馬志杰，黃永震，黨瑞華，陳生梅，劉善齋，曹 暉，林 清，藍賢勇，張 琪，陳 宏，雷初朝*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100；2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海 西寧810016；3.國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系亳州綜合試驗站，安徽 亳州 236800；4.陜西秦寶牧業(yè)股份有限公司，陜西 寶雞 722300)

科學(xué)試驗

日本和牛Y染色體USP9Y基因多態(tài)性與父系起源研究

馬志杰1,2，黃永震1，黨瑞華1，陳生梅2，劉善齋3，曹 暉4，林 清1，藍賢勇1，張 琪1，陳 宏1，雷初朝1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100；2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海 西寧810016；3.國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系亳州綜合試驗站，安徽 亳州 236800；4.陜西秦寶牧業(yè)股份有限公司，陜西 寶雞 722300)

【目的】為了分析日本和牛Y染色體USP9Y基因遺傳多態(tài)性與父系起源?！痉椒ā坷肞CR擴增與限制性酶酶切方法?！窘Y(jié)果】對8頭日本和牛純種及19頭和秦F1代雜種牛進行Y染色體USP9Y基因多態(tài)性及父系起源研究，結(jié)果表明：日本和牛與其雜種牛都具有USP9Y基因多態(tài)性，USP9Y基因的PCR產(chǎn)物均顯示471 bp和552 bp兩種帶型，其中552 bp帶型不能被SspI酶酶切，則這2種帶型對應(yīng)Y1和Y2兩種普通牛單倍型組，表明日本和牛含有Y1和Y2兩個父系支系，有2個普通牛父系起源。日本和牛和雜種牛單倍型多樣度分別為0.5714±0.0945和0.1988±0.1121，提示日本和牛具有較高的父系遺傳多樣性?！窘Y(jié)論】日本和牛具有較高的父系遺傳多樣性及2個普通牛父系起源。

日本和牛；Y染色體；USP9Y；多態(tài)性；父系起源

日本和牛是日本十分珍貴的優(yōu)質(zhì)肉牛品種資源，是當今世界公認的品質(zhì)最優(yōu)秀的良種肉牛之一，其大理石花紋明顯、細嫩多汁、肌肉脂肪中飽和脂肪酸含量很低，風味獨特，肉用價值極高，在日本被視為“國寶”[1]。 近年來，隨著胚胎移植和體細胞克隆技術(shù)的發(fā)展，和牛胚胎移植、體細胞克隆及自體繁育已在我國獲得成功[2,3]。同時，和牛凍精雜交改良我國本地黃牛品種等育種實踐也取得一定進展[4,5]。在分子水平上，基于mtDNA D-loop區(qū)序列變異，王建英等[6]研究表明，日本和牛和渤海黑牛在mtDNA D-loop區(qū)具有豐富的遺傳多樣性，二者親緣關(guān)系較近，日本和牛屬普通牛起源，歐洲原牛、朝鮮牛和我國北方的部分牛種對日本和牛的形成可能起到了豐富種群的作用。

動物Y染色體遵循父系遺傳，單倍型完整，突變率低，不易受重組和回復(fù)突變的影響，是研究動物父系遺傳多樣性與起源的理想工具[7]。近年來，Y染色體SNPs標記(Y-SNPs)已廣泛用于世界家牛的父系起源進化研究，發(fā)現(xiàn)家牛有3種Y染色體單倍型組，即Y1、Y2和Y3[8-16]。值得關(guān)注的是，自Bonfiglio等[15]發(fā)現(xiàn)通過USP9Y基因內(nèi)含子26上的一個81 bp片段插入，利用一個天然的限制性酶切位點進行瓊脂糖電泳，能夠直接對這3種Y染色體單倍型組進行分型，不用測序，只需PCR和酶切電泳分析就可以鑒別不同的Y染色體單倍型組，大大降低了分型成本和工作量。上述這一省時省力、成本低廉的檢測技術(shù)得到較為廣泛的應(yīng)用[16]。然而，目前尚未見日本和牛及其雜種牛的父系遺傳多樣性及遺傳背景的相關(guān)研究報道。鑒于此，本研究利用USP9Y基因PCR擴增和酶切電泳技術(shù)對日本和牛及其和秦F1代雜種進行Y染色體單倍型組分析及父系起源研究，以期弄清日本和牛及其雜種牛的父系遺傳背景，為我國黃牛改良奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集及基因組DNA提取

在國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系亳州綜合試驗站和陜西秦寶牧業(yè)公司分別采集8頭純種日本和牛和19頭和秦F1代雜種牛(以日本和牛為父本，秦川牛為母本)血樣或耳組織帶回實驗室，常規(guī)酚-氯仿法提取基因組DNA，TE稀釋其濃度至10～20 ng/μL保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物合成和PCR擴增

參照Bonfiglio等[15]報道的普通牛USP9Y 基因序列合成1對引物，其中上游引物(PF)：5′-AAACCCTTCAAGGTAATAAAACAAAA-3′，下游引物(PR)：5′- CACAGCTCCTCAAAACCAGA -3′，由生工(上海)有限公司合成。PCR體系(25 μL)：2×PrimeSTAR Max Premix (TakaRa 大連公司) 10.5 μL，上、下游引物 (10 pmol·L-1) 各0.5 μL，模板DNA (10～20 ng/μL) 1μL，超純水12.5 μL。

PCR反應(yīng)程序：98℃變性10 sec，57℃退火15 sec，72℃延伸10 sec，35個循環(huán)，冷卻至4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠(含GoldView核酸染料)電泳后，凝膠成像系統(tǒng)分析檢測。

1.3 PCR產(chǎn)物的酶切分析

對PCR產(chǎn)物先進行凝膠電泳檢測，以確保擴增的目的片段特異性較高而不影響酶切結(jié)果分析。后對PCR產(chǎn)物直接用SspI限制性內(nèi)切酶進行酶切，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。并根據(jù)其帶型進行酶切分析，判定單倍型組。其中SspI酶切體系(20 μL)為：SspI酶(12 U/μL)1 μL，10×SspI Buffer 2 μL，PCR產(chǎn)物10 μL，超純水7 μL。37℃酶切8～10 h，后對酶切結(jié)果進行電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛USP9Y 基因擴增多態(tài)性與SspI 酶切鑒定

通過對和牛及其雜種牛USP9Y 基因部分序列進行PCR擴增和電泳，結(jié)果顯示，8頭純種日本和牛和19頭雜種牛PCR產(chǎn)物均獲得預(yù)期大小，有471 bp和552 bp兩種產(chǎn)物(圖1)。8頭和牛中，有4頭牛的PCR產(chǎn)物為471 bp，而另外4頭牛的PCR產(chǎn)物為552 bp。然而，在19頭雜種牛中，只有2頭牛的PCR產(chǎn)物為471 bp，而另外17頭牛的PCR產(chǎn)物均為552 bp。依據(jù)Bonfiglio等[15]的判定標準，確定4頭和牛與2頭雜種牛(471 bp)為普通牛Y1單倍型組，剩余4頭和牛與17頭雜種牛(552 bp)尚不能確定是普通牛Y2單倍型組還是瘤牛Y3單倍型組，有待SspI酶酶切才能鑒定。對不能確定是普通牛Y2單倍型組還是瘤牛Y3單倍型組的4頭和牛與17頭雜種牛(552 bp)的PCR產(chǎn)物進行SspI酶酶切分析，結(jié)果表明，這21頭牛的PCR產(chǎn)物都不能被SspI酶切開(圖1)，與其PCR產(chǎn)物帶型、大小完全相同。依據(jù)Bonfiglio等[15]的判定標準，則確定這21頭牛均為普通牛Y2單倍型組。

圖1 日本和牛及和秦雜種牛USP9Y基因PCR產(chǎn)物擴增多態(tài)性

(M泳道為D 2000 marker，自上而下依次為2000、1000、750、500、250、100bp)

2.2 牛不同Y染色體單倍型組頻率

對8頭日本和牛和19頭雜交牛中各自所占Y1和Y2單倍型組個體進行頻率統(tǒng)計，結(jié)果顯示：8頭日本和牛中所含Y1和Y2個體分別為4個個體，頻率均為0.50，單倍型多樣度為0.5714±0.0945；而19頭雜交牛中，含Y1和Y2單倍型組個體分別為2頭和17頭，所占頻率分別為0.12和0.88，單倍型多樣度為0.1988±0.1121(表1)。相比而言，日本和牛和雜種牛都含有兩個Y染色體單倍型組，但日本和牛的Y染色體單倍型多樣度相對較高。

表1 日本和牛及和秦雜種牛Y1與Y2單倍型組的頻率與多樣度

3 討論

近年來，圍繞Y染色體分子標記(Y-SNPs和Y-STRs)，國內(nèi)外研究者對家牛進行了廣泛深入的父系遺傳研究，研究一致表明：Y染色體分子標記是追溯家牛起源、馴化歷史和遷徙路線的重要工具，可在一定程度上揭示家牛的父系遺傳多樣性及群體間父系介導(dǎo)的雜交情況，家牛有3種父系起源(即普通牛Y1和Y2單倍型組以及瘤牛Y3單倍型組)，Y-SNPs可以區(qū)分這3種單倍型組，而Y-STRs標記可將Y1、Y2和Y3所具有的豐富的單倍型進行精細區(qū)分[9-16]。然而，對日本和牛的父系遺傳多樣性及遺傳背景的研究報道相對較少。

在本研究中，我們使用Bonfiglio等[15]發(fā)展的檢測技術(shù)對8頭純種日本和牛和19頭和秦F1代雜種進行了單倍型組分析，結(jié)果表明該方法快速有效，省時省力。4頭日本和牛為普通牛Y1單倍型組，其余4頭確定為普通牛Y2單倍型組，頻率均為0.50，表明日本和牛有兩個父系支系，有兩個父系起源，擁有普通牛血統(tǒng)；而19頭F1代雜種中，確定2頭為普通牛Y1單倍型組，其余17頭確定為普通牛Y2單倍型組，頻率分別為0.12和0.88，表明雜種牛也有兩個父系支系，有兩個父系起源，擁有普通牛血統(tǒng)而無瘤牛血統(tǒng)。

在前期基于mtDNA D-loop區(qū)遺傳變異分析中，研究表明日本和牛具有豐富的母系遺傳多樣性，屬普通牛類型[6]。本文的結(jié)果表明日本和牛的父系起源與母系起源是一致的，表明日本和牛是普通牛起源。在本研究中，8頭日本和牛和19頭雜種牛單倍型多樣度分別為0.5714±0.0945和0.1988±0.1121，表明日本和牛具有相對較高的父系遺傳多樣性。這表明從母系和父系遺傳角度來看，日本和牛具有相對較高的分子遺傳多樣性，擁有豐富的遺傳變異信息，遺傳基礎(chǔ)豐富，是改良中國地方黃牛，提高其大理石花紋的最佳終端父本。

[1] Hirooka H. Marbled Japanese Black cattle [J]. Journal of Animal Breeding and Genetics, 2014, 131(1):1-2.

[2] 王立平. 中國首例日本和牛在秦皇島克隆成功[J]. 農(nóng)業(yè)知識, 2009,60(21):9.

[3] 丁進東. 日本和牛胚胎移植的試驗研究[J]. 中國牛業(yè)科學(xué), 2009,35(4):28-30.

[4] 馬平. 引進日本和牛凍精改良本地黃牛效果觀察[J]. 中國牛業(yè)科學(xué), 2014, 40(6):18-19.

[5] 李儒仁, 余群力, 韓玲, 等. 日本和牛與秦川牛雜交牛肝臟營養(yǎng)特性分析[J]. 營養(yǎng)學(xué)報, 2013, 35(5):502-504.

[6] 王建英, 張秀美, 蘭鄒然,等. 渤海黑牛和日本和牛mtDNA D-loop區(qū)遺傳變異研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2009, 14(3):75-82.

[7] Cortez D, Marin R, Toledo-Flores D, et al. Origins and functional evolution of Y chromosomes across mammals[J]. Nature, 2014, 508(7497), 488-493.

[8] Edwards C., Gaillard C., Bradley D, et al. Y-specific microsatellite polymorphisms in a range of bovid species[J]. Animal Genetics, 2000, 31:127-130.

[9] Gtherstrm A., Anderung C., Hellborg L, et al. Cattle domestication in the Near East was followed by hybridization with aurochs bulls in Europe[J]. Proceedings of the Royal Society B:Biological Sciences, 2005, 272(1579):2345-2350.

[10] Li M H, Zerabruk M, Vangen O, et al. Reduced genetic structure of north Ethiopian cattle revealed by Y-chromosome analysis[J]. Heredity, 2007, 98(4):214-221.

[11] Ginja C, Telo da Gama L. Penedo M C T. Y chromosome haplotype analysis in Portuguese cattle breeds using SNPs and STRs[J]. Journal of Heredity, 2009, 100(2):148-157.

[12] Kantanen J, Edwards C J, Bradley D G, et al. Maternal and paternal genealogy of Eurasian taurine cattle (Bos taurus) [J]. Heredity, 2009, 103(5):404-415.

[13] Pérez-Pardal L, Royo L J, Beja-Pereira A, et al. Y-specific microsatellites reveal an African subfamily in taurine (Bos taurus) cattle[J]. Animal Genetics, 2010, 41(3):232-241.

[14] Cortés O, Tupac-Yupanqui I, García-Atance M A, et al. Paternal genetic variability into the Lidia bovine breed [J]. Archivos De Zootecnia, 2011, 60(231):417-420.

[15] Bonfiglio S, De G A, Tesfaye K, et al. A novel USP9Y polymorphism allowing a rapid and unambiguous classification of Bos taurus Y chromosomes into haplogroups[J]. Animal Genetics, 2012, 43(5):611-613.

[16] Li R, Xie W M, Chang Z H, et al. Y chromosome diversity and paternal origin of Chinese cattle[J]. Molecular Biology Reports, 2013, 40(12):6633-6636.

Paternal Origins and Polymorphism of Y ChromosomeUSP9YGene in Japanese Black Cattle

MA Zhi-jie1,2, HUANG Yong-zhen1, DANG Rui-hua1, CHEN Sheng-mei2, LIU Shan-zhai3, CAO Hui4, LIN Qing1, LAN Xian-yong1, ZHANG Qi, CHEN Hong1, LEI Chu-zhao1

( 1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100； 2.AcademyofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,QinghaiUniversity,Xining810016； 3.BozhouComprehensiveExperimentalStation,NationalBeefcattleandYakIndustrialTechnologySystem,Bozhou,Anhui, 236800； 4.ShaanxiQinbaoAnimalhusbandryLimitedcompany,Shaanxi,Baoji, 722300)

[Objective] To explore the genetic polymorphism of Y chromosomeUSP9Ygene and paternal origins in Japanese black cattle. [Method] Using PCR and restriction enzyme digestion method. [Result] The polymorphism of Y chromosomeUSP9Ygene and paternal origins of eight Japanese black cattle and 19 F1 hybrids from the hybridization between male Japanese black cattle and female Qinchuan cattle were analyzed. The results showed that Japanese black cattle and the hybrids indicatedUSP9Ygene polymorphism with PCR products of 471 bp and 552 bp respectively, and the 552 bp PCR products can't be digested bySspIenzyme. Therefore, the above two band types represented Y1 and Y2 cattle haplogroups, respectively, indicating that Japanese black cattle had two patrilineal lineages with two taurine paternal origins. The haplotype diversities of Japanese black cattle and its hybrids were 0.5714 ± 0.0945 and 0.1988±0.1121 respectively, suggesting that Japanese black cattle has relatively high paternal genetic diversity. [Conclusion] Japanese black cattle had high paternal genetic diversity and two taurine paternal origins.

Japanese black cattle；Y chromosome；USP9Y；polymorphism；paternal origin

2016-12-20 接收日期：2017-01-05

國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-38)。

馬志杰(1978-)，男，甘肅省張家川縣人，在讀博士，副研究員，主要從事牦牛遺傳育種研究。

*通訊作者：雷初朝(1968-)，男，湖南常寧人，教授，博導(dǎo)，主要從事黃牛遺傳資源研究。

S823

A

1001-9111(2017)01-0001-03