李曉梅+郭體環(huán)+張來(lái)軍+李由明

摘要：為了研究在未來(lái)海洋酸化背景下重金屬對(duì)貝類免疫的影響，在實(shí)驗(yàn)室條件下，設(shè)置0.05、0.50、5.00 mg/L 3種硝酸鉛濃度，以0.00 mg/L作為對(duì)照，比較正常海水（pH值8.0）、酸化海水（pH值7.6）背景下鉛脅迫對(duì)近江牡蠣鰓組織過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的影響。結(jié)果表明：在正常海水（pH值8.0）條件下，鉛濃度為0.00、0.05、0.50 mg/L時(shí)，對(duì)近江牡蠣CAT活性表現(xiàn)為誘導(dǎo)效應(yīng)，且誘導(dǎo)效應(yīng)隨鉛濃度升高、脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，至20 d時(shí)，各組間即表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05）；鉛濃度為5.00 mg/L時(shí)，對(duì)近江牡蠣CAT活性的誘導(dǎo)效應(yīng)快而強(qiáng)烈，至10 d時(shí)，近江牡蠣CAT活性遠(yuǎn)高于其他各組（P<0.05），但隨后又逐漸減弱，至25 d時(shí)，與0.05 mg/L組相當(dāng)，已顯著低于0.50 mg/L組（P<0.05）。酸化海水（pH值7.6）條件下，短期內(nèi)無(wú)論鉛濃度高或低，均對(duì)近江牡蠣CAT活性呈現(xiàn)誘導(dǎo)效應(yīng)，且鉛濃度越高，誘導(dǎo)效應(yīng)越強(qiáng)；隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，誘導(dǎo)效應(yīng)呈下降趨勢(shì)，鉛濃度越高，CAT活性下降越快，至后期高濃度鉛對(duì)近江牡蠣CAT活性表現(xiàn)出抑制效應(yīng)；至30 d時(shí)，0.00、0.05、0.50 mg/L組近江牡蠣CAT活性與對(duì)照組（pH值7.6、0.00 mg/L）相近，且3組間無(wú)明顯差異，但5.00 mg/L組近江牡蠣CAT活性顯著低于對(duì)照組（P<0.05）。由研究結(jié)果可見(jiàn)，酸化和鉛對(duì)近江牡蠣CAT的影響具有協(xié)同作用，當(dāng)鉛濃度較低時(shí)，近江牡蠣CAT活性主要受pH值影響，當(dāng)鉛濃度達(dá)到一定值（5.00 mg/L）后，近江牡蠣CAT活性主要受鉛濃度影響，雙重脅迫會(huì)增加近江牡蠣受損的程度。

關(guān)鍵詞：海洋酸化；鉛；鰓；CAT；近江牡蠣；健康養(yǎng)殖；過(guò)氧化氫酶活性

中圖分類號(hào)： S917.4；S968.31+6.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）07-0165-04

重金屬是一類典型的環(huán)境污染物，環(huán)境中重金屬污染的來(lái)源主要是化工、采礦、金屬冶煉及加工、電鍍、輪船制造等行業(yè)，以及農(nóng)用殺蟲(chóng)劑、生活污水和垃圾滲出液等。對(duì)于生物體而言，組織內(nèi)含有較低濃度鉛時(shí)就能對(duì)有機(jī)體產(chǎn)生顯著的毒性[1]，生物體會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能[2]，因此需要抗氧化系統(tǒng)來(lái)對(duì)抗可能產(chǎn)生的細(xì)胞損傷。

過(guò)氧化氫酶（CAT）是機(jī)體抗氧化體系中非常關(guān)鍵的一種非特異抗氧化酶，能夠清除超氧化物歧化酶（SOD）催化活性氧自由基所產(chǎn)生的H2O2，使它轉(zhuǎn)化為對(duì)機(jī)體無(wú)毒的H2O、O2，后者和SOD共同作用可使機(jī)體免受氧自由基的攻擊[3]。

海洋酸化已被廣泛確認(rèn)是CO2上升導(dǎo)致的又一重大環(huán)境問(wèn)題[4]。化石燃料的使用等人類活動(dòng)導(dǎo)致大氣中CO2濃度不斷升高，可能已經(jīng)導(dǎo)致全球變暖和氣候異常等[5]，海洋不斷從大氣中吸收CO2，對(duì)緩解全球變暖起著重要的作用[6]。然而，自工業(yè)革命以來(lái)，海洋大量吸收人類排放的CO2，已導(dǎo)致上層海水pH值下降了0.1[7]。根據(jù)聯(lián)合國(guó)政府間氣候變化專門委員會(huì)（IPCC）預(yù)測(cè)模型（A1F1）的推測(cè)，至2100年大氣CO2濃度會(huì)升至800～1 000 μL/L，表層海水pH值將下降0.3～0.4，這種酸化速度在過(guò)去3億年間的任何一個(gè)時(shí)期都未有過(guò)[8]。海洋酸化引起的海洋化學(xué)變化（碳酸鹽系統(tǒng)及物質(zhì)形態(tài)），正在改變海洋生物賴以生存的化學(xué)環(huán)境，海洋生物的代謝過(guò)程會(huì)受到影響，海洋生態(tài)的穩(wěn)定性會(huì)發(fā)生變化[9]。海洋酸化引起的海水pH值的降低會(huì)改變海洋生物的多項(xiàng)生理功能，使海洋生物抵抗不良環(huán)境脅迫與疾病等能力降低，致使脅迫或疾病對(duì)海洋生物造成的損傷更嚴(yán)重，甚至在較低脅迫強(qiáng)度下造成生物個(gè)體死亡[10]。

近江牡蠣（Crassostrea rivularis）是我國(guó)主要牡蠣養(yǎng)殖種類之一，屬于半咸水種類，主要分布在華南沿海眾多河口地帶。由于近江牡蠣生活在河口區(qū)域，不斷有淡水經(jīng)此流入海洋，再加上潮汐、海浪等的影響，近江牡蠣的生活環(huán)境經(jīng)常發(fā)生劇烈變化，而且近江牡蠣不像其他海洋生物可以移動(dòng)，可以趨利避害，而是固定在巖石或其他物體上生活，由此近江牡蠣自身形成了一系列應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的適應(yīng)機(jī)制，是用于研究環(huán)境脅迫響應(yīng)的很好的材料。目前，有關(guān)海洋酸化和鉛對(duì)貝類的生物學(xué)影響研究多是單一因素的，包括海洋酸化對(duì)貝類受精、發(fā)育、免疫、攝食和繁殖的影響[11-13]，以及鉛對(duì)貝類抗氧化酶活性的影響[2，14]等，很少有關(guān)于鉛和海洋酸化復(fù)合脅迫對(duì)貝類的影響研究。本研究探討了海水酸化和鉛復(fù)合脅迫對(duì)近江牡蠣CAT活性的影響，以期為近江牡蠣的健康養(yǎng)殖、棲息地環(huán)境檢測(cè)、防治污染和海洋環(huán)境保護(hù)等提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

本試驗(yàn)所用近江牡蠣于2015年3月購(gòu)自海南昌化，采捕后立即送至試驗(yàn)場(chǎng)地，洗刷干凈后置于4 m×4 m×1.5 m的室內(nèi)水泥池內(nèi)暫養(yǎng)7 d，經(jīng)測(cè)定，近江牡蠣采集地和試驗(yàn)地海水中鉛含量均低于0.01 mg/L，無(wú)顯著性差異。暫養(yǎng)期間采用靜態(tài)換水法，每天換水1次，養(yǎng)殖用水為過(guò)濾海水，主要水環(huán)境因子按采樣地調(diào)控，水溫（27±1） ℃，pH值8.0，鹽度30‰，以金藻、青島大扁藻作為餌料，24h連續(xù)充氧。暫養(yǎng)結(jié)束后，死亡率<1%，符合試驗(yàn)要求，挑選大小均勻[（10.36±183）g/只]的近江牡蠣個(gè)體作為受試生物。

以硝酸鉛作為污染物，將硝酸鉛（分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）配制成 10 mg/mL的母液。按需要稀釋到相應(yīng)的濃度，進(jìn)行鉛脅迫試驗(yàn)。

1.2海水處理

試驗(yàn)前使用乙酸調(diào)配試驗(yàn)所需酸化海水（pH值7.6），為防止調(diào)配好的海水在使用過(guò)程中pH值升高，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，最終采用輸液管勻速緩慢向試驗(yàn)容器中滴加乙酸的方法穩(wěn)定水體pH值。試驗(yàn)以正常海水作為對(duì)照（pH值8.0）。

1.3試驗(yàn)分組

GB 3097—1997《海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》中的4類海水和NY5052—2001《無(wú)公害食品 海水養(yǎng)殖用水水質(zhì)》中規(guī)定鉛含量≤0.05 mg/L。已有試驗(yàn)表明，鉛對(duì)近江牡蠣的96 h LC50為43.55 mg/L，本試驗(yàn)以此為依據(jù)，按等比數(shù)列設(shè)計(jì)硝酸鉛濃度分別為0.05、0.50、5.00 mg/L的3個(gè)濃度組，以0.00 mg/L作為對(duì)照組（CK），每組均設(shè)置3個(gè)平行，各試驗(yàn)組海水pH值及硝酸鉛濃度見(jiàn)表1。試驗(yàn)在150 L塑料桶中進(jìn)行，每桶加 100 L 試驗(yàn)溶液，每組放入經(jīng)暫養(yǎng)的近江牡蠣 50 只。試驗(yàn)期間每24 h更換1次試液，以金藻、青島大扁藻作為餌料，試驗(yàn)期間控制水溫（27±1） ℃，鹽度30‰，24h連續(xù)充氧。

1.4樣品制備

試驗(yàn)開(kāi)始的當(dāng)天記為0 d，試驗(yàn)開(kāi)始后的5、10、15、20、25、30 d，從各桶隨機(jī)取3只近江牡蠣，每組9只，取鰓組織，稱質(zhì)量，按1 ∶9（質(zhì)量體積比）的比例添加預(yù)冷的生理鹽水，冰上勻漿，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取上清液，置于 -80 ℃ 超低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5CAT活性測(cè)定

CAT活性測(cè)定使用南京建成生物工程研究所研制的CAT檢測(cè)試劑盒（A007-1），按照試劑盒使用說(shuō)明操作，每個(gè)待測(cè)樣品測(cè)試3次。

1.6數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。用Excel、SPSS等軟件進(jìn)行單因素方差分析和圖表制作。

2結(jié)果與分析

2.1pH值為8.0時(shí)鉛對(duì)近江牡蠣CAT活性的影響

由圖1可見(jiàn)，正常海水（pH值8.0）條件下，鉛對(duì)近江牡蠣CAT活性的影響表現(xiàn)為在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)，0.00、0.05、0.50 mg/L 3個(gè)處理組鉛對(duì)近江牡蠣CAT活性一直表現(xiàn)為誘導(dǎo)效應(yīng)，而且誘導(dǎo)效應(yīng)在一定范圍內(nèi)隨鉛濃度升高、脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，各組間差異也隨之增大；自15 d起，部分組間即表現(xiàn)出顯著差異（P<0.05），直至試驗(yàn)結(jié)束；5.00 mg/L處理組在試驗(yàn)前期誘導(dǎo)效應(yīng)非常強(qiáng)，至10 d時(shí)近江牡蠣CAT活性顯著高于其他各組（P<0.05），而自15 d開(kāi)始，5.00 mg/L處理組誘導(dǎo)效應(yīng)逐漸減弱，15、20 d，5.00 mg/L組近江牡蠣CAT活性與 0.50 mg/L 組無(wú)明顯差異，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，5.00 mg/L 組近江牡蠣CAT活性繼續(xù)降低，至25 d時(shí)與 0.05 mg/L 組相當(dāng)，已顯著低于0.50 mg/L組（P<0.05）。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在正常海水（pH值8.0）中，低濃度鉛對(duì)近江牡蠣CAT活性的誘導(dǎo)效應(yīng)顯現(xiàn)得緩慢，但一直保持上升的趨勢(shì)；高濃度鉛對(duì)近江牡蠣CAT活性的誘導(dǎo)效應(yīng)顯現(xiàn)得快而強(qiáng)烈，但隨后又逐漸減弱。

2.2pH值為7.6時(shí)鉛對(duì)近江牡蠣CAT活性的影響

由圖2酸化海水（pH值7.6）條件下鉛對(duì)近江牡蠣CAT活性的影響可見(jiàn)：在試驗(yàn)開(kāi)始后的前10 d，無(wú)論濃度高低的鉛對(duì)近江牡蠣CAT活性均表現(xiàn)為較強(qiáng)的誘導(dǎo)效應(yīng)，且隨鉛濃度增大、脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，誘導(dǎo)效應(yīng)逐漸增強(qiáng)；自15 d開(kāi)始，各鉛濃度組的誘導(dǎo)效應(yīng)均開(kāi)始降低，鉛濃度越高降幅越大，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，0.00、0.05、0.50 mg/L組近江牡蠣CAT活性幾乎恢復(fù)至初始值，且3組間無(wú)顯著差異，僅5.00 mg/L組近江牡蠣CAT活性顯著低于起始值（P<0.05）。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在酸化海水（pH值7.6）中，短期內(nèi)無(wú)論鉛濃度高低均對(duì)近江牡蠣CAT活性呈現(xiàn)誘導(dǎo)效應(yīng)，鉛濃度越高，誘導(dǎo)效應(yīng)越強(qiáng)；隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，誘導(dǎo)效應(yīng)呈下降趨勢(shì)，鉛濃度越高，CAT活性下降越快，至后期高濃度鉛對(duì)近江牡蠣CAT活性表現(xiàn)出抑制效應(yīng)。

2.3不同pH值對(duì)近江牡蠣CAT活性的影響

為說(shuō)明pH值對(duì)近江牡蠣CAT活性的影響，將不同鉛濃度條件下正常海水（pH值8.0）組和酸化海水（pH值7.6）組近江牡蠣CAT活性進(jìn)行比較。

由圖3-a可見(jiàn)，當(dāng)鉛濃度為0.00 mg/L時(shí)，正常海水組CAT活性基本保持不變，而酸化海水組CAT活性隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)較大波動(dòng)，總體表現(xiàn)為先升高后降低，至5 d時(shí)，略高于正常海水組；隨后，酸化海水組CAT活性快速增強(qiáng)，至10 d時(shí)，二者表現(xiàn)出極顯著差異（P<0.01）；10 d后，酸化海水組CAT活性隨處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸降低，至30 d時(shí)，與正常海水組基本相同。

由圖3-b可見(jiàn)，當(dāng)鉛濃度為0.05 mg/L時(shí)，正常海水組CAT活性隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而緩慢增強(qiáng)；酸化海水組CAT活性則表現(xiàn)為先升后降的變化趨勢(shì)；二者在10、15 d呈極顯著差異（P<0.01），酸化海水組的CAT活性高于正常海水組；30 d時(shí)，正常海水組的CAT活性極顯著高于酸化海水組（P<001）。

由圖3-c可見(jiàn)，鉛濃度為0.50 mg/L時(shí)，正常海水組CAT活性隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而迅速升高；酸化海水組CAT活性則表現(xiàn)為先升后降的變化趨勢(shì)；前期酸化海水組的CAT活性升高較快，二者在10 d時(shí)差異極顯著（P<0.01），且酸化海水組的CAT活性高于正常海水組；15 d時(shí)正常海水組CAT活性繼續(xù)上升，而酸化海水組開(kāi)始下降，二者差異顯著（P<005）；15 d后，正常海水組CAT活性繼續(xù)上升，而酸化海水組繼續(xù)下降，并且差異一直極顯著（P<0.01）。

由圖3-d可見(jiàn)，當(dāng)鉛濃度為5.00 mg/L時(shí)，正常海水組和酸化海水組CAT活性均表現(xiàn)為先升后降的變化趨勢(shì)，前 15 d 均無(wú)顯著差異，自20 d開(kāi)始酸化海水組CAT活性下降速度比正常海水組快，二者差異極顯著（P<0.01）。

在本試驗(yàn)中，酸化海水（pH值7.6）組近江牡蠣的CAT活性無(wú)論鉛濃度高低，均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，而正常海水（pH值8.0）組并不如此，當(dāng)鉛濃度為0.00～0.50 mg/L時(shí)，近江牡蠣CAT活性逐漸升高，只有當(dāng)鉛濃度為5.00 mg/L時(shí)，才呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)。

以上試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，當(dāng)鉛濃度較低時(shí)，近江牡蠣CAT活性主要受pH值影響；隨著鉛濃度增加，鉛、pH值對(duì)近江牡蠣的影響出現(xiàn)協(xié)同作用；當(dāng)鉛濃度達(dá)到一定值（5.00 mg/L）后，近江牡蠣CAT活性主要受鉛濃度影響，pH值對(duì)CAT活性的影響減弱。

3討論

已有研究表明，重金屬在海洋生物體內(nèi)富集可誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的活性氧自由基，如H2O2、O2-、·OH等，用以幫助機(jī)體清除進(jìn)入體內(nèi)的病原，但是過(guò)量的活性氧會(huì)導(dǎo)致生物體內(nèi)細(xì)胞膜的脂質(zhì)化程度加快，破壞生物體內(nèi)的活性氧平衡，進(jìn)而引起生物體的氧化損傷[15-16]。此時(shí)，生物體為避免活性氧對(duì)自身細(xì)胞的傷害，會(huì)自動(dòng)激活體內(nèi)的氧化應(yīng)激系統(tǒng)——抗氧化防御系統(tǒng)，機(jī)體抗氧化防御系統(tǒng)是保障重金屬污染脅迫造成的活性氧平衡的重要調(diào)節(jié)體系，因而常被用作監(jiān)測(cè)海洋重金屬污染物的候選生物標(biāo)記物[17]。Regoli等指出，海洋生物的氧化應(yīng)激通路中，CAT是防止活性氧分子形成必不可少的分子[16]。CAT的主要作用就是催化H2O2分解為H2O、O2，使得H2O2不至于與O2在鐵螯合物作用下反應(yīng)生成非常有害的·HO。

本研究表明，在正常海水中，低濃度鉛對(duì)近江牡蠣CAT活性的誘導(dǎo)效應(yīng)顯現(xiàn)得緩慢而持久，高濃度鉛對(duì)近江牡蠣CAT活性的誘導(dǎo)效應(yīng)顯現(xiàn)得快，但隨后又出現(xiàn)抑制效應(yīng)。鉛脅迫下近江牡蠣鰓組織的CAT活性表現(xiàn)為濃度依賴性、時(shí)間依賴性，這種在低劑量表現(xiàn)為刺激效應(yīng)，而高劑量則表現(xiàn)為抑制效應(yīng)的模式稱為“毒物興奮效應(yīng)”[18]。

在本研究中，酸化脅迫使近江牡蠣CAT活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，說(shuō)明近江牡蠣對(duì)短期的酸化脅迫可以通過(guò)啟動(dòng)應(yīng)激防御系統(tǒng)來(lái)降低自身受到的傷害，但是隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，酸化造成的傷害已超過(guò)近江牡蠣防御能力范圍，導(dǎo)致其受到損傷，酶合成能力降低，進(jìn)一步將影響近江牡蠣的正常生理活動(dòng)。很多生理學(xué)研究表明，雙殼貝類、棘皮動(dòng)物等可能最容易受到海洋酸化的影響，因?yàn)樵谒鼈凅w內(nèi)幾乎沒(méi)有能力來(lái)緩沖酸化影響[9，11，19-20]。由酸化產(chǎn)生的結(jié)果是廣泛而深遠(yuǎn)的，可能導(dǎo)致新陳代謝抑制[21]、能量存儲(chǔ)和生長(zhǎng)率降低[22]。貝類等海洋生物生理相關(guān)功能的改變已經(jīng)被用來(lái)評(píng)估海洋酸化的生態(tài)影響[23]。

本研究還顯示，酸化和鉛對(duì)近江牡蠣CAT活性的影響具有協(xié)同作用，在它們單獨(dú)存在都會(huì)對(duì)近江牡蠣造成一定損害的前提下，雙重脅迫會(huì)增加近江牡蠣受損的程度。本試驗(yàn)僅揭示了酸化和鉛對(duì)近江牡蠣的影響，而海洋中還存在大量如銅、鎘等其他有毒有害的重金屬，它們之間是否也存在類似的協(xié)同效應(yīng)，尤其值得關(guān)注。一個(gè)更大的隱憂是海洋酸化將使越來(lái)越多的重金屬?gòu)暮Ｑ蟪练e物中釋放出來(lái)，酸化越嚴(yán)重，重金屬釋放得也越多，對(duì)海洋生物的毒害就越深。因此，建立全面系統(tǒng)的海洋酸化-重金屬污染評(píng)估體系是急迫且必要的。

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