顧燦燦，郭大營(yíng)

（浙江省碳材料溫州大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院碳材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325027）

新型均相電化學(xué)適配體傳感器對(duì)黃曲霉毒素B1檢測(cè)的研究

顧燦燦，郭大營(yíng)

（浙江省碳材料溫州大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院碳材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325027）

本文提出了一種非標(biāo)記均相電化學(xué)方法用于來(lái)檢測(cè)黃曲霉毒素B1。該方法根據(jù)ITO電極表面長(zhǎng)鏈DNA 和短鏈DNA 擴(kuò)散性質(zhì)的不同，與核酸外切酶的性質(zhì)相結(jié)合，用于信號(hào)轉(zhuǎn)換系統(tǒng)。當(dāng)黃曲霉毒素B1存在時(shí)，其與核酸適配體反應(yīng)釋放的單鏈被外切酶切割擴(kuò)散到電極表面，能觀察到明顯的電化學(xué)信號(hào)。該方法不僅能產(chǎn)生靈敏的電化學(xué)信號(hào)，而且還能實(shí)現(xiàn)對(duì)毒素的高選擇性檢測(cè)。

適配體傳感器；生物毒素；均相反應(yīng)

黃曲霉毒素主要產(chǎn)于黃曲霉及寄生曲霉，廣泛存在于谷物類(lèi)、花生制品、高粱及豆制品中[1]。其中，黃曲霉毒素B1 (AFB1) 是最常見(jiàn)的，且對(duì)人體及動(dòng)物具有強(qiáng)效的致癌性，在許多試驗(yàn)中已被證實(shí)能夠形成DNA加合物，引起肝細(xì)胞癌[2]。因此，發(fā)展有效的方法來(lái)檢測(cè)AFB1，對(duì)早期癌癥臨床診斷和藥物研究具有重大意義。雖然黃曲霉毒素B1活性的檢測(cè)方法已經(jīng)很成熟，但是大多數(shù)檢測(cè)方法都存在操作復(fù)雜、耗時(shí)較長(zhǎng)、檢測(cè)過(guò)程中有放射性物質(zhì)參與等問(wèn)題。為了彌補(bǔ)這些方法的不足，發(fā)展了能夠替代傳統(tǒng)檢測(cè)黃曲霉毒素B1活性的新分析檢測(cè)技術(shù)，例如電化學(xué)分析技術(shù)、熒光分析技術(shù)、比色分析技術(shù)等[3-4]。近年來(lái)，電化學(xué)分析方法因其高效、快速、簡(jiǎn)便的操作而被廣泛應(yīng)用于分析檢測(cè)中，一些文獻(xiàn)[5-6]也報(bào)道了運(yùn)用電化學(xué)方法測(cè)定毒素的方法，比如說(shuō)直接通過(guò)電化學(xué)方法測(cè)定亞甲基藍(lán)的氧化信號(hào)，或者把電化學(xué)和免疫法相結(jié)合，通過(guò)阻抗分析測(cè)定目標(biāo)物活性的響應(yīng)信號(hào)等，但這些方法的靈敏度都不太高。因此，發(fā)展非標(biāo)記的、靈敏度高、選擇性好的檢測(cè)黃曲霉毒素B1活性的方法仍然是個(gè)很大的挑戰(zhàn)。

為此，我們依據(jù)長(zhǎng)鏈DNA和短鏈DNA在帶負(fù)電荷的ITO電極上擴(kuò)散性質(zhì)的不同，提出了一種特異的非標(biāo)記的均相溶液的方法，用于黃曲霉毒素B1的檢測(cè)。在該方法中，識(shí)別部分是依據(jù)適配體能對(duì)毒素實(shí)現(xiàn)特異性識(shí)別，信號(hào)轉(zhuǎn)換部分是依據(jù)在ITO電極上二茂鐵標(biāo)記的DNA鏈被酶切割后形成短鏈DNA，其擴(kuò)散性變強(qiáng)使電信號(hào)增強(qiáng)。與其他檢測(cè)黃曲霉毒素B1活性的方法相比[7]，這種非標(biāo)記的均相電化學(xué)檢測(cè)方法，因其無(wú)需復(fù)雜DNA鏈的設(shè)計(jì)和標(biāo)記技術(shù)，似乎很容易實(shí)施。實(shí)驗(yàn)證明了這種非標(biāo)記的方法應(yīng)用于黃曲霉毒素B1的活性檢測(cè)，具有較高的靈敏性和選擇性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

無(wú)水乙醇（C2H5OH≥99.7%），核酸外切酶Ⅰ，核酸外切酶Ⅰ緩沖溶液，黃曲霉毒素B1，赭曲霉毒素A，MOPS（AR），氯化鈉（AR）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電化學(xué)工作站，超聲波清洗儀，純水-超純水聯(lián)用系統(tǒng)，電子天平，熒光光譜儀。

1.3 ITO電極的處理和雙鏈的準(zhǔn)備

首先準(zhǔn)備雙鏈DNA，即將探針1和探針2加入到300mM的MOPS緩沖溶液（內(nèi)含有150mM的NaCl）中，在37℃下水浴處理90min后，慢慢冷卻到室溫，形成所需雙鏈DNA。

ITO電極用于檢測(cè)之前，需要進(jìn)行預(yù)處理。先將ITO電極在去離子水中超聲15min，再在異丙醇、丙酮溶液、超純水中各超聲15min，然后于室溫下將其浸泡在1mM的NaOH 溶液中5h，最后用去離子水超聲5min 后用N2吹干備用。

1.4 DNA分析及電化學(xué)檢測(cè)

DNA雙鏈雜交反應(yīng)后，將不同濃度的黃曲霉毒素B1加入到含有0.2unit·μL-1的核酸外切酶Ⅰ緩沖溶液中，然后在37℃水浴中反應(yīng)1h以使反應(yīng)完全，隨后對(duì)上述溶液進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)。

所有電化學(xué)測(cè)試都通過(guò)760E電化學(xué)工作站在室溫下進(jìn)行。采用三電極體系，ITO為工作電極，銀-氯化銀電極為參比電極，鉑電極為對(duì)電極。通過(guò)DPV的方法，從-0.1～0.7V進(jìn)行檢測(cè)，電化學(xué)方法測(cè)定得到的結(jié)果，誤差值均從3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中獲得。

2 結(jié)果與討論

2.1 ITO電極在均相溶液中用于檢測(cè)黃曲霉毒素B1活性的基本原理

鑒于之前的研究中，ITO電極在一系列處理后可以使表面帶負(fù)電荷[8]，而DNA因?yàn)楹辛姿峄鶊F(tuán)而帶負(fù)電荷，則短鏈DNA所含負(fù)電荷就少，而長(zhǎng)鏈DNA所含負(fù)電荷相對(duì)較多，相比于長(zhǎng)鏈DNA，短鏈DNA更容易擴(kuò)散到同樣帶負(fù)電荷的ITO電極表面，因?yàn)樗鼈冎g的相對(duì)斥力更小，所以我們提出了一種以ITO電極為工作電極，在均相溶液中結(jié)合酶催化信號(hào)放大技術(shù)，建立一個(gè)低成本無(wú)標(biāo)記的黃曲霉毒素B1活性的檢測(cè)方法。實(shí)驗(yàn)中，DNA雜交長(zhǎng)鏈和目標(biāo)物反應(yīng)均在均相溶液中進(jìn)行，無(wú)需繁雜的標(biāo)記過(guò)程，因此具有很高的反應(yīng)效率。其具體分析檢測(cè)過(guò)程如圖1 所示。首先將二茂鐵標(biāo)記的探針1（probe1）和黃曲霉毒素適配體雜交形成雙鏈DNA，設(shè)計(jì)好的探針1包含18個(gè)堿基和在5’末端標(biāo)記的二茂鐵，當(dāng)沒(méi)有加入黃曲霉毒素B1時(shí)，因?yàn)殡s交后的雙鏈DNA和ITO電極之間有很強(qiáng)的斥力作用，所以幾乎檢測(cè)不到電信號(hào)。當(dāng)加入目標(biāo)毒素時(shí)，適配體和AFB1之間很強(qiáng)的結(jié)合力會(huì)使探針1從雙鏈DNA上解離出來(lái)，然后核酸外切酶Ⅰ就會(huì)把探針1催化水解成帶有二茂鐵標(biāo)記的單核苷酸。因其相對(duì)于ITO電極的電荷斥力相對(duì)更小，單核苷酸更容易擴(kuò)散到ITO 電極表面，因此可以檢測(cè)到很明顯的電化學(xué)信號(hào)。同時(shí)，適配體-AFB1結(jié)合物上的適配體也被外切酶切割使毒素釋放，來(lái)觸發(fā)更多的反應(yīng)、催化和分解，這樣單個(gè)毒素就能引起多次反應(yīng)，使電信號(hào)得到增強(qiáng)。其原理見(jiàn)圖1。

圖1 無(wú)修飾均相電化學(xué)適配體傳感器和酶催化反應(yīng)信號(hào)放大技術(shù)相結(jié)合用于檢測(cè)黃曲霉毒素B1活性的原理圖

2.2 黃曲霉毒素B1活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的可行性

該方法的信號(hào)轉(zhuǎn)換主要是依靠二茂鐵標(biāo)記的DNA片段擴(kuò)散到電極表面，與ITO電極相互作用獲得的。因此，我們首先初步研究了加入黃曲霉毒素B1前后的均相溶液反應(yīng)后的電化學(xué)性能。如圖2所示，沒(méi)有加入目標(biāo)毒素時(shí)，來(lái)自二茂鐵的電化學(xué)信號(hào)幾乎可以忽略不計(jì)，也就是說(shuō)二茂鐵產(chǎn)生的DPV信號(hào)很小，這是因?yàn)殚L(zhǎng)鏈DNA帶有過(guò)多的負(fù)電荷。但是，當(dāng)加入黃曲霉毒素B1時(shí)，可以觀察到一個(gè)很強(qiáng)的電流峰，這是因?yàn)榻?jīng)過(guò)酶切割單鏈反應(yīng)，溶液中有很多二茂鐵標(biāo)記的單核苷酸能輕易地?cái)U(kuò)散到ITO電極表面。這個(gè)結(jié)果證明了實(shí)驗(yàn)的可行性。

圖2 均相電化學(xué)適配體傳感器和酶催化反應(yīng)信號(hào)放大技術(shù)相結(jié)合用于檢測(cè)黃曲霉毒素B1活性的DPV圖

2.3 黃曲霉毒素B1活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

本文進(jìn)一步研究了影響本實(shí)驗(yàn)電化學(xué)響應(yīng)信號(hào)的因素。在本實(shí)驗(yàn)中，DNA雜交效率是提高生物傳感器靈敏度的關(guān)鍵因素。隨著捕獲DNA探針的濃度增加，將會(huì)產(chǎn)生高的背景干擾峰，而二茂鐵標(biāo)記DNA探針濃度過(guò)低會(huì)使電化學(xué)信號(hào)響應(yīng)減弱，因此二茂鐵標(biāo)記探針濃度條件應(yīng)首先優(yōu)化。在實(shí)驗(yàn)中，AFB1、適配體鏈、核酸外切酶Ⅰ的濃度先分別設(shè)為1.0ng·mL-1、2.0μM、0.2unit·μL-1，然后將捕獲探針DNA的濃度從0.2～2.0μM進(jìn)行實(shí)驗(yàn)?？梢钥吹?，隨著二茂鐵標(biāo)記探針DNA濃度增加，DPV所測(cè)的峰電流值先增加，直到二茂鐵標(biāo)記探針的濃度為1.0μM時(shí)，峰電流值開(kāi)始減弱[圖3（A）]。因此，二茂鐵標(biāo)記的DNA探針的濃度為1.0μM是構(gòu)建生物傳感器的最佳濃度。

DNA雜交時(shí)間是影響均相生物傳感器性能的另一個(gè)重要因素，雜交時(shí)間過(guò)短同樣會(huì)產(chǎn)生很高的背景干擾峰。這是因?yàn)闀r(shí)間過(guò)短會(huì)使溶液中有大量的未雜交的二茂鐵標(biāo)記DNA，能被外切酶催化分解產(chǎn)生強(qiáng)的電信號(hào)。隨著雜交時(shí)間的增加，ΔI（加入毒素前后電流的差值）先增加，直到90min 后達(dá)到一個(gè)平臺(tái)[圖3（B）]。因此，90min為DNA雜交反應(yīng)的最優(yōu)時(shí)間。

圖3 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化圖

長(zhǎng)時(shí)間的均相溶液反應(yīng)將對(duì) DNA 單鏈進(jìn)行信號(hào)放大， 這也是影響適配體傳感器分析性能的一個(gè)重要參數(shù)。目標(biāo)物反應(yīng)時(shí)間主要是與適配體-AFB1結(jié)合物的形成及外切酶催化分解單鏈有關(guān)。如圖3（C）所示，DPV信號(hào)隨著反應(yīng)時(shí)間從20～60min持續(xù)增加然后變得穩(wěn)定。因此，60min為最優(yōu)的均相溶液反應(yīng)時(shí)間。

此外，核酸外切酶Ⅰ在實(shí)驗(yàn)中起著舉足輕重的作用，擔(dān)任著信號(hào)放大和降低信號(hào)噪音的角色。因此，我們對(duì)核酸外切酶Ⅰ的濃度做了考察。從圖3（D） 中可知，當(dāng)反應(yīng)體系中核酸外切酶Ⅰ的濃度為0時(shí)，因毒素和適配體的特異性結(jié)合使溶液中有大量游離的二茂鐵標(biāo)記DNA，沒(méi)有酶催化反應(yīng)發(fā)生，相應(yīng)地產(chǎn)生的電化學(xué)信號(hào)就會(huì)相對(duì)較弱，峰電流信號(hào)為 -0.1μA左右。隨著核酸外切酶Ⅰ濃度增加，峰電流響應(yīng)信號(hào)逐漸增強(qiáng)，直到 0.2unit·μL-1時(shí)，峰電流到達(dá)一個(gè)平臺(tái)，說(shuō)明此時(shí)該體系中酶切反應(yīng)已經(jīng)基本完成。因此，選擇 0.2unit·μL-1為核酸外切酶Ⅰ的濃度，進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.4 對(duì)黃曲霉毒素B1活性的測(cè)定分析

在最佳的條件下，對(duì)黃曲霉毒素B1的活性進(jìn)行評(píng)估。圖4是不同濃度的黃曲霉毒素B1對(duì)應(yīng)不同的DPV響應(yīng)信號(hào)。可以觀測(cè)到隨著黃曲霉毒素B1濃度從0 ng·mL-1到1.00ng·mL-1逐漸增加，電化學(xué)信號(hào)逐漸增強(qiáng)，說(shuō)明當(dāng)高濃度的黃曲霉毒素B1存在時(shí)，能與更多的適配體結(jié)合，使游離出的二茂鐵標(biāo)記DNA能被非常高效地降解，并通過(guò)DPV來(lái)對(duì)黃曲霉毒素B1進(jìn)行定量分析。如圖5所示，黃曲霉毒素B1與DPV響應(yīng)信號(hào)之間存在良好的線性關(guān)系。線性相關(guān)系數(shù)R= 0.9928。該方法測(cè)得的黃曲霉毒素B1的最低檢測(cè)限是0.001ng·mL-1，低于之前報(bào)道過(guò)的檢測(cè)方法[9-10]。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，本章提出的均相的非標(biāo)記的電化學(xué)檢測(cè)方法可以快速有效地用于黃曲霉毒素B1的定量分析。該方法的優(yōu)勢(shì)不僅歸功于適配體對(duì)黃曲霉毒素B1的特異性識(shí)別，還歸功于長(zhǎng)鏈與短鏈DNA在ITO電極上擴(kuò)散性的不同，并且外切酶對(duì)單鏈的切割產(chǎn)生了信號(hào)放大作用。

圖5 AFB1濃度相對(duì)于峰電流的線性關(guān)系，圖中的誤差值是通過(guò)3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的

2.5 黃曲霉毒素B1活性的特異性考察

我們建立的黃曲霉毒素B1的活性分析方法不僅在檢測(cè)方法上體現(xiàn)出高效性，而且在選擇性實(shí)驗(yàn)中也表現(xiàn)出卓越的品質(zhì)。以赭曲霉毒素a、赭曲霉毒素b、伏馬毒素B1進(jìn)行對(duì)比來(lái)評(píng)估該方法的選擇性能力。如圖6所示，其他干擾離子即使?jié)舛雀吆芏?，仍然?duì)傳感器檢測(cè)AFB1的影響甚微。由于適配體對(duì)黃曲霉毒素B1有特異性識(shí)別作用，不識(shí)別其他的毒素，所以本文論述的均相電化學(xué)適配體傳感器有很強(qiáng)的選擇性。

圖6 不同的毒素的DPV響應(yīng)信號(hào)

3 結(jié)論

本文在一種均相溶液中，無(wú)標(biāo)記運(yùn)用適配體，將黃曲霉毒素B1特異性和核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn)相結(jié)合，建立了一種非標(biāo)記的黃曲霉毒素B1活性的檢測(cè)方法。相對(duì)于其他檢測(cè)方法，本文提出的均相溶液檢測(cè)方法較容易操作，也不需要復(fù)雜DNA鏈的設(shè)計(jì)和電極標(biāo)記技術(shù)，表現(xiàn)出了較高的重現(xiàn)性和選擇性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，這一方法可快速靈敏地檢測(cè)黃曲霉毒素B1的活性和含量，在臨床診斷和藥物研究方面具有巨大的應(yīng)用潛力。

[1] Owino J H O, Arotiba O A, Nicolette H, et al. Electrochemical Immunosensor Based on Polythionine/Gold Nanoparticles for the Determination of Aflatoxin B1[J]. 2008, 8(12): 8262-8274.

[2] Marin S, Ramos A J, Cano-Sancho G, et al. Mycotoxins: Occurrence, toxicology, and exposure assessment[J]. Food & Chemical Toxicology An International Journal Published for the British Industrial Biological Research Association, 2013, 60(10): 218-237.

[3] de Boer J G, Quiney B, Walter P B, et al. Protection against aflatoxin-B1-induced liver mutagenesis by Scutellariabaicalensis.[J]. Mutation Research/fundamental & Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 2005, 578(1/2): 15-22.

[4] Bedard L L, Massey T E. Aflatoxin B1-induced DNA damage and its repair.[J]. Cancer Letters, 2006, 241(2): 174.

[5] Hu Y Y, Zheng P, Zhang Z X, et al. Determination of aflatoxins in high-pigment content samples by matrix solid-phase dispersion and high-performance liquid chromatography.[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 2006, 54(12): 4126.

[5] Ahmed I A, Robinson R K. Selection of a Suitable Method for Analysis of Aflatoxins in Date Fruits.[J]. Journal of Agricultural & Food Chemistry, 1998, 46(2): 580-584.

[7] Ventura M, Gmez A, Anaya I, et al. Determination of aflatoxins B1, G1, B2 and G2 in medicinal herbs by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.[J]. Journal of Chromatography A, 2004, 1048(1): 25.

[8] Edinboro L E, Karnes H T. Determination of aflatoxin B1 in sidestream cigarette smoke by immunoaffinity column extraction coupled with liquid chromatography/mass spectrometry.[J]. Journal of Chromatography A, 2005, 1083(1/2): 127-132.

[9] Lipigorngoson S, Limtrakul P, Suttajit M, et al. In-house direct cELISA for determining aflatoxin B1 in Thai corn and peanuts.[J]. Food Additives & Contaminants, 2003, 20(9): 838-845.

[10] Sun A L, Qi Q A, Dong Z L, et al. An electrochemical enzyme immunoassay for aflatoxin B1, based on bioelectrocatalytic reaction with room-temperature ionic liquid and nanoparticle-modified electrodes[J]. Journal of Food Measurement and Characterization, 2008(1): 43-50.

Study on A Novel Homogeneous Biosensor for AFB1 Detection

GU Cancan，GUO Daying
(Institute of Chemical and Materials Engineering, Key Laboratory of Carbon Materials in Zhejiang Province, Wenzhou University, Wenzhou 325027, China)

A novel electrochemical aptasensor was designed for the detection of AFB1. This sensor realized electrochemical detection of AFB1 in a homogeneous solution, with sensing signals amplified by an exonuclease I-based tar get recycling strategy. In the presence of analyte AFB1, an increased electrochemical signal could be observed.

biosensor; mycotoxin; homogeneous reaction

O 657.1

A

1671-9905(2017)05-0038-05

2017-03-06