黃平，蔣錦杏，徐璇，陳麗

?

紅景天苷對膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

黃平，蔣錦杏，徐璇，陳麗

深圳市人民醫(yī)院，廣東深圳 518020

目的 觀察紅景天苷對膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，探討其誘導(dǎo)U87-MG細(xì)胞凋亡機(jī)制。方法 不同濃度紅景天苷和喜樹堿加入U87-MG細(xì)胞中，作用24 h后，MTT法測定U87-MG細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測U87-MG細(xì)胞凋亡率，Transwell法檢測U87-MG細(xì)胞侵襲能力，間接熒光標(biāo)記法測定細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平，Western blot檢測U87-MG細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2、Bax、E-cadherin、N-cadherin和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達(dá)。結(jié)果 與空白對照組比較，各給藥組U87-MG細(xì)胞生長抑制作用明顯，10、50、100 μg/mL紅景天苷作用U87-MG細(xì)胞后，細(xì)胞侵襲能力顯著下降，10、50、100 μg/mL紅景天苷作用U87-MG細(xì)胞48 h后均能誘導(dǎo)U87-MG細(xì)胞凋亡；ROS水平與紅景天苷濃度呈正相關(guān)；10、50、100 μg/mL紅景天苷上調(diào)Caspase-3、Bax和E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2和N-cadherin和MMP-9的表達(dá)。結(jié)論 紅景天苷可誘導(dǎo)U87-MG細(xì)胞凋亡、抑制U87-MG細(xì)胞的侵襲能力。

紅景天苷；膠質(zhì)瘤U87-MG細(xì)胞；細(xì)胞增殖；活性氧；Caspase-3；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

腦膠質(zhì)瘤在臨床上多呈惡性，其容易局部擴(kuò)散，治療比較困難且易復(fù)發(fā)，大多數(shù)患者預(yù)后不良[1]。近年來，隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步及學(xué)科間的不同領(lǐng)域交叉融合，特別是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)理念的不斷深入，膠質(zhì)瘤治療手段取得極大的進(jìn)步，逐漸形成了一套比較完整的治療體系[2-3]。臨床上普遍采用以手術(shù)切除為基礎(chǔ)，結(jié)合放療、化療、免疫、分子靶向等綜合治療策略，這其中包括臨床常用的化療藥物替莫唑胺，但其存在一定的毒副作用和耐藥性，所以，在低毒性的前提下提高化療藥物的藥效顯得尤為重要。

紅景天苷（salidroside）提取自紅景天全草或根莖，是紅景天的主要生物活性成分之一，具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒等多種生物活性[4-6]。但目前尚未見文獻(xiàn)對紅景天苷的抗膠質(zhì)瘤機(jī)制進(jìn)行探討。因此，本實驗以紅景天苷為活性物質(zhì)，通過體外和細(xì)胞實驗初步觀察紅景天苷對膠質(zhì)瘤系U87-MG細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，并探討紅景天苷抗血管生成信號通路的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系

正常腦細(xì)胞和腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87-MG，基爾頓生物科技（上海）有限公司，本實驗室進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 藥物及制備

紅景天苷、喜樹堿（20 mg，分析標(biāo)準(zhǔn)品），阿拉丁試劑（上海）有限公司，藥物用pH 6.8 PBS配制濃度為1000 μg/mL藥液。

1.3 主要試劑與儀器

Caspase-GlooR3試劑盒、非放射性NF-κB EMSA試劑盒，Sigma-aldrich（上海）貿(mào)易有限公司；MTT，上海生工生物工程有限公司；小牛血清，杭州四季青生物試劑公司；胰蛋白酶、RPMI-1640培養(yǎng)基，美國GIBCO公司；FITC/PI雙染試劑盒，碧云天生物試劑公司。酸度計（上海雷磁儀器廠），CO2培養(yǎng)箱（美國REVCO公司），流式細(xì)胞儀（美國BectonDikinson公司），酶聯(lián)免疫檢測儀（芬蘭Labsystems公司），酶聯(lián)檢測儀（美國Bio-Rad公司）。

1.4 U87-MG細(xì)胞增殖檢測

取200 μL/孔對數(shù)生長期U87-MG細(xì)胞（1×105/孔）接種于96孔板中，進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，分別加入紅景天苷和喜樹堿（10、50、100 μg/mL）培養(yǎng)基，設(shè)空白對照組，每個藥物3個平行孔。分別培養(yǎng)24 h，每孔加5 mg/mL MTT試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。將培養(yǎng)基吸出，加150 μL DMSO試劑，充分振蕩后，充分溶解結(jié)晶，于570 nm處測定各孔吸光度（OD），計算細(xì)胞活力。細(xì)胞活力（%）＝實驗組OD值÷空白對照組OD值×100%。

1.5 U87-MG細(xì)胞侵襲能力測定

Transwell小室濾膜內(nèi)表面涂細(xì)胞外基質(zhì)膠，小室干燥后重新加入含有0.1%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基水化。4.0×105/mL重懸浮細(xì)胞在Transwell小室下室中加入新鮮10%胎牛血清培養(yǎng)基，上室中加入紅景天苷和喜樹堿（10、50、100 μg/mL）培養(yǎng)基，設(shè)定空白對照組，每個藥物設(shè)3個平行孔，培養(yǎng)24 h，每孔中加100 μL細(xì)胞懸浮液。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)24 h。取出小室后，PBS溶液沖洗濾膜，PBS棉棒吸除和擦除上室的細(xì)胞，再根據(jù)Transwell小室使用說明進(jìn)行染色觀察，計算穿膜細(xì)胞數(shù)，從而反映各組細(xì)胞的侵襲能力。實驗重復(fù)3次。

1.6 U87-MG細(xì)胞凋亡檢測

將對數(shù)生長期U87-MG細(xì)胞以1×105/孔接種于96孔板中，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，分別加入0、10、50、100 μg/mL紅景天苷培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞PBS重新懸浮細(xì)胞，先加5 μL FITC-Annexin V避光染色5 min，再加10 μL PI避光染色15 min，室溫避光孵育15 min。流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 U87-MG細(xì)胞活性氧檢測

U87-MG細(xì)胞接種后，恒溫、恒濕培養(yǎng)24 h后，分別加入紅景天苷（10、50、100 μg/mL）的培養(yǎng)基，設(shè)3個平行組。加入400 μL DCFH-DA 10 μg/mL，充分混勻后，避光孵育15 min。PBS沖洗去除細(xì)胞外熒光劑。PBS重懸細(xì)胞10 min后對熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測。

1.8 U87-MG細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2、Bax、E-cadherin、N-cadherin和基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)檢測

收集對數(shù)生長期U87-MG細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的空白對照組和紅景天苷組處理24 h，進(jìn)行各組細(xì)胞總蛋白的提取，通過Bradford方法調(diào)整相同的蛋白濃度后進(jìn)行電泳，獲得根據(jù)分子量分離的蛋白條帶，按照Western blot顯像試劑盒指導(dǎo)說明進(jìn)行，蛋白NC膜電轉(zhuǎn)，進(jìn)行蛋白封閉和一抗結(jié)合，一抗結(jié)合后洗脫，再行二抗孵育標(biāo)記兔抗大鼠的多克隆抗體。ECL試劑盒顯色后，暗室發(fā)光拍照，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗結(jié)果以±表示，多組間比較采用方差分析和兩樣本檢驗。＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅景天苷對U87-MG細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

與空白對照組比較，各給藥組細(xì)胞活力和侵襲能力下降（＜0.05，＜0.01），且呈濃度依賴性。結(jié)果見表1、圖1。

2.2 紅景天苷對U87-MG細(xì)胞凋亡的影響

隨紅景天苷組濃度的增加（10、50、100 μg/mL），U87-MG細(xì)胞凋亡率不斷增加，且呈劑量依賴性，當(dāng)紅景天苷濃度增加到100 μg/mL時，細(xì)胞凋亡率為（58.40±2.33）%，誘導(dǎo)U87-MG細(xì)胞凋亡的作用增強(qiáng)。結(jié)果見圖2。

表1 各組U87-MG細(xì)胞增殖和侵襲能力比較（±s，%）

注：與空白對照組比較，*＜0.05，**＜0.01

空白對照組紅景天苷10 μg/mL組 紅景天苷50 μg/mL組紅景天苷100 μg/mL組

圖1 紅景天苷對U87-MG細(xì)胞侵襲能力的影響（剛果紅染色，×100）

空白對照組紅景天苷10 μg/mL組 紅景天苷50 μg/mL組紅景天苷100 μg/mL組

圖2 各組U87-MG細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞圖

2.3 紅景天苷對U87-MG細(xì)胞活性氧水平的影響

與空白對照組比較，細(xì)胞內(nèi)ROS水平隨喜樹堿濃度的增加變化不明顯，而隨紅景天苷濃度的增加而增加，當(dāng)紅景天苷濃度增加至100 μg/mL時ROS水平最高（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組U87-MG細(xì)胞ROS水平比較（±s，%）

注：與空白對照組比較，*＜0.05，**＜0.01

2.4 紅景天苷對U87-MG細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，隨著紅景天苷濃度的增加，Caspase-3和Bax的表達(dá)呈不斷增加的趨勢，Bcl-2的表達(dá)呈不斷減少的趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見表3、圖3。

表3 各組U87-MG細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2和Bax水平比較（±s）

注：與空白對照組比較，*＜0.05，**＜0.01

A B C D Caspase-317 kD Bcl-228 kD Bax21 kD GAPDH37 kD

注：A. 空白對照組；B.紅景天苷10 μg/mL組； C.紅景天苷50 μg/mL組；D.紅景天苷100 μg/mL組

圖3 各組U87-MG細(xì)胞Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)免疫印跡圖

2.5 紅景天苷對U87-MG細(xì)胞侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白對照組比較，隨著紅景天苷濃度的增加，E-cadherin表達(dá)呈不斷增加的趨勢，N-cadherin和MMP-9表達(dá)呈不斷減少的趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見表4、圖4。

表4 各組U87-MG細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin和MMP-9水平比較（±s）

注：與空白對照組比較，*＜0.05，**＜0.01

A B C D E-cadherin135 kD N-cadhein140 kD MMP-9 92 kD GAPDH 37 kD

注：A. 空白對照組；B.紅景天苷10 μg/mL組； C.紅景天苷50 μg/mL組；D.紅景天苷100 μg/mL組

圖4 各組U87-MG細(xì)胞E-cadherin、N-cadherin和MMP-9蛋白表達(dá)免疫印跡圖

3 討論

信號通路的下放與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移息息相關(guān)，眾多癌癥預(yù)后不良反應(yīng)均與腫瘤喜好通路有關(guān)，同時腫瘤組織也會通過內(nèi)源性因子的調(diào)控促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。因此，阻截信號通路下放已成為腫瘤靶向治療的重要手段之一。凋亡是由多種基因嚴(yán)格調(diào)控的過程，如Caspase和Bcl-2家族等。Caspase-3是各凋亡通路的靶蛋白[7]，凋亡途徑被激活后，引起相應(yīng)的Caspase蛋白表達(dá)的改變，最終將激活Caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本實驗結(jié)果顯示，紅景天苷能參與并影響Caspase-3級聯(lián)凋亡途徑反應(yīng)的誘導(dǎo)凋亡通路的表達(dá)。線粒體信號途徑是線粒體上游信號分子作用于線粒體膜，Bcl-2蛋白活化形成蛋白通道，線粒體PT孔開放，凋亡活性物質(zhì)釋放引起下游Caspase-3蛋白活化并作用于相應(yīng)底物引起細(xì)胞凋亡。Bcl-2是Caspase的上游信號，其中Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2是抗凋亡蛋白。本實驗結(jié)果顯示，紅景天苷參與并下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，增強(qiáng)Bax的表達(dá)，使Bcl-2/Bax比值降低。因此，細(xì)胞凋亡可能通過線粒體途徑實現(xiàn)的，這與張艷等[8]研究阿魏酸對人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的Caspase-3、Bax和Bcl-2的表達(dá)影響趨勢一致。

MMP-9作為MMP家族中的一員，能通過降解層黏連蛋白和Ⅳ、Ⅴ型膠原等成分來對腫瘤細(xì)胞基底膜成分造成破壞，因此，MMP-9在細(xì)胞侵襲中發(fā)揮關(guān)鍵作用。N-cadherin通過降低腫瘤細(xì)胞間的黏附性，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和侵襲率增加，而E-cadherin的下調(diào)會影響腫瘤細(xì)胞間的連接穩(wěn)定性，促使腫瘤細(xì)胞侵襲的發(fā)生[9]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紅景天苷能誘導(dǎo)E-cadherin表達(dá)的增加，N-cadherin和MMP-9表達(dá)的降低。因此，紅景天苷既可通過抑制MMP-9和N-cadherin的表達(dá)，破壞細(xì)胞間和基底膜黏附性的能力，又可通過上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞間的穩(wěn)定性，進(jìn)一步抑制U87-MG細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

本研究考察了不同濃度紅景天苷對細(xì)胞內(nèi)ROS的影響，發(fā)現(xiàn)紅景天苷可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的上升，而ROS是由細(xì)胞內(nèi)氧代謝或外源性氧化劑產(chǎn)生的具有生物活性的氧分子，其在啟動和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中具有著重要的作用[10-12]。本實驗中未發(fā)現(xiàn)喜樹堿引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平的上升，表明紅景天苷可促進(jìn)ROS誘導(dǎo)U87-MG細(xì)胞的凋亡。

[1] 戴宜武,王振光,秦家振.腦膠質(zhì)瘤治療進(jìn)展[J].中華臨床醫(yī)師雜志, 2013,7(7)：6225-6228.

[2] GROOT M，DOUW L，SIZOO E M，et al. Levetiracetam improves verbal memory in high-grade glioma patients[J]. Neuro-oncology,2013, 15(2)：216-223.

[3] MANNAS J P, LIGHTNER D D, DEFRATES S R, et al. Long-term treatment with temozolomide in malignant glioma[J]. J Clin Neurosci,2014, 21(1)：121-123.

[4] 祁存芳,張軍峰,陳新林,等.紅景天苷通過抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)保護(hù)缺氧對培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的損傷[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2013,33(7)：962-966.

[5] 陳剛,黃曉軍,呂伯東,等.紅景天苷對低氧環(huán)境下大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞α-肌動蛋白和骨橋蛋白表達(dá)的影響[J].中華男科學(xué)雜志, 2013,19(8)：727-731.

[6] HAN T. Effects of salidroside pretreatment on expression of tumor necrosis factor-alpha and permeability of blood brain barrier in rat model of focal cerebralischemia-reperfusion injury[J]. Asian Pac J Trop Med,2013,6(2)：156-158.

[7] 孔亞,王佳佳,盧宗亮,等.桔梗皂苷D誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞凋亡[J].中國腫瘤生物治療雜志,2016,23(3)：261-265.

[8] 張艷,李海龍,王虎平,等.阿魏酸對人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2016,23(9)：70-73.

[9] 常琳琳,朱虹,鄭琳,等.E-cadherin在腫瘤治療中的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)進(jìn)展,2015,39(10)：754-760.

[10] 劉儀,王凱,王介非.氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制[J].中華臨床感染病雜志,2008,1(3)：123-126.

[11] 劉小敏,王曉娟,張楊,等.活性氧改變在PIG11高表達(dá)誘導(dǎo)人肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡中的作用[J].腫瘤,2009,29(12)：1116-1119.

[12] SEPúLVEDA M, GONANO L A, BACK T G, et al. Role of CaMKⅡ and ROS in rapid pacing-induced apoptosis[J]. Journal of Molecular & Cellular Cardiology,2013,63(2)：135-145.

Effects of Salidroside on Proliferation and Invasive Ability of Glioma U87-MG Cells

HUANG Ping, JIANG Jin-xing, XU Xuan, CHEN Li

Objective To investigate the effects of salidroside on proliferation and invasive ability of glioma U87-MG cells; To discuss the its mechanism to induce apoptosis of U87-MG cells. Methods U87-MG cells were cultured in vitro for 24 h under different concentrations of salidroside and camptothecin. The proliferation of U87-MG cells was detected by MTT assay. The apoptosis rate of U87-MG cells was detected by flow cytometry. Transwell assay was used to detect the invasive ability of U87-MG cells. ROS was detected by indirect fluorescent labeling. The expressions of Caspase-3, Bcl-2, Bax, E-cadherin, N-cadherin and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) in U87-MG cells were detected by Western blot. Results Compared with the blank control group, U87-MG cells had significant inhibitory effect on the growth of U87-MG cells in each administration group, and the invasive ability of U87-MG cells was significantly reduced after 10, 50, 100 μg/mL salidroside was intervened, and 10, 50, 100 μg/mL salidroside for 48 h for U87-MG cells could induce apoptosis of the cells; the level of ROS was positively correlated with the concentration of salidroside; 10, 50, 100 μg/mL salidroside up-regulated the expressions of Caspase-3, Bax and E-cadherin, and down-regulated the expressions of Bcl-2, N-cadherin and MMP-9. Conclusion Salidroside can induce apoptosis of U87-MG cells and inhibit the invasive ability of U87-MG cells.

salidroside; glioma U87-MG cells; proliferation; ROS; Caspase-3; MMP-9

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.016

R285.5

A

1005-5304(2017)06-0064-04

（2016-08-17）

（修回日期：2016-09-18；編輯：華強(qiáng)）