嚴(yán)春花，吳葉丹，安昌善

·論著·

SU11274逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對厄洛替尼耐藥作用及其機(jī)制研究

嚴(yán)春花，吳葉丹，安昌善*

背景 肝細(xì)胞生長因子(HGF)能夠在體外誘導(dǎo)敏感非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞形成對表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)耐藥，敏感NSCLC對厄洛替尼的耐藥機(jī)制可能與HGF刺激c-Met磷酸化有關(guān)。目的 旨在研究c-Met抑制劑SU11274在逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的裸鼠體內(nèi)敏感NSCLC對厄洛替尼耐藥作用及其機(jī)制。方法 于2014年3月—2015年1月選擇NSCLC細(xì)胞株H292及人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)，通過酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測MRC-5培養(yǎng)上清液中HGF水平，MTT法檢測細(xì)胞增殖情況，應(yīng)用Western blotting法檢測細(xì)胞中c-Met及其下游通道蛋白的變化。建立H292細(xì)胞的裸鼠移植瘤模型，設(shè)對照組(C組)、HGF處理組(H組)、HGF+SU11274處理組(HS組)、HGF+1%二甲基亞砜(DMSO)處理組(HD組)、厄洛替尼處理組(E組)、HGF+厄洛替尼處理組(HE組)、HGF+厄洛替尼+SU11274處理組(HES組)，觀察腫瘤生長情況，測量腫瘤體積，稱取腫瘤質(zhì)量。免疫組織化學(xué)法檢測裸鼠移植瘤組織中c-Met及其下游通道蛋白的變化。結(jié)果 ELISA法檢測結(jié)果顯示，MRC-5培養(yǎng)上清液中HGF水平為(1 262±90)pg/ml。MTT法檢測結(jié)果顯示，H292與MRC-5培養(yǎng)上清液混合培養(yǎng)后，H292在厄洛替尼IC50時的增殖率為97.07%。H292 MRC-5陽性細(xì)胞p-Met、p-STAT3、p-AKT、p-ERK1/2表達(dá)水平高于MRC-5陰性細(xì)胞(P<0.05)。處理方法與時間對腫瘤體積存在交互作用(P<0.001)；處理方法對腫瘤體積主效應(yīng)顯著(P<0.001)；時間對腫瘤體積主效應(yīng)顯著(P<0.001)。其中HES組第7、11、14、18、21、25天腫瘤體積小于HE組(P<0.05)。各組腫瘤質(zhì)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=39.120，P<0.001)；其中HES組腫瘤質(zhì)量小于HE組(P<0.05)。各組c-Met、p-Met、p-STAT3、p-AKT、p-ERK1/2表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中HES組c-Met、p-Met、p-STAT3表達(dá)水平低于HE組(P<0.05)。結(jié)論 MRC-5分泌的HGF能夠在裸鼠體內(nèi)誘導(dǎo)敏感NSCLC細(xì)胞株H292對厄洛替尼產(chǎn)生耐藥，c-Met抑制劑SU11274可逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)敏感NSCLC細(xì)胞株H292對厄洛替尼耐藥，其機(jī)制可能與抑制了HGF活化的c-Met及其下游通道蛋白相關(guān)。

癌，非小細(xì)胞肺；肝細(xì)胞生長因子；原癌基因蛋白質(zhì)c-Met；SU11274；厄洛替尼

嚴(yán)春花，吳葉丹，安昌善.SU11274逆轉(zhuǎn)肝細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對厄洛替尼耐藥作用及其機(jī)制研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2017，20(14)：1707-1711.[www.chinagp.net]

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厄洛替尼為表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKIs)的代表藥物之一，作為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)靶向分子治療藥物，也不可避免地存在原發(fā)性或獲得性耐藥，且其機(jī)制尚不明確。Met及其配體肝細(xì)胞生長因子(HGF)，作為包括NSCLC在內(nèi)的多種惡性腫瘤的重要靶點，其介導(dǎo)的多個生物反應(yīng)促進(jìn)組織重塑、創(chuàng)口修復(fù)、器官平衡和腫瘤轉(zhuǎn)移。SU11274為2003年開發(fā)的靶向c-Met小分子酪氨酸激酶抑制劑，其對腫瘤細(xì)胞的生成、生長、轉(zhuǎn)移和侵襲均有重要作用。本研究旨在探討c-Met抑制劑SU11274逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的敏感NSCLC對EGFR-TKIs產(chǎn)生耐藥的效果及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞株 實驗于2014年3月—2015年1月進(jìn)行，人NSCLC細(xì)胞株H292〔表皮生長因子受體(EGFR)野生型，敏感株〕，由上海市肺科醫(yī)院中心實驗室提供；人胚肺成纖維細(xì)胞(MRC-5)，由上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫提供。雌性、4周齡BALB/c裸鼠〔購自上海斯萊克實驗動物有限公司，許可證號為SCXK(滬)2003-0003〕49只，SPF級，體質(zhì)量為56～65 g，平均體質(zhì)量為(60±5)g。食用食物高壓蒸氣滅菌(45 min，120 ℃)，飲水12～15 ppm，每日維持10 h光照和14 h無光的明暗周期。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇和傳代培養(yǎng) 將H292懸浮液，放入10 ml含10%胎牛血清DMEM的離心管內(nèi)，以1 500 r/min離心5 min，離心半徑6 cm，離心、洗滌3次。吸取細(xì)胞混懸液，5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h，更換培養(yǎng)液孵育2～3 d，換液傳代。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測MRC-5培養(yǎng)上清液中HGF水平 消化細(xì)胞，分別將H292和MRC-5接種于6孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育48 h。取上清液，以1 500 r/min離心5 min，離心半徑6 cm，留取上清液存儲。在酶標(biāo)包被板中加入試劑稀釋液后，加入標(biāo)準(zhǔn)物和細(xì)胞上清液，混勻，封板，室溫孵育2 h。棄去液體，甩干，沖洗。加入酶標(biāo)試劑，室溫孵育1.75 h。棄去液體，甩干，沖洗。加入顯色劑，室溫孵育0.5 h。加入終止液，用酶標(biāo)儀測量波長450 nm處OD值，以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)細(xì)胞上清液的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即為細(xì)胞上清液中HGF水平。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的H292，用胰酶消化，接種于96孔板。24 h后細(xì)胞貼壁，加入100 μl濃度為100 mmol/L的厄洛替尼和MRC-5培養(yǎng)上清液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育72 h，加入MTT，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)并震蕩至完全溶解。測量波長530 nm處OD值，細(xì)胞增殖率=(OD實驗組平均值-OD空白組平均值)/(OD對照組平均值-OD空白組平均值)×100%，其中實驗組為厄洛替尼和MRC-5培養(yǎng)上清液，對照組為厄洛替尼，空白組為空白試劑。實驗重復(fù)3次，取均值。

1.2.4 提取細(xì)胞總蛋白 取5×105個對數(shù)生長期的H292單獨或與MRC-5培養(yǎng)上清液混合接種于6孔板，培養(yǎng)48 h；加入裂解液，在冰上裂解30 min～1 h，收入1.5 ml EP管，振蕩，直至細(xì)胞成黏稠液體；以12 000 r/min離心20 min，離心半徑6 cm，4 ℃冰凍離心，取上清液，-20 ℃保存待測。

1.2.5 BCA蛋白定量 將標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣本添加于96孔板中，加入200 μl BCA工作液，混勻，37 ℃孵育箱中孵育30 min，取出冷卻至室溫；測量波長562 nm處OD值，每孔的OD值扣除空白孔的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算方程，R值需>0.99；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程，計算出樣品的濃度，再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

1.2.6 Western blotting法檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá) 將待測樣本及適量蛋白Marker加入到上樣孔內(nèi)，進(jìn)行電泳。完成后，刮去濃縮膠，轉(zhuǎn)膜。按照不同蛋白的分子量裁剪硝酸纖維素膜(NC膜)，并封閉。孵育一抗，4 ℃搖床過夜。室溫下脫色，搖床上搖動10 min，洗脫，重復(fù)3次。孵育二抗，在室溫?fù)u床上孵育1 h。洗脫3次。將NC膜進(jìn)行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶的分子量，包括c-Met、p-Met、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)、磷酸化STAT3(p-STAT3)、AKT、p-AKT、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。

1.2.7 裸鼠移植瘤模型的建立及藥物抑瘤的分析 當(dāng)裸鼠達(dá)到6周齡時，采用隨機(jī)區(qū)組法分為7組，每組各7只：對照組(C組)、HGF處理組(H組)、HGF+SU11274處理組(HS組)、HGF+1%DMSO處理組(HD組)、厄洛替尼處理組(E組)、HGF+厄洛替尼處理組(HE組)、HGF+厄洛替尼+SU11274處理組(HES組)。C組和E組每只裸鼠右側(cè)肋下皮下分別接種H292細(xì)胞懸液100 μl(密度為5×106個/ml)，H組、HE組每只裸鼠右側(cè)肋下皮下分別接種相同密度H292+MRC-5細(xì)胞懸液混合液100 μl，HS組、HES組每只裸鼠右側(cè)肋下皮下分別接種H292+MRC-5+SU11274細(xì)胞懸液混合液100 μl。當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到4 mm時，C組和H組給予1% Tween-80處理，E組、HE組、HES組接受25 mg·kg-1·d-1的厄洛替尼灌胃，5 d/周，連續(xù)4周。每3～4 d(第4、7、11、14、18、21、25天)測量1次腫瘤體積，腫瘤體積=腫瘤長徑×腫瘤短徑2/2，并繪制腫瘤生長曲線。給藥結(jié)束后，處死裸鼠，并剝離腫瘤組織，稱取腫瘤質(zhì)量。

1.2.8 免疫組織化學(xué)檢測 將剝離的腫瘤組織固定、包埋，制成石蠟切片。將石蠟切片脫蠟、水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后孵育切片30 min，洗滌3次。將石蠟切片抗原修復(fù)，洗滌3次。5%羊血清，室溫孵育30 min。棄去羊血清，洗滌3次后加入一抗，放入濕盒中室溫1 h，4 ℃過夜。倒掉一抗，PBS沖洗5次。加入二抗后室溫孵育2 h，PBS沖洗5次?？焖偌尤攵?lián)苯胺(DAB)，孵育約5 min，PBS沖洗3次。加入蘇木素染液，再用PBS返藍(lán)5 min，脫水，透明，中性樹膠封固。將所有切片照相，每組選取10張照片，所有照片用IPP 6.0圖像分析軟件進(jìn)行定量分析。記錄c-Met、p-Met、STAT3、p-STAT3、AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1MRC-5分泌HGF水平ELISA法檢測結(jié)果顯示，H292培養(yǎng)上清液中均未檢測到HGF，MRC-5培養(yǎng)上清液中HGF水平為(1 262±90)pg/ml。

2.2MRC-5培養(yǎng)上清液中HGF對NSCLC細(xì)胞增殖率的影響MTT法檢測結(jié)果顯示，厄洛替尼對H292的IC50為(0.17±0.05)μmol/L，當(dāng)與MRC-5培養(yǎng)上清液混合培養(yǎng)后，H292在厄洛替尼IC50時的增殖率為97.07%。

2.3MRC-5培養(yǎng)上清液中HGF對c-Met及其下游通道蛋白的影響Westernblotting法檢測結(jié)果顯示，H292MRC-5陰性和陽性細(xì)胞c-Met、STAT3、AKT、ERK1/2、GAPDH表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；H292MRC-5陰性和陽性細(xì)胞p-Met、p-STAT3、p-AKT、p-ERK1/2表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.4 各組腫瘤體積比較 處理方法與時間對腫瘤體積存在交互作用(P<0.001)；處理方法對腫瘤體積主效應(yīng)顯著(P<0.001)；時間對腫瘤體積主效應(yīng)顯著(P<0.001)。其中E組第7、11、14、18、21、25天腫瘤體積大于C組；HE組第7、11天腫瘤體積大于E組，第14、18、21、25天腫瘤體積小于H組，大于E組；HES組第7、11、14、18、21、25天腫瘤體積小于HS組和HE組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.5 各組腫瘤質(zhì)量比較C組腫瘤質(zhì)量為(920±122)mg，H組腫瘤質(zhì)量為(979±176)mg，HS組腫瘤質(zhì)量為(1 031±88)mg，HD組腫瘤質(zhì)量為(1 088±130)mg，E組腫瘤質(zhì)量為(389±109)mg，HE組腫瘤質(zhì)量為(564±176)mg，HES組腫瘤質(zhì)量為(411±43)mg。各組腫瘤質(zhì)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=39.120，P<0.001)；其中E組腫瘤質(zhì)量小于C組；HE組腫瘤質(zhì)量小于H組，大于E組；HES組腫瘤質(zhì)量小于HS組和HE組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.6 各組c-Met及其下游蛋白表達(dá)情況c-Met、p-Met定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。STAT3定位于細(xì)胞質(zhì)，p-STAT3定位于細(xì)胞核。AKT、p-AKT定位于細(xì)胞質(zhì)。ERK1/2定位于細(xì)胞質(zhì)，p-ERK1/2定位于細(xì)胞核。各組STAT3、AKT、ERK1/2表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組c-Met、p-Met、p-STAT3、p-AKT、p-ERK1/2表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

Table1Comaprisonofexpressionlevelsofc-MetanditsdownstreamsignalingproteinsintheculturesupernatantsofH292cellswithandwithoutMRC-5cells

細(xì)胞c-Metp-MetSTAT3p-STAT3AKTp-AKTERK1/2p-ERK1/2GAPDHMRC-5陰性44020±547633743±245793270±349941957±532362183±489851663±172453074±445632980±513867194±9737MRC-5陽性44139±556446937±136682299±640385269±671965557±203765673±474154793±308546392±543665157±6758t值0.1228.1292.60411.6500.9937.5651.0223.1061.159P值0.9140.0010.0600.0070.4250.0170.3540.0360.366

注：MRC-5=人胚肺成纖維細(xì)胞，STAT3=信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3，p-STAT3=磷酸化STAT3，ERK1/2=細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶，p-ERK1/2=磷酸化ERK1/2，GAPDH=甘油醛-3-磷酸脫氫酶

表2 各組不同時間腫瘤體積比較

注：與C組比較，aP<0.05；與H組比較，bP<0.05；與HS組比較，cP<0.05；與E組比較，dP<0.05；與HE組比較，eP<0.05

表3 各組c-Met及其下游通道蛋白表達(dá)水平比較±s，n=7)

注：與C組比較，aP<0.05；與H組比較，bP<0.05；與HS組比較，cP<0.05；與HD組比較，dP<0.05；與E組比較，eP<0.05；與HE組比較，fP<0.05

3 討論

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，促進(jìn)了靶向藥物治療NSCLC的發(fā)展[1]。其中包括單克隆抗體和小分子抑制劑等許多新的藥物，目前部分已經(jīng)被批準(zhǔn)用于NSCLC的治療。

多個臨床試驗表明，厄洛替尼等第一代可逆性EGFR-TKIs以及阿法替尼(afatinib)等第二代不可逆性EGFR-TKIs，可通過與EGFR共價結(jié)合，阻礙EGFR自身磷酸化，抑制其下游通道激活，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的生長和腫瘤的血管生成，延長NSCLC患者的無進(jìn)展生存期(PFS)[2-3]。TKIs在單獨或聯(lián)合治療NSCLC患者中可有效阻止EGFR和c-Met[4]。厄洛替尼對非選擇性NSCLC患者的有效率約為20%，80%的NSCLC患者對EGFR-TKIs耐藥[5]。因此，闡明TKI產(chǎn)生獲得性耐藥機(jī)制尤為重要。

有研究表明，26%～40%的肺癌患者伴HGF高表達(dá)及EGFR-T790M繼發(fā)突變，5%～33%的肺癌患者伴MET基因擴(kuò)增和EGFR-T790M繼發(fā)突變，4%～7%的肺癌患者伴HGF高表達(dá)及MET基因擴(kuò)增，表明HGF/MET及EGFR-T790M繼發(fā)突變?yōu)镋GFR-TKIs耐藥產(chǎn)生的重要靶點[6-7]。

研究發(fā)現(xiàn)，HGF/c-Met信號通路參與EGFR-TKIs的獲得性耐藥形成[8]。c-Met作為受體酪氨酸激酶家族的一員，與其特異性配體HGF相結(jié)合，可激活細(xì)胞內(nèi)MAPK、PI3K/AKT和c-Src/FAK、STAT信號通路[9]。雖然EGFR-TKIs能夠有效阻斷EGFR及其下游信號通道，HGF卻能夠激活c-Met及其下游信號通道，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及腫瘤血管生成并轉(zhuǎn)移。

本研究向H292加入含有HGF的MRC-5，再加入厄洛替尼抑制H292，結(jié)果顯示H292增殖率明顯提高。并且在H292細(xì)胞液中加入MRC-5細(xì)胞液后，MRC-5細(xì)胞培養(yǎng)液中的HGF能夠磷酸化H292細(xì)胞中c-Met及其下游蛋白的表達(dá)。表明MRC-5能夠分泌高濃度HGF，并且其分泌的HGF能夠影響H292內(nèi)蛋白表達(dá)。由此，本研究將MRC-5和H292混合種植于裸鼠皮下，建立HGF誘導(dǎo)的H292耐藥模型。通過對腫瘤生長的各階段觀察并稱取腫瘤質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)厄洛替尼能夠有效抑制H292移植瘤的生長，但是對HGF+厄洛替尼+SU11274處理組的抑制作用明顯高于HGF+厄洛替尼處理組，與單純厄洛替尼處理組無差異，說明SU11274能夠明顯改善由HGF誘導(dǎo)的敏感NSCLC細(xì)胞對厄洛替尼的耐藥形成。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，厄洛替尼處理組、HGF+SU11274處理組和HGF+厄洛替尼+SU11274處理組的p-Met、p-STAT3、p-AKT、p-ERK1/2表達(dá)均降低，低于HGF處理組、HGF+1%DMSO處理組和HGF+厄洛替尼處理組，表明厄洛替尼在HGF高表達(dá)的環(huán)境下不能抑制H292內(nèi)c-Met、AKT、STAT3、ERK1/2的活化，但在無HGF或HGF高表達(dá)，聯(lián)合SU11274處理時，則能夠明顯抑制H292內(nèi)c-Met、AKT、STAT3、ERK1/2活化。進(jìn)一步證實SU11274能夠抑制HGF誘導(dǎo)激活c-Met以及其下游通道的蛋白c-Met、STAT3、AKT、ERK1/2的磷酸化。

作為現(xiàn)代腫瘤學(xué)中的新領(lǐng)域，EGFR-TKIs在NSCLC的治療中，有著不可替代的重要意義。其治療成功與否，依賴于準(zhǔn)確地識別腫瘤的致癌途徑，并有效抑制其惡性狀態(tài)。關(guān)于HGF/MET豐富的生物學(xué)基礎(chǔ)已啟動準(zhǔn)確評估致癌潛力及開發(fā)強(qiáng)效選擇性抑制劑的通路。本研究通過在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建耐藥模型，并給予SU11274干預(yù)，證實其可抑制c-Met以及其下游通道蛋白c-Met、STAT3、AKT、ERK1/2的磷酸化，從而逆轉(zhuǎn)HGF誘導(dǎo)的敏感NSCLC細(xì)胞株對厄洛替尼耐藥，有望為NSCLC的治療提供新途徑。

作者貢獻(xiàn)：嚴(yán)春花、安昌善進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計、研究的實施與可行性分析、論文的修訂、對文章整體負(fù)責(zé)；嚴(yán)春花、吳葉丹進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計學(xué)處理；嚴(yán)春花進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋、撰寫論文；安昌善負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：賈萌萌)

Mechanism of SU11274 Reversing the Resistance to Erlotinib Induced by Hepatocyte Growth Factor in Non-small Cell Lung Cancer Cells

YANChun-hua，WUYe-dan,ANChang-shan*

DepartmentofRespiratoryMedicine,AffiliatedHospitalofYanbianUniversity，Yanji133000，China

*Correspondingauthor:ANChang-shan,Chiefphysician,Professor;E-mail：cs_an2003@aliyun.com

Background Hepatocyte growth factor(HGF) can induce non-small cell lung cancer(NSCLC) cells exerting resistance to epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors(EGFR-TKIs)in vitro,suggesting that HGF induced c-Met phosphorylation may be associated with the mechanism of erlotinib resistance in sensitive NSCLC.Objective The study aimed to demonstrate that c-Met inhibitor SU11274 can reverse the erlotinib resistance induced by HGF in sensitive NSCLC cells in nude mice.Methods This study was conducted from March 2014 to January 2015.Two cell lines including H292 and human embryonic fibroblast MRC-5 were chosen.The HGF produced by MRC-5 cells in cell culture supernatants was quantitated by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).The proliferation of H292 cells was measured by using MTT assay and the expressions of c-Met and its downstream signaling proteins were examined by Western blotting.We selected forty-nine 6-week old nude mice and equally divided them into 7 groups,group C (control group),group H,group HS,group HD,group E,group HE,group HES,treated with H292 cell suspension,HGF,HGF+SU11274,HGF+1% DMSO,erlotinib,HGF+erlotinib,HGF+erlotinib+SU11274,respectively.The tumor growth was observed and the growth curve was drawn.The tumor weight was recorded.The expressions of c-Met and downstream signaling proteins in tumor tissues were determined via immunohistochemistry.Results ELISA assay found that the HGF level in the culture supernatant of MRC-5 cells was (1 262±90) pg/ml.MTT assay showed that in the mixture of H292 and MRC-5 cells culture supernatant with erlotinib concentration of IC50,the proliferation of H292 cells was 97.07%.The expressions of p-Met,p-STAT3,p-AKT and p-ERK1/2 in the culture supernatant of H292 with MRC-5 cells were higher than those in the H292 cell culture supernatant(P<0.05).Intervention method and duration exerted significant interaction effects on the tumor volume(P<0.001).Intervention method produced main effect on the tumor volume(P<0.001).Intervention duration had main effect on the tumor volume(P<0.001).The tumor volume was smaller in HES group than in HE group measured on the 7th,11th,14th,18th,21st and 25th days of intervention (P<0.05).The tumor mass differed significantly between the groups(F=39.120，P<0.001).HES group had less tumor mass than HE group did(P<0.05).Significant differences in the expressions of c-Met,p-Met,p-STAT3,p-AKT and p-ERK1/2 were found between the groups(P<0.05).The expressions of c-Met,p-Met,and p-STAT3 proteins were lower in HES group than those in HE group(P<0.05).Conclusion HGF secreted by MRC-5 induces erlotinib resistance in H292 cells in nude mice.c-Met inhibitor SU11274 reverses the resistance of HGF-induced sensitive NSCLC cells to erlotinib in vivo.The mechanism may be related to the inhibition of HGF-induced activation of c-Met and its signaling pathway proteins.

Carcinoma,non-small-cell lung;Hepatocyte growth factor;Proto-oncogene proteins c-Met;SU11274;Erlotinib

國家自然科學(xué)基金資助項目(81160291)

R 730.26

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.14.012

2016-11-18；

2017-02-16)

133000吉林省延吉市，延邊大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科

*通信作者：安昌善，主任醫(yī)師，教授；E-mail：cs_an2003@aliyun.com