杜英俠++任浩杰++張菊林++付晚濤

摘要 本文用5種分離培養(yǎng)基從大連海域潮間帶采集的2種海綿中分離培養(yǎng)放線菌，以副溶血弧菌、哈維弧菌和鰻弧菌3種海水養(yǎng)殖病原菌為指示菌對放線菌進(jìn)行抑菌活性的篩選，并基于16S rDNA序列對篩選出的抑菌活性較強(qiáng)的海綿放線菌進(jìn)行多樣性分析。結(jié)果表明：從海綿中共分離出57株海綿放線菌，以寡營養(yǎng)的M2培養(yǎng)基分離效果最好。抑菌活性篩選有55株對3株指示菌中的至少1株具有抑菌活性；有11株抑菌活性較強(qiáng)，對3株指示菌均具有抑菌活性，初步鑒定均屬于鏈霉菌屬。由此表明，海綿放線菌多能夠產(chǎn)生對海水養(yǎng)殖病原菌較強(qiáng)的抑菌活性，是天然活性物質(zhì)的重要來源，在海水養(yǎng)殖應(yīng)用方面具有較大的開發(fā)價值。

關(guān)鍵詞 海綿放線菌；抑制弧菌；抑菌活性；多樣性分析

中圖分類號 Q939.13 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）07-0229-03

Isolation of Sponge-associated Actinobacteria and Its Antibacterial Activity Screening

DU Ying-xia 1 REN Hao-jie 1 ZHANG Ju-lin 2 FU Wan-tao 2，3 *

（1 College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian Liaoning 116023； 2 College of Marine Science-Technology and Environment，Dalian Ocean University； 3 Key Laboratory of Nearshore Marine Environmental Science and Technology of Liaoning Province′s University）

Abstract This text isolated actinomycetes from 2 kinds of sponge taken from Dalian ocean intertidal zone with 5 kinds of separation medium.The antibacterial activity of sponge-associated actinobacteria was screened with Vibrio parahaemolyticus，Vibrio harveyi and Vibrio anguillarum as indicator bacteria.The diversity analysis of sponge-associated actinobacteria with strong antibacterial activity was conducted based on 16S rDNA sequence.The study showed that 57 strains in total were isolated from the sponges，and the separation effect of oligo-culture M2 was the best.The result of antibacterial activity screening found that 55 strains had antibacterial effect on at least one of the 3 indicator bacteria.There were 11 strains preliminarily identified as Streptomyces sp. having stronger antibacterial effect on all the 3 indicator bacteria.The results showed that most of the sponge-associated actinobacteria which was an important source of bioactive natural products had quite strong inhibition on mariculture pathogen.It has a great development value in the field of mariculture.

Key words sponge-associated actinobacteria；inhibition of vibrio；antibacterial activity；diversity analysis

隨著陸源微生物資源的開發(fā)難度越來越大，海洋豐富的微生物資源愈發(fā)受到人們的廣泛重視。海洋放線菌因為生存環(huán)境的特殊性，能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、抑菌活性顯著的次級代謝產(chǎn)物[1]。海綿是海洋放線菌最重要的一種共附生生物，其體內(nèi)的微生物可高達(dá)海綿生物量的50%～60%[2-3]，因而是目前尋找新型天然活性化合物的重要途徑之一。近年來，已有不少學(xué)者從海綿中分離獲得具有強(qiáng)抑菌活性的放線菌菌株，在產(chǎn)生抗細(xì)菌、真菌等活性物質(zhì)上具有較大的潛能[4-7]。

我國作為水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，隨著海水養(yǎng)殖行業(yè)的繁榮發(fā)展，由弧菌引起的水產(chǎn)病害仍是人們治療防范的重點(diǎn)。本研究從海綿中分離篩選出3種常見的海水弧菌，即副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、哈維弧菌（Vibrio harveyi）、鰻弧菌（Vibrio anguillarum），三者均屬于具有抑制作用的放線菌。本文通過16S rDNA序列對具有較強(qiáng)抑菌活性的海綿放線菌進(jìn)行分子鑒定，旨在發(fā)現(xiàn)具有海水養(yǎng)殖應(yīng)用價值的海洋放線菌。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 海綿樣品。繁茂膜海綿（Hymeniacidon perlevis）、軟海綿屬海綿（Halichondria sp.）均采自大連黑石礁海域潮間帶，30 min內(nèi)迅速帶回實驗室。

1.1.2 分離培養(yǎng)基。①M(fèi)2培養(yǎng)基：甘油6 mL，精氨酸1 g，K2HPO4·3H2O 1 g，NaCl 20 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 L，pH值自然。②M2′培養(yǎng)基：甘油0.6 mL，精氨酸 0.1 g，K2HPO4·3H2O 1 g，NaCl 20 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 L，pH值自然。③M8′培養(yǎng)基：酪蛋白胨0.02 g，天冬氨酸0.01 g，丙酸銨4 g，K2HPO4·3H2O 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 L，pH值7.0。④RH培養(yǎng)基：棉籽糖1 g，組氨酸0.25 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，NaCl 20 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 L，pH值7.0。⑤GT培養(yǎng)基：甘露糖1 g，胱氨酸0.25 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，NaCl 20 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，CaCO3 0.05 g，瓊脂粉18 g，蒸餾水1 L，pH值7.0。

1.1.3 指示菌。副溶血弧菌、哈維弧菌和鰻弧菌均來自大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 海綿放線菌的分離。用無菌海水浸洗海綿5遍，除去表面附著的雜質(zhì)物，再用無菌研缽研磨成漿，加入無菌海水稀釋10倍[8]后，取100 μL研磨液在不同的分離培養(yǎng)基上進(jìn)行平板涂布，于28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)基中均分別加入15 mg/L萘啶酮酸和50 mg/L重鉻酸鉀[9]抑制細(xì)菌和真菌的生長。

1.2.2 具有抑菌活性的海綿放線菌篩選。將分離純化的放線菌在改良高氏一號培養(yǎng)基[8]上28 ℃培養(yǎng)8～10 d至成熟，采用瓊脂塊法[10]進(jìn)行抑菌活性篩選。用無菌打孔器（直徑10 mm）在長滿放線菌的平板上打孔，將瓊脂塊菌面向下分別置于涂布3種指示菌的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌結(jié)果。

1.2.3 具有抑菌活性的海綿放線菌的多樣性。以抑菌圈直徑（ID）大小為判斷海綿放線菌抑菌活性強(qiáng)弱的指標(biāo)，對篩選出的抑菌活性較強(qiáng)（ID≥15 mm）的海綿放線菌進(jìn)行分子鑒定。將海綿放線菌單菌落接入裝有5 mL滅菌 ISP2液體培養(yǎng)基的15 mL試管中，于30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)2～3 d。收集1 mL培養(yǎng)液，按照TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 試劑盒說明提取放線菌基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，參照信艷娟等[9]的引物F8/R1492的PCR反應(yīng)條件擴(kuò)增16S rDNA片段。擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工進(jìn)行測序，測序結(jié)果在NCBI 的GenBank 進(jìn)行Blast 比對，利用MEGA 5.0軟件中的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 海綿放線菌的分離

利用5種分離培養(yǎng)基從海綿中共分離出57株放線菌，并且選用不同培養(yǎng)基對海綿放線菌的分離效果差別很大[10] 。

由圖1可以看出，分離效果較好的培養(yǎng)基有M2、RH和GT，其中M2培養(yǎng)基中共分離得到22株放線菌，分離效果最好。有研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入低比例的營養(yǎng)成分能分離出更多的海洋特有放線菌[11]。M2培養(yǎng)基中除甘油和精氨酸外，僅提供了簡單的K、P和Mg等無機(jī)鹽，適合海綿放線菌的分離，這與很多研究發(fā)現(xiàn)甘油-精氨酸培養(yǎng)基的分離效果較好相符[12-14]；RH和GT培養(yǎng)基除提供了唯一的碳源和氮源外，其中加入的一些無機(jī)離子成分作為無機(jī)營養(yǎng)鹽，都是成分簡單的寡營養(yǎng)培養(yǎng)基，滿足了海綿放線菌的特殊需求。

2.2 具有抑菌活性的海綿放線菌篩選

以抑菌圈直徑大小為海綿放線菌抑菌活性強(qiáng)弱的判斷指標(biāo)，其結(jié)果見表1?？梢钥闯觯瑥闹泻Y選出11株活性較強(qiáng)（對3株指示菌均具有抑菌效果，且至少對1株指示菌的抑菌圈直徑ID≥15 mm）的海綿放線菌。分離出的57株海綿放線菌中有55株對3株指示菌中的至少1株有抑菌活性，表明海洋放線菌廣泛的抑菌活性具有無限的開發(fā)潛能，值得人們關(guān)注研究。

2.3 具有抑菌活性的海綿放線菌的多樣性

對篩選出的11株抑菌活性較強(qiáng)的海綿放線菌進(jìn)行16S rDNA序列分析，利用MEGA 5.0軟件對這些序列進(jìn)行分析，采用鄰接法，重復(fù)取樣1 000次，構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖2所示?？梢钥闯觯Y選出的這11株海綿放線菌均屬于鏈霉菌屬的不同種，對3種指示菌均具有抑菌活性，展現(xiàn)出海綿放線菌的多樣性。

3 討論

海綿是一種簡單而古老的多細(xì)胞動物，能產(chǎn)生比其他海洋生物物種更為豐富的生物活性物質(zhì)，是海洋天然產(chǎn)物的重要來源。其體內(nèi)大量的微生物資源得到分離并成功培養(yǎng)的占整個海綿微生物群落的不足0.1%[15]。對于海綿放線菌的分離培養(yǎng)，仍需要更積極地探索。其中，選擇性分離培養(yǎng)基的成分對于海洋放線菌的分離具有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)簡單的培養(yǎng)基更適合放線菌的分離[8]。常顯波等[16]用9種分離培養(yǎng)基對青島海區(qū)潮間帶的沉積物進(jìn)行放線菌分離，培養(yǎng)基M1、M6分離得到的放線菌數(shù)目較多，主要碳源為可溶性淀粉和棉籽糖，是放線菌的偏好營養(yǎng)成分[17]。M8含有放線菌喜好的精氨酸和甘油成分[18-20]，分離到的數(shù)量也較多，與本文中M2培養(yǎng)基分離效果最好一致，低營養(yǎng)的RH和GT培養(yǎng)基同樣分離效果較好。

采用瓊脂塊法篩選海綿放線菌抑菌活性，海綿放線菌展現(xiàn)出較好的抑菌活性，在分離出的57株放線菌中有55株對3株指示菌中的至少1株有抑菌活性，僅有2株未表現(xiàn)出抑菌活性，說明海綿放線菌在開發(fā)抑菌活性物質(zhì)上有廣闊的前景。由于本文中指示菌的廣譜性不高，或者受分離方法的限制，對于未表現(xiàn)出抑菌活性的海綿放線菌并不能判定無活性，需要針對不同的指示菌或者采用不同的篩選方法進(jìn)一步的篩選驗證。

本研究中，從57株海綿放線菌中篩選出11株抑菌活性較強(qiáng)的海綿放線菌，對3株海水養(yǎng)殖病原指示菌均有抑制作用，且對至少1株指示菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑>15 mm，值得進(jìn)一步進(jìn)行抑制海水養(yǎng)殖弧菌的生物活性等方面的研究。李 俠等[21]從山東日照海域潮間帶分離篩選出4株對半滑舌鰨鰻弧菌（Vibrio anguillarum）和副溶血弧菌（Vibrio paraha-emolyticus）同時具有較強(qiáng)拮抗作用的海洋放線菌，基本滿足海水養(yǎng)殖弧菌病防治要求。海洋放線菌對海水養(yǎng)殖病原菌具有較強(qiáng)的抑制作用，在海水養(yǎng)殖病害防治方面具有潛在的應(yīng)用價值。

放線菌以產(chǎn)生豐富的次級活性代謝產(chǎn)物而著稱，特別是鏈霉菌屬作為已知放線菌中最大的族群，是產(chǎn)生抗生素最多的種屬[22]，受到人們的高度重視。本文對篩選出的11株抑菌活性較強(qiáng)的海綿放線菌進(jìn)行了16S rDNA序列分析，初步鑒定均屬于鏈霉菌屬，進(jìn)一步說明海洋鏈霉菌是獲得活性代謝產(chǎn)物的重要資源。

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