，了解耐藥細(xì)胞的產(chǎn)生，預(yù)測(cè)疾病預(yù)后。結(jié)果提示VPA對(duì)HL-60，HL-60/HT細(xì)胞的P170表達(dá)無(wú)影響，與其他研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[15]，可能和VPA與丁酸鈉、TSA的具體作用機(jī)制不同有關(guān)。VPA不增加白血病細(xì)胞P170的表達(dá)，相比于丁酸鈉、TSA更有希望成為應(yīng)用于臨床的化療增敏劑。

耐藥白血病HL-60/HT、HL-60、P170細(xì)胞P27Kip 1的表達(dá)敏感度存在差異，敏感性最強(qiáng)的為P170，HL-60敏感性最弱，丙戊酸鈉可影響P27Kip 1的表達(dá)，增加G1期細(xì)胞含量，發(fā)揮抗腫瘤活性；同時(shí)，VPA可增強(qiáng)HL-60/HT細(xì)胞對(duì)Ara-C的敏感性，減輕其耐藥性，起到化療增敏的作用。丙戊酸鈉口服、攜帶方便，對(duì)正常細(xì)胞毒性低，具有抗腫瘤活性和增加化療敏感性的作用，可作為治療耐藥白血病輔助藥物。其作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-01-02）