姚佳俊，李 忠，梁宏偉，羅相忠，王 丹，鄒桂偉

(1.華中農業(yè)大學水產學院，武漢 430070；2.中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223)

長豐鯽c型溶菌酶基因的克隆及其在細菌感染條件下的表達分析

姚佳俊1,2，李 忠2，梁宏偉2，羅相忠2，王 丹2，鄒桂偉2

(1.華中農業(yè)大學水產學院，武漢 430070；2.中國水產科學研究院長江水產研究所，武漢 430223)

為了解c型溶菌酶基因與長豐鯽(ChangFengCarassiusauratus)的抗菌效應關系，本研究利用同源克隆方法獲得長豐鯽c型溶菌酶基因cDNA全長序列。結果顯示：c型溶菌酶基因全長698 bp，包括5′端非翻譯區(qū)60 bp，3′端非翻譯區(qū)200 bp，開放閱讀框438 bp，編碼145個氨基酸。長豐鯽c型溶菌酶基因在腎臟組織中表達量最大，在脾臟、腸道、心臟和腦中大量表達，在肝臟和鰓中表達量相對較低，在皮膚和肌肉中幾乎不表達。長豐鯽在感染遲鈍愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌后，在肝臟、腎臟、脾臟和鰓等組織中基因表達量均發(fā)生顯著變化，出現(xiàn)不同程度的上調。感染遲鈍愛德華氏菌后，在脾臟中的上調幅度最大，其次為鰓、肝臟和腎臟；感染嗜水氣單胞菌后，在脾臟中上調程度最大，其次是鰓；感染金黃色葡萄球菌后，在脾臟中上調幅度最大。在肝臟和腎臟中，經金黃色葡萄球菌刺激后c型溶菌酶基因的上調幅度最高；在脾臟和鰓中，經嗜水氣單胞菌感染后c型溶菌酶基因上調幅度最高。三種刺激后，c型溶菌酶基因升高幅度的不同，說明不同刺激使魚體組織產生的應激反應能力不同。

長豐鯽(ChangFengCarassiusauratus)；c型溶菌酶基因；克隆；表達分析；抗細菌效應

溶菌酶根據其來源與氨基酸序列差異可分為6類：雞蛋清溶菌酶、鵝溶菌酶、細菌溶菌酶、無脊椎動物溶菌酶、植物溶菌酶和噬菌體溶菌酶[1]。其中，c型溶菌酶在脊椎動物與無脊椎動物中均有存在[2]。目前在圓鲆(Bothusassimilis)、塞內加爾鰨(Soleasenegalensis)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、鯉(Cyprinuscarpio)和斑馬魚(Barchydanioreriovar)等魚類中均有研究報道[3,4]。

溶菌酶在魚類非特異免疫研究中具有重要作用，溶菌酶通過破壞細菌細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4糖苷鍵，使細胞壁不溶性粘多糖分解成可溶性糖肽，導致細胞壁破裂，從而使革蘭氏陽性細菌溶解；也可以通過與一些陽離子乳鐵蛋白、防御素、抗菌肽等協(xié)同作用，溶解革蘭氏陰性細菌的外壁脂多糖[5]。研究表明：草魚(Ctenopharyngodonidellus)和塞內加爾鰨c型溶菌酶在各組織均有表達，其中草魚頭腎中表達量最高，塞內加爾鰨皮膚和鰓的表達量較高。菱鲆(Scophthalmusrhombus)c型溶菌酶在肝臟和胃中的表達量較高[4,6-7]。斑點叉尾(IetalurusPunetaus)和牙鲆經愛德華氏菌刺激后，脾臟和頭腎等組織中c型溶菌酶基因表達量均升高[8,9]，淇河鯽(QiheCarassiusauratus)經嗜水氣單胞菌刺激后，c型溶菌酶基因在肝臟和脾臟中表達量上升，在鰓中的表達量先上升后下降[10]，研究結果表明魚類受到外界刺激時，c型溶菌酶基因會引起機體產生非特異性免疫反應。

長豐鯽(ChangFengCarassiusauratus)是我國第一個通過全國水產原種和良種審定委員會審定的四倍體異育銀鯽新品種(品種登記號：GS-04-001-2015)。作為一個養(yǎng)殖新品種，其對細菌性疾病的抵抗力如何也是一個十分重要的性能指標。因此，本研究以長豐鯽為實驗對象，對長豐鯽c型溶菌酶進行了基因克隆，從分子水平上研究其結構和功能，分析在感染細菌條件下肝臟、腎臟、脾臟和鰓中的表達變化特征，研究長豐鯽的抗細菌效應，為探討長豐鯽抗細菌性疾病能力提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗魚

實驗魚均為健康無病無傷的長豐鯽(150±0.5) g，取自中國水產科學研究院長江水產研究所荊州基地窯灣試驗場。

1.1.2 實驗魚處理

隨機將實驗魚分為三個實驗組和一個對照組，每組60尾，暫養(yǎng)兩周。根據預實驗結果，對實驗魚進行遲鈍愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌的感染實驗，注射濃度分別為2.2×106， 6.0×107，4.5×105cfu/mL，150 μL，對照組注射等量0.9%的生理鹽水，維持水溫(28±2) ℃，持續(xù)增氧。實驗開始前，隨機選取5尾魚取皮膚，肌肉，肝臟，腎臟，脾臟，鰓，腦，心臟和腸等組織用于 c型溶菌酶基因的組織表達分析，實驗開始后0、6、12、24、48、72、96、120 h取肝臟、腎臟、脾臟、鰓等組織迅速放入液氮中，用于后續(xù)研究。

1.1.3 實驗菌株

遲鈍愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌菌種均由中國水產科學研究院長江水產研究所魚類病害研究室提供。

1.1.4 實驗試劑與儀器

Trizol Reagent購自Invitrogen公司； PrimeScriptTMRT Reagen Kit with gDNA Eraser、PMD?18-T Vector system和SYBR?Premix Ex TaqTMII購自大連寶生物工程有限公司(Takara)； Agarose Gel DNA Fragment Recovery Kit購自北京百泰克生物有限公司(Bioteke)； SMART RACE cDNA Amplication Kit購自美國Clontech公司；Trans5á化學感受態(tài)細胞購自北京金式金生物(TransGen Biotech)。熒光定量PCR儀為Qiagen公司生產的Rotor-Gene 6200 system，紫外分光光度計為UNICO公司的UV-3802紫外分光光度計，凝膠成像系統(tǒng)為Syngene公司的G:BOX。

1.1.5 引物

根據GenBank中已知物種c型溶菌酶基因 cDNA序列設計引物c lzm 1擴增c型溶菌酶基因中間片段，設計引物c lzm 3和c lzm 5擴增c型溶菌酶基因的3′端和5′端。c-q-lzm 1為定量表達的特異性引物；β-actin 1為定量表達的內參引物，根據NCBI數據庫中鯽(C.auratus，GenBank:AB039726.2) β-actin基因序列設計。以上引物均采用Primer 5.0設計，由武漢擎科創(chuàng)新生物技術有限公司合成。引物序列見表1。

表1 實驗所用引物Tab.1 Primers used for the experiment

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成

使用Trizol Reagent試劑并根據其說明書提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度及純度；凝膠電泳檢測RNA的完整性；以總RNA為模板，使用PrimeScriptTMRT Reagen Kit with gDNA Eraser試劑并按照說明書合成cDNA。

1.2.2 3′RACE和5′RACE擴增

按照SMART RACE cDNA Amplication Kit (Clontech)說明書，采用引物c lzm 3和c lzm 5及試劑盒提供的通用引物擴增c型溶菌酶基因的3′端和5′端。PCR產物經電泳檢測、回收、連接、轉化后，挑單克隆菌落送武漢擎科創(chuàng)新生物科技有限公司測序。

1.2.3 序列分析

用ContigExpress軟件對已獲得序列進行拼接，用DNAMAN軟件對所得序列進行氨基酸序列比對，用Clustal W 和 MEGA 5.0軟件對氨基酸序列進行多序列比較和聚類分析。

1.2.4 長豐鯽c型溶菌酶基因 mRNA表達的半定量PCR檢測

利用引物c-q-lzm 1和β-actin 1進行PCR擴增，電泳檢測c型溶菌酶基因在皮膚、肌肉、肝臟、腎臟、脾臟、腦、鰓、心臟、腸等組織中的表達情況。

1.2.5 實時熒光定量PCR分析

利用引物c-q-lzm 1和β-actin 1檢測 c型溶菌酶基因在健康長豐鯽各組織及細菌感染后長豐鯽肝臟、腎臟、脾臟和鰓中的表達情況。反應體系為20 μL：SYBR?Premix Ex TaqTMII 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，cDNA模板1 μL，加ddH2O至20 μL。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個樣品重復三次實驗以減少誤差，用 2-ΔΔCt分析方法對數據進行分析，具體方法參考文獻[12]。

1.2.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS22.0軟件進行數據處理，實驗結果用Means±Standard error (SE)形式表示， Duncan’s多重比較進行單因素方差分析，顯著性差異為P<0.05。

2 結果

2.1 長豐鯽c型溶菌酶基因序列分析

長豐鯽c型溶菌酶基因全長698 bp，包括5′端非翻譯區(qū)60 bp，3′端非翻譯區(qū)200 bp，開放閱讀框438 bp，編碼145個氨基酸。有真核細胞加尾信號(ATTAAA)和Poly(A)尾巴[13](圖1)。

圖1 長豐鯽c型溶菌酶基因cDNA全長序列及推導的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence of the ChangFeng C.auratus c-type lysozyme cDNA and its deduced amino acids sequence “□”表示起始密碼子和終止密碼子；灰色區(qū)域表示加尾信號

2.2 長豐鯽c型溶菌酶基因的同源性分析和系統(tǒng)進化樹構建

使用DNAMAN軟件將GenBank中已知一些物種和長豐鯽的c型溶菌酶氨基酸序列進行比對。結果表明c型溶菌酶基因氨基酸序列在分子進化過程中較保守，與鯉形目魚類有較高的同源一致性，其中，與鯽、異育銀鯽(C.auratusgibelio)、鯉魚相似度最高分別為99%、98%、90%，與青魚(Mylopharyngodonpiceus)、草魚、斑馬魚等鯉形目魚類同源性在80%左右，與其他物種如人(Homosapiens)、牦牛(Bosgrunniens)、原雞(Gallusgallus)等哺乳動物和鳥類的同源性則相對較低，在40%～50%之間(圖2)。

圖2 長豐鯽與其它物種c型溶菌酶基因氨基酸多序列比對Fig.2 Multiple alignments of the deduced amino acid of c-type lysozyme with other species黑色表示氨基酸序列一樣，灰色表示氨基酸序列相對保守，數字表示不同序列氨基酸的位置。

使用MEGA5.0軟件中的Neighbor-Joining(NJ法)構建長豐鯽c型溶菌酶基因氨基酸序列系統(tǒng)進化樹，進一步可以看出:長豐鯽c型溶菌酶基因與鯽魚和異育銀鯽的親緣關系最近，與鯉形目的魚類聚為一支；人、樹鼩(Tupaiachinensis)、家鼠(Musmusculus)、灰倉鼠(Cricetulusmigratorius)的c型溶菌酶基因聚為一支；原雞和綠領原雞(Gallusvarius)、青鳉(Oryziaslatipes)、獼猴(Macacamulatta)、大猩猩(Gorillagorilla)、牦牛、綿羊(Ovisaries)和山羊(Caprahircus)聚為一支(圖3)。

圖3 c型溶菌酶基因的系統(tǒng)進化樹

Fig.3 Phylogenetic tree of vertebrate c-type lysozyme

2.3 長豐鯽c型溶菌酶基因組織表達分析

用半定量和實時熒光定量PCR兩種方法檢測c型溶菌酶基因在長豐鯽皮膚、肌肉、脾臟、腎臟、肝臟、鰓、心臟、腸和腦等組織中的表達情況(圖4和圖5)。兩種方法檢測的結果基本一致，c型溶菌酶基因在腎臟中表達量最高，在脾臟、腸道、心臟和腦中大量表達，在肝臟和鰓中表達量相對較低，在皮膚和肌肉中幾乎不表達。

圖4 c型溶菌酶基因在不同組織中的表達 (RT-PCR檢測)Fig.4 Tissue distribution of c-type lysozyme mRNA in ChangFeng Carassius auratus (with RT-PCR)

圖中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、M分別代表皮膚、肌肉、脾臟、腎臟、肝臟、鰓、腸、心臟、腦、對照組和marker。對照組為陰性對照，即加樣時只添加了引物，沒有加cDNA模板。

2.4 細菌感染對長豐鯽組織c型溶菌酶基因的表達影響

由圖6可以看出：長豐鯽在感染遲鈍愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌后，在肝臟、腎臟、脾臟和鰓等組織中基因表達量均發(fā)生顯著變化，出現(xiàn)不同程度的上調。感染遲鈍愛德華氏菌后，在脾臟中的上調幅度最大，為對照組的27倍，其次為鰓、肝臟和腎臟；感染嗜水氣單胞菌后，在脾臟中表達量最大，其次是鰓，分別為對照組的160倍和82倍；感染金黃色葡萄球菌后，在脾臟中上調幅度最大，為對照組的15倍。在肝臟和腎臟中(圖6 A，B)，經金黃色葡萄球菌刺激后c型溶菌酶基因的上調幅度最高；在脾臟和鰓(圖6 C，D)中，經嗜水氣單胞菌感染后c型溶菌酶基因上調幅度最高。三種細菌感染后不同組織c型溶菌酶基因表達不同，暗示不同細菌使魚體組織產生不同的應激反應能力。

圖5 c型溶菌酶基因在不同組織中的表達 (熒光定量PCR檢測)Fig.5 Tissue distribution of c-type lysozyme mRNA in ChangFeng Carassius auratus (with real-time quantitative PCR)

skin，muscle，spleen，kidney，liver，gill，intestines，heart，brain，Control分別表示皮膚、肌肉、脾臟、腎臟、肝臟、鰓、腸、心臟、腦和對照組。

圖6 注射細菌條件下c型溶菌酶基因在肝臟(A)、腎臟(B)、脾臟(C)和鰓(D)中的表達Fig.6 Effect of bacteria injection on c-type lysozyme mRNA levels in liver(A),kidney(B),spleen(C) and gill(D)0、6、12、24、48、72、96、120 h表示魚體感染細菌時間。設置三個實驗平行組， 每個采樣點每個實驗平行組各取5條魚，每個組織樣品重復三次。

3 討論

3.1 長豐鯽c型溶菌酶基因cDNA序列分析

魚類c型溶菌酶cDNA 全長約為600～700 bp[10]，文昌魚(Branchiostomalanceolatum)c型溶菌酶cDNA全長651 bp，編碼140個氨基酸[13]；草魚c型溶菌酶cDNA全長685 bp，編碼145個氨基酸[6]；淇河鯽c型溶菌酶cDNA全長679 bp，編碼145個氨基酸[10]。圖1顯示長豐鯽c型溶菌酶cDNA全長698 bp，編碼145個氨基酸。魚類的親緣關系越近，溶菌酶的同源性越高，長豐鯽和鯽、異育銀鯽同為鯉科魚類，氨基酸序列相似性顯示長豐鯽和鯽、異育銀鯽的c型溶菌酶基因同源性分別為99%和98%，在進化樹上三者的親緣關系最近，長豐鯽與其他鯉形目魚類如鯉、斑馬魚、青魚、草魚的c型溶菌酶基因氨基酸同源性分別為90%、81%、80%、79%，推測c型溶菌酶基因在鯉形目魚類長期進化過程中是高度保守的，但是長豐鯽與其他物種如人、牦牛等哺乳動物和鳥類的同源性相對較低，在40%～50%之間，由此推測鯉形目魚類的c型溶菌酶基因在進化過程中具有相對獨立性。

在多數生物中c型溶菌酶僅存在一種，但隨著生物的進化，一些物種中存在多種c型溶菌酶。如在盤鮑(Haliotisdiscusdiscus)和大西洋鮭(Salmosalar)中均有兩種c型溶菌酶[14,15]，澳大利亞羅非魚(Oreochromisaureus)中有三種c型溶菌酶[16]，在反芻動物中有多達十種的溶菌酶[17]，這些多類型溶菌酶在生物機體內有著不同的功能作用。長豐鯽中是否存在多種c型溶菌酶，還有待進一步研究。

3.2 組織表達分析

魚類c型溶菌酶基因的表達具有種屬和組織特異性，不同魚類及不同組織的表達量均有差異。如淇河鯽c型溶菌酶在腎臟和頭腎中表達量較高，分別是肝臟的188.6倍和316.7倍[10]。牙鲆c型溶菌酶在頭腎、后腎、脾臟中具有較高表達量[19]；點帶石斑魚(Epinepheluscoioides)c型溶菌酶基因主要在血、鰓、頭腎中表達量較高[18]。長豐鯽c型溶菌酶在檢測的組織中均有表達，且在腎臟中的表達量高于其它組織，推測是由于魚體內溶菌酶的產生與哺乳動物相似，主要由單核細胞和嗜中性粒細胞產生，少量由巨噬細胞生成，在魚體血流量較豐富的腎臟、脾臟等組織中，這些單核細胞、嗜中性粒細胞等將分泌溶菌酶進入這些組織[9]。因此，長豐鯽 c型溶菌酶在腎臟中高表達，說明腎臟可能在免疫防御中具有重要作用。

3.3 細菌感染對c型溶菌酶基因表達的影響

遲鈍愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌在自然界中廣泛存在。本實驗中，長豐鯽在接受不同病原刺激時，c型溶菌酶基因在不同組織中均呈現(xiàn)出不同程度的上調，這與斑點叉尾[8]、牙鲆[9]細菌感染后的結果相似，說明c型溶菌酶基因具有抵御細菌入侵的功能；在不同組織中出現(xiàn)高峰的時間、升幅與高水平表達量維持時間等均有所不同，這與草魚[6]、淇河鯽[10]的研究結果相似，推測長豐鯽c型溶菌酶基因在不同組織中存在不同的表達調控機制，不同時間點在不同組織中采取不同的調節(jié)方式進行表達，從而維持機體穩(wěn)定。三種細菌刺激后長豐鯽c型溶菌酶基因表達升高量不同，這與淇河鯽的研究結果類似[10]，說明不同刺激可能使魚體產生的非特異性免疫反應和不同組織中c型溶菌酶的應激反應能力不同，這也可能是革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌所引起的差異，但具體作用機制有待進一步研究。

不同細菌刺激下c型溶菌酶基因表達變化說明c型溶菌酶可能具有一定的防御功能，它可以抵御外界病原菌的入侵，以增強機體的抗病、抗感染能力。該研究結果為我們進行抗病品種選育積累了一定的數據基礎。

[1]Bachali S,Jager M,Hassanin A, et al. Phylogenetic analysis of invertebrate lysozymes and the evolution of lysozyme function [J].J Mol Evol,2002,54(5):652-664.

[2]賈向志,李 元,馬文煜.溶菌酶的研究進展[J].生物技術通訊,2002,13(5):374-377.

[3]Liu F,Wen Z.Cloning and expression pattern of the lysozyme C gene in Zebrafish [J].Mech Dev,2002,113(1):69-72.

[4]Fernández T M A,Porta J,Manchado M,et al.c/Lysozyme from Senegalese sole (Soleasenegalensis):cDNA cloning and expression pattern [J].Fish Shellfish Immunol,2008,25(5):697-700.

[5]Callewaert L,Michiels C W.Lysozymes in the animal kingdom [J].J Biosci,2010,35(1):127-160.

[6]Ye X,Zhang L,Tian Y,et al.Identification and expression analysis of the g-type and c-type lysozymes in grass carpCtenopharyngodonidellus[J].Dev Comp Immunol,2010,34(5):501-509.

[7]Jiménez C R M,Infante C,Martin A B,et al.Molecular characterization,phylogeny,and expression of c-type and g-type lysozymes in brill (Scophthalmusrhombus) [J].Fish Shellfish Immunol,2008,25(1):57-65.

[8]Wang R,Feng J,Li C,etal. Four lysozymes (one c-type and three g-type) in catfish are drastically but differentially induced after bacterial infection [J].Fish Shellfish Immunol,2013,35(1):136-145.

[9]Minagawa S,Hikima J,Hirono I,etal. Expression of Japanese flounder c-type lysozyme cDNA in insect cells [J].Dev Comp Immunol,2001,25(5):439-445.

[10]王美娟.淇河鯽c型和g型溶菌酶基因克隆及表達分析[D].河南新鄉(xiāng)：河南師范大學,2015.

[11]Livak K J,Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△CTmethod [J].Methods,2001,25(4):402-408.

[12]錢 曦,華雪銘,黃旭雄,等.異育銀鯽c型溶菌酶全長cDNA序列的生物信息學分析及其組織表達分析[J].中國生物化學與分子生物學報,2008,24(4):337-347.

[13]Liu M,Zhang S,Liu Z,etal. Characterization,organization and expression of AmphiLysC,an acidic c-type lysozyme gene in amphioxus BranchiostomaBelcheriTsingtauense[J].Gene,2006,367:110-117.

[14]Umasuthan N,Bathige S,Kasthuri S R,etal. Two duplicated chicken-type lysozyme genes in disc abalone Haliotis discus discus:molecular aspects in relevance to structure,genomic organization,mRNA expression and bacteriolytic function [J].Fish Shellfish Immunol,2013,35(2):284-299.

[15]Ng S H S,Artieri C G,Bosdet I E,etal. A physical map of the genome of Atlantic salmon,Salmo salar [J].Genomics,2005,86(4):396-404.

[16]禹紹國,葉 星,張莉莉,等.奧利亞羅非魚3種C型溶菌酶基因的克隆及其序列分析[J].農業(yè)生物技術學報,2010(1):66-74.

[17]Irwin D M,Wilson A C.Multiple cDNA sequences and the evolution of bovine stomach lysozyme [J].J Biol Chem,1989,264(19):11387-11393.

[18]Wei S,Huang Y,Cai J,etal. Molecular cloning and characterization of c-type lysozyme gene in orange-spotted grouper,Epinephelus coioides [J].Fish Shellfish Immunol,2012,33(2):186-196.

[19]Schnyder J,Baggiolini M.Secretion of lysosomal hydrolases by stimulated and nonstimulated macrophages [J].J Exp Med,1978,148(2):435-450.

(責任編輯：張瀟峮)

Molecular cloning and expression analysis of c-type lysozyme gene inChangFeng Carassius auratus during bacterial infection

YAO Jia-jun1,2,LI Zhong2,LIANG Hong-wei2,LUO Xiang-zhong2,WANG Dan2,ZOU Gui-wei2

(1.CollegeofFisheries,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China;2.YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences,Wuhan430223,China)

To understand the biological role of c-type lysozyme in the ChangFengC.auratus,in this study,c-type lysozyme is cloned by homology cloning strategy from ChangFengCarassiusauratus.The results showed that the full length cDNA sequence of c-type lysozyme is 698 bp,including a 438 bp open reading frame with a coding potential for a 145-amino acid protein,a 60 bp 5′-untranslated region and a 200 bp 3′- untranslated region.c-type lysozyme mRNA was expressed ubiquitously in the tissues examined and abundantly expressed in kidney,It had a large number of expression In the spleen,intestine,heart and brain,but in the liver and gills the expression was relatively low,almost no expression in the skin and muscle.After intraperitoneal injection withEdwardsiellatarda,AeromonashydrophilaandStaphylococcusaureusrespectively,the mRNA levelsofc-typelysozyme was more or less rapidly upregulated in liver,kidney,spleen and gill.After intraperitoneal injection withEdwardsiellatarda,higher degree of the mRNA levels of c-type lysozyme was largest in spleen,followed by gills,liver and kidney;After intraperitoneal injection withAeromonashydrophila,escalation of the mRNA levels of c-type lysozyme was largest in spleen,followed by gills;After intraperitoneal injection withStaphylococcusaureus,up-regulation of the mRNA levels of c-type lysozyme was largest in spleen.In liver and kidney,the uptake rate of the c-type lysozyme gene was the highest when stimulated byStaphylococcusaureus.But in spleen and gill,the up-scaling of the mRNA levels of c-type lysozyme gene was the highest when stimulated byAeromonashydrophila.After the stimulation of three bacteria,higher degree of the mRNA levelsofc-typelysozyme was different,It showed different stimulus may make different stress reaction ability in the fish tissue.

ChangFengCarassiusauratus;c-type lysozyme;clone;expression;antibacterial effect

2017-01-18；

2017-03-27資助項目：“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD26B02)資助[Supported by Key Projects of the National Science & Technology (2012BAD26B02)]

姚佳俊(1990- )，女，碩士研究生，專業(yè)方向為魚類遺傳育種。E-mail:1518657804@qq.com

鄒桂偉。E-mail:Zougw@yfi.ac.cn

S917.4

A

1000-6907-(2017)03-0033-08