鄭 堯，趙志祥，史磊磊，宋 超，徐 跑，陳家長,3

(1.中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心/農(nóng)業(yè)部長江下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心/農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子風險評估實驗室(無錫)，江蘇 無錫 214081；2.南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，江蘇 無錫 214081；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，北京 100141)

蘆丁對吉富羅非魚幼魚組織切片及細胞凋亡的影響

鄭 堯1,2，趙志祥2，史磊磊2，宋 超1，徐 跑1,2，陳家長1,2,3

(1.中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心/農(nóng)業(yè)部長江下游漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心/農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子風險評估實驗室(無錫)，江蘇 無錫 214081；2.南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，江蘇 無錫 214081；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點實驗室，北京 100141)

在快速生長期日糧中添加較高濃度蘆丁(0、0.1和0.3 g/kg)，通過免疫、生殖器官組織切片和Tunel細胞凋亡分析，探究蘆丁作為飼料免疫增強劑對吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)幼魚組織切片及細胞凋亡的影響。結(jié)果表明低濃度蘆丁會使腸道血小板增多，杯狀細胞不規(guī)則；肝臟kupffer細胞少；并會造成腸道和肝臟細胞凋亡陽性率增高。高濃度蘆丁組肝、脾臟出現(xiàn)細胞凋亡和含鐵血黃素沉著；且造成肝臟和脾臟細胞凋亡陽性率增高；脾臟黑色素巨噬細胞中心少。此外，高濃度蘆丁會對精巢、卵巢的發(fā)育起到抑制作用。蘆丁作為水產(chǎn)行業(yè)免疫增強劑需慎用。

蘆?。患涣_非魚(Oreochromisniloticus)；組織切片；凋亡

蘆丁(Rutin，CAS153-18-4)即維生素P、蕓香苷，分子式為C27H30O16，相對分子質(zhì)量為610.51，黃色結(jié)晶粉末，是一種從植物中提取的黃酮類物質(zhì)。蘆丁具有抗氧化，降低毛細血管脆性，提高機體免疫力等作用。蘆丁能促進免疫器官(如胸腺、脾臟等)的發(fā)育[1]，對因毒物造成的肝損傷有保護作用[2-3]，利于動物器官發(fā)育并能起到免疫增強作用[4-8]。研究表明蘆丁在體內(nèi)和體外均有吸收[9]，在血液中以糖類等活性形式存在并發(fā)揮生物學效應(yīng)[9]。蘆丁廣泛存在于植物中，具有較強的藥理活性。國外主要用于食品、化妝品的添加劑和著色劑；蘆丁也是可再生的中藥資源，在中國存儲量較大，國內(nèi)主要將其作為畜牧業(yè)的飼料添加劑使用。國內(nèi)外關(guān)于將其作為家養(yǎng)動物和哺乳動物的免疫增強劑的研究較多[1-5,7-8]，在水產(chǎn)動物上的研究較少。

羅非魚作為世界水產(chǎn)業(yè)重點培育的淡水養(yǎng)殖魚類，被譽為未來動物性蛋白質(zhì)的主要來源之一。同時，羅非魚也是中國主要的出口品種，2014年中國羅非魚產(chǎn)量約為155萬噸(占據(jù)世界總產(chǎn)量的40%)，其中出口40.84萬噸[10]。目前為止各品系羅非魚中，吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)具備產(chǎn)量高、生長迅速、抗病力強等優(yōu)點。6-9月份是羅非魚快速生長的季節(jié)，但隨著溫度的升高也帶來鏈球菌病感染的風險。中草藥替代抗生素能降低由于抗生素抗性給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)所帶來的抗性基因轉(zhuǎn)移的風險。目前為止，大黃(Rheumpalmatum)、黃芪(Astragalusmembranaceus)、金銀花(Lonicerajaponica)、虎杖(Polygonumcuspidatum)、魚腥草(Houttuyniacordata)等諸多中草藥已作為水產(chǎn)飼料添加劑使用。同時，為了減少鏈球菌病給羅非魚產(chǎn)業(yè)帶來的損失，魚腥草粉已經(jīng)用來作為免疫增強劑添加到飼料中來起到疾病預防作用。對于其機理的研究較為少見。魚腥草主要含黃酮類物質(zhì)和揮發(fā)油[11]，由于魚腥草粉中成分復雜，更難摸清眾多活性成分中的主效成分。飼料中添加主效成分對魚類器官的影響研究也較為少見。

前期研究表明，一般用于陸生種植的魚腥草不僅可以用于改善羅非魚養(yǎng)殖池塘水質(zhì)[12-13]，還能增強羅非魚的免疫能力[14]。在魚腥草-羅非魚共生浮床體系中，其根部較發(fā)達，在羅非魚采食高峰可能被食用。魚腥草全草中蘆丁含量高達0.3%[11]，且根部蘆丁含量較葉、莖組織高。關(guān)于蘆丁作為畜禽飼料添加劑的正面報道較為多見[6]，若將其添加到水產(chǎn)魚類飼料中，濃度過高是否會造成魚類器官的損傷？本研究模擬快速生長期日糧添加較高濃度蘆丁(0、0.1和0.3 g/kg)，通過免疫、生殖器官組織切片和Tunel細胞凋亡分析，探究蘆丁對吉富羅非魚幼魚組織切片及細胞凋亡的影響，為吉富羅非魚疾病防控提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

吉富羅非魚幼魚(N=300)取自中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心宜興屺亭養(yǎng)殖基地，暫養(yǎng)于水箱桶(1.5 t)中1個月后，從中選取體型完整、健康的個體作為試驗對象，其平均體重(49.34±1.48)g，平均體長(11.73±0.24)cm。基礎(chǔ)飼料為天邦羅非魚1#膨化料(編號5533，蛋白含量占31.6%，脂肪含量占4.9%)。試驗用水為24 h自然曝氣的自來水，水溫(24.8±0.8)℃，溶氧4.4～6.7 mg·L-1，pH6.3-8.1，試驗期間暗光比為12 h∶12 h，試驗用水符合漁業(yè)水質(zhì)標準(GB11607-89)。

每個處理玻璃缸(300 L，100 cm × 65 cm × 60 cm)放置12尾吉富羅非魚幼魚，每個試驗組作3個重復(N=108)。采用中草藥粉碎機(Fw177/FW400A)將基礎(chǔ)飼料研碎，依照預實驗篩選出來的濃度結(jié)果，通過在基礎(chǔ)飼料中添加不同濃度的蘆丁(0、0.1和0.3 g/kg，蘆丁購置于四川遂寧旭泰植物原料責任有限公司，純度為98%)，每天8:00和下午4:00定量投喂各1次。試驗開始前準確稱量每缸魚的重量，飼喂量所占體重比為3 %，1 h后等飼料全被吃完將糞便清除。飼喂3個月后取樣(模擬吉富羅非魚生長最佳時間段7-9月)，從每個處理組中隨機挑選6尾魚，采集腸、肝臟、脾臟浸泡于4%的甲醛溶液；采集性腺(從6-12尾魚中選擇精巢和卵巢樣本各3尾以上)浸泡于Bouin′s固定液，均置于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 組織學切片

將處理好的各組織樣本(腸道、肝臟、脾臟、精巢和卵巢)，經(jīng)酒精梯度濃度脫水后，透明使用水楊酸甲酯試劑，萊卡RM2235制作常規(guī)石蠟切片，切片厚度為5 μm。組織切片準備好后采用Hematoxylin-eosin staining(HE)染色。使用倒置顯微鏡(Nikon TE2000-U)觀察和拍照。在放大的電腦顯示屏上設(shè)置1 cm2網(wǎng)格，選擇3尾魚腸道組織切片，40× 鏡下統(tǒng)計腸道5個視野(四周和中間)血小板數(shù)量。kupffer細胞辨別方法按文獻[15]對其形狀和位置進行區(qū)分并統(tǒng)計，細胞數(shù)量統(tǒng)計與腸道中使用的方法相同。

1.3 Tunel試驗

Tunel細胞凋亡原位檢測試劑盒購置于南京建成生物科技有限公司，將腸道、肝臟和脾臟組織的石蠟切片加Triton-100通透、3%H2O2-甲醇溶液滅活、Tunel反應(yīng)(每個樣本滴加100 μL TdT酶反應(yīng)液，避光濕潤37 ℃反應(yīng)1 h)、滴加100 μL Streptavadin-HRP酶標親和素、DAB法顯色、復染和封片等步驟后，選擇Nikon TE2000-U倒置顯微鏡進行觀察和拍照。凋亡細胞為棕色，正常細胞為藍紫色，光學顯微鏡觀察統(tǒng)計凋亡細胞數(shù)量，細胞凋亡指數(shù)(AI)=(凋亡細胞數(shù)÷腫瘤細胞總數(shù))×100%。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 11.5中單因素方差分析(One-way ANOVA)處理實驗數(shù)據(jù)，采用最小極差法(LSD)進行顯著性檢驗，P<0.05視為差異顯著，用不同小寫字母表示。

2 結(jié)果

2.1 組織學觀察結(jié)果

通過圖片放大對單位面積血小板數(shù)量的統(tǒng)計，相比對照組腸道組織(血小板平均含量為3個/cm2，圖1-1)，飼料添加蘆丁組血小板增多(圖1-2、3)，0.1 g/kg蘆丁組血小板平均含量為6個/cm2，0.3 g/kg蘆丁組血小板平均含量為5個/cm2。杯狀細胞(goblet cell，gc)是混在粘膜上皮中的粘液分泌細胞，HE染色為空泡狀。該研究中飼料添加蘆丁組杯狀細胞不規(guī)則。

與對照組相比(圖1-4)，蘆丁添加組肝細胞紋理變得疏松(圖1-5)，出現(xiàn)細胞形狀不規(guī)則。蘆丁添加組肝細胞kupffer細胞變少，對照組kupffer細胞平均含量為6個/cm2，0.1 g/kg蘆丁組kupffer細胞平均含量為4個/cm2，0.3 g/kg蘆丁組kupffer細胞平均含量為3個/cm2。蘆丁高濃度添加組部分肝細胞核溶解以致肝組織局部壞死，含鐵血黃素沉著(圖1-6)。

飼料添加高濃度蘆丁組脾臟黑色素巨噬細胞中心少，紅髓嚴重減少，白髓增多，出現(xiàn)紅血細胞減少等現(xiàn)象，細胞開始出現(xiàn)炎癥，且出現(xiàn)含鐵血黃素沉著等現(xiàn)象(圖1-7)。

精巢組織疏松，蘆丁添加組精巢發(fā)育狀態(tài)基本一致，但高濃度會抑制精母細胞的發(fā)育，且出現(xiàn)凋亡細胞(圖1-8)；低濃度蘆丁能造成卵巢凋亡細胞增多，高濃度蘆丁添加組能抑制卵母細胞的發(fā)育(圖1-9)。

圖1 飼料添加蘆丁對吉富羅非魚幼魚組織學的影響Fig.1 Effects of rutin feed addition on histological slices of juvenile GIFT tilapia (O.niloticus)1.對照組腸道, 2.蘆丁0.1 g/kg添加組腸道, 箭頭顯示血小板, 3.蘆丁0.3 g/kg添加組腸道, 箭頭顯示血小板; 4.對照組肝臟, 5.蘆丁0.1 g/kg添加組肝臟, 箭頭顯示凋亡細胞, 6.蘆丁0.3 g/kg添加組肝臟, 箭頭顯示凋亡細胞; 7.蘆丁0.3 g/kg添加組脾臟, 黑色箭頭顯示炎癥, 箭頭顯示含鐵血黃素沉著; 8.蘆丁0.3 g/kg添加組精巢, 箭頭顯示凋亡細胞; 9.蘆丁0.3 g/kg添加組卵巢, 箭頭顯示卵母細胞受到抑制. 注:血小板(bp);杯狀細胞(gc); 嗜酸性粒細胞(egc); 紅血細胞(rbc); 空泡(va); kupffer細胞(kc); 炎癥細胞(ic); 次級 精母細胞(ss); 精子細胞(sd); 卵黃顆粒(yg); 濾泡層(fl).

2.2 細胞凋亡觀察結(jié)果

相比對照組腸道組織，飼料添加低濃度蘆丁組腸道組織出現(xiàn)了大量的凋亡細胞(棕色，圖版2-1)且AI顯著高于對照組(表2)；飼料添加不同濃度蘆丁組肝臟組織出現(xiàn)了凋亡細胞(圖版2-2)且AI顯著高于對照組；僅飼料添加高濃度蘆丁組脾臟組織出現(xiàn)了凋亡細胞(圖版2-3)，且AI顯著高于對照組。

表1 飼料添加蘆丁對吉富羅非魚幼魚組織學的影響Tab.1 Effects of rutin feed addition on histological slices of juvenile O.niloticus

表2 飼料添加蘆丁對吉富羅非魚幼魚細胞凋亡陽性率的影響Tab.2 Effects of rutin feed addition on positive ratio of apoptosis in juvenile O.niloticus

圖2 飼料添加蘆丁對吉富羅非魚幼魚細胞凋亡的影響Fig.2 Effects of rutin feed addition on apoptosis in juvenile O.niloticus注：1.蘆丁0.1 g/kg添加組腸道, 2.蘆丁0.3 g/kg添加組肝臟, 3.蘆丁0.3 g/kg添加組脾臟, 箭頭顯示凋亡細胞

3 討論

3.1 高濃度蘆丁能造成吉富羅非魚器官損傷

Kupffer細胞位于肝血竇內(nèi)表面，是一類發(fā)揮重要作用的吞噬細胞[16]。該研究中高、低濃度蘆丁添加組造成肝臟受損，這與飼料添加高濃度多酚類造成鼠肝損傷的研究結(jié)果保持一致[17]，且可能是通過刺激腫瘤壞死因子生成并通過NF-κB通路造成損傷[16]；Kupffer細胞減少，高濃度組肝臟出現(xiàn)細胞凋亡，這些結(jié)果與21-氨基類固醇激活NF-κB通路導致凋亡相一致。有研究表明蘆丁造成肝損傷可能原因是其在肝臟蓄積，引起免疫系統(tǒng)紊亂[18-19]。總之，該研究表明高濃度蘆丁可能通過抑制免疫細胞產(chǎn)生，激活凋亡相關(guān)信號通路引起吉富羅非魚肝臟組織損害。

含鐵血黃素是由鐵蛋白微粒集結(jié)而成的色素顆粒[20]，該研究中高濃度蘆丁添加組含鐵血黃素(hemosiderin)沉著，這與乙二醇單丁醚(低毒，常用于油漆等行業(yè))造成鼠肝臟含鐵血黃素沉著相一致[21]。研究表明魚腥草粗提物(含黃酮類和揮發(fā)油成分)能增強脾臟淋巴細胞，且能影響脾臟免疫基因的表達[22-24]。該研究中蘆丁能造成腸道、肝臟和脾臟細胞(高濃度組)凋亡，這與香澤蘭總黃酮造成斑馬魚(Daniorerio)脾臟壞死結(jié)果相一致[25]。脾臟含白髓和紅髓(動物體內(nèi)最大的淋巴器官)，經(jīng)刺激可產(chǎn)生淋巴細胞和巨噬細胞，巨噬細胞分解血紅蛋白后生成少量的含鐵血黃素沉淀[26]，該研究中高濃度蘆丁造成吉富羅非魚紅髓嚴重減少，紅血細胞分散并減少，這與染料木黃酮造成鼠脾臟損傷結(jié)果相一致[27]，說明高濃度蘆丁已造成吉富羅非魚脾臟損傷。

有研究表明蘆丁能跨過小腸上皮細胞進入到機體內(nèi)，在小腸液中可穩(wěn)定保持至少2-4 h，不斷攝入能使得蘆丁在血液中積累，腸道黏膜上皮細胞內(nèi)的酶能將蘆丁降解為苯甲酸衍生物而被吸收[9]，該研究中少量的蘆丁能使腸道組織更為緊湊，這可能與蘆丁能發(fā)揮腸道黏膜修復功能及血管舒張功能相關(guān)[9]。日糧添加大豆異黃酮會對環(huán)江香豬(fragrance pig，Sus scrofa)的生殖器官發(fā)育產(chǎn)生影響，且與大豆異黃酮劑量有關(guān)[28]。植物中的有效物質(zhì)，如甘草酸能通過激素生物合成和代謝通路來降低血液激素水平[29]。該研究中飼料添加不同濃度蘆丁還能對生殖器官的發(fā)育起到抑制作用，具體機制還需要進一步研究。

3.2 水產(chǎn)領(lǐng)域中草藥(魚腥草)主效成分的應(yīng)用推廣

有研究表明，蘆丁能增強哺乳動物免疫能力[4-8]，能促進胸腺、脾臟和肝臟的發(fā)育[1-3]。絕大多數(shù)植物體內(nèi)都含有黃酮類化合物(flavonoids)，黃酮類化合物在水產(chǎn)動物抗菌防病方面起著重要的作用，如大豆異黃酮能增強卵形鯧(Trachinotusovatus)的非特異性免疫能力和抗氧化能力[30-31], 從雪松(Cedrusdeodara)中提取的雙氫槲皮素能增強金頭鯛(SparusaurataL.)的免疫能力，且低濃度適合作為添加劑使用。蘆丁屬黃酮類化合物，在魚腥草根部的含量高達0.3%[32]，在水產(chǎn)上的研究表明其能增強凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)抗溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)的能力[33]。前期其他課題組和筆者已經(jīng)將魚腥草用于吉富羅非魚養(yǎng)殖池塘的水質(zhì)凈化，魚腥草中含有的黃酮類物質(zhì)和揮發(fā)油對革蘭氏陽性菌(如鏈球菌)有較好的抑菌作用[34]，羅非魚采食魚腥草根部若能進一步提高其抗病和免疫能力將有利于加以推廣應(yīng)用，這將有助于挽回每年鏈球菌病給羅非魚產(chǎn)業(yè)帶來的損失。此外，魚腥草還能作為中草藥或蔬菜使用，也會進一步帶動養(yǎng)殖戶投入到生產(chǎn)中，增加額外收入。

國內(nèi)外關(guān)于蘆丁作為飼料添加劑增強免疫能力的研究主要集中在家養(yǎng)動物和哺乳動物身上[1-5,7-8]，而對于水產(chǎn)動物的研究較為少見[6,33]。若要想通過飼料添加蘆丁來達到增強羅非魚免疫能力的目的，勢必不能影響羅非魚組織器官的發(fā)育，特別是幼魚。本研究結(jié)果表明較高濃度的蘆丁會造成免疫和生殖器官的損傷。目前有研究通過殼聚糖包裹蘆丁緩釋達到抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生的效果[35]，若能在飼料中采用此做法達到抗炎效果且不損傷幼魚的組織器官發(fā)育，蘆丁則極有可能作為吉富羅非魚飼料免疫增強劑加以開發(fā)使用。

4 結(jié)論

較高濃度的蘆丁會造成免疫和生殖器官的損傷，蘆丁作為水產(chǎn)行業(yè)免疫增強劑需慎用。

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(責任編輯：張紅林)

Effects of rutin on histological slices and apoptosis of juvenileOreochromisniloticus

ZHENG Yao1,2, ZHAO Zhi-xiang2, SHI Lei-lei2, SONG Chao1, XU Pao1,2, CHEN Jia-zhang1,2,3

(1.FisheryEco-EvironmentMonitoringCenterofLowerReachesofYangtzeRiver,MinistryofAgriculture/LaboratoryofQuality&SafetyRiskAssessmentforAquaticProductsonEnvironmentalFactors(Wuxi),MinistryofAgriculture/FreshwaterFisheriesResearchCenter,ChineseAcademyofFisherySciences,Wuxi214081JiangSu,China;2.WuxiFisheryCollege,NanjingAgriculturalUniversity,Wuxi214081;3.KeyLaboratoryofQualityandSafetyControlforAquaticProducts,MinistryofAgriculture,Beijing100141,China)

The purpose of this study was to find the effects on rutin (as immunity enhancer) feed addition for juvenile GIFT tilapia (Oreochromisniloticus), which was determined by histological sections of immune and reproductive organs and Tunel analysis in rapid growth duration under different concentration of rutin addition (0, 0.1 and 0.3 g/kg).Results showed that much higher ratio of the blood platelet in the intestinal tissue has been revealed, and goblet cells demonstrated irregular in lower concentration of rutin group compared with the controls.The liver structure demonstrated existing less Kupffer cells, but caused higher positive ratio of apoptosis cell both in intestine and liver.While in the higher concentration rutin groups, the emergence of apoptosis, hemosiderin pigmentation and higher positive ratio of apoptosis cell has been found in the spleen and liver tissues, and it also caused fewer melanin macrophages center in spleen.In addition, it also revealed the inhibitory development effects for testis and ovary tissues in high concentration rutin groups.To conclude, it is with caution to use rutin as immunity enhancer in aquaculture industry.

rutin; GIFT tilapia(Oreochromisniloticus); histological sections; apoptosis

2016-11-16；

2017-03-02

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(CARS-49); 中央級科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(2015JBFR03); 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201503108); 國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估項目

鄭 堯(1986- )，男，博士，助理研究員，主要從事水產(chǎn)品質(zhì)量安全與分子毒理學研究。E-mail: zhengy@ffrc.cn

陳家長，E-mail: chenjz@ffrc.cn；徐跑，E-mail:xup@ffrc.cn

S963.73

A

1000-6907-(2017)03-0073-06