王昌霖，吳興兵，朱永久，楊德國(guó)，王亞龍,3，陳 亮,3，楊少榮，王小明

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430223；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢430070；3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；4. 中國(guó)長(zhǎng)江三峽集團(tuán)公司，成都 610041)

圓口銅魚(yú)精漿的理化性質(zhì)分析

王昌霖1,2，吳興兵1，朱永久1，楊德國(guó)1，王亞龍1,3，陳 亮1,3，楊少榮4，王小明4

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430223；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢430070；3. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；4. 中國(guó)長(zhǎng)江三峽集團(tuán)公司，成都 610041)

對(duì)圓口銅魚(yú)(Coreiusguichenoti)精漿離子和氨基酸成分及精液生理特性進(jìn)行了檢測(cè)分析。結(jié)果顯示，圓口銅魚(yú)精液pH值為7.3，呈弱堿性；精液濃度為39.7%，精子密度為5.3×109個(gè)/mL；精漿離子以Na+含量88.7 mmol/L最高，其次是K+，之后為Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+；精漿水解氨基酸總量為2 872.69 μmol/100mL，其中以脯氨酸含量最高，蛋氨酸、酪氨酸和組氨酸含量最低。該結(jié)果填補(bǔ)了圓口銅魚(yú)繁殖生物學(xué)的相關(guān)數(shù)據(jù)，為圓口銅魚(yú)規(guī)模化人工繁育提供了基礎(chǔ)資料。

圓口銅魚(yú)(Coreiusguichenoti)；精液濃度；精子密度；精漿離子；水解氨基酸

圓口銅魚(yú)(Coreiusguichenoti)隸屬鯉形目(Cypriniformes)、鮈亞科(Gobioninae)、銅魚(yú)屬(Coreius)，是長(zhǎng)江上游特有的優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。地方俗稱(chēng)方頭水密子、水密子、金鰍、圓口、麻花等，廣泛分布于金沙江下游、長(zhǎng)江上游干流、嘉陵江中下游、沱江下游、烏江下游等水域[1-2]。近年來(lái)，隨著長(zhǎng)江、金沙江及雅礱江水電開(kāi)發(fā)的逐步實(shí)施，長(zhǎng)江上游圓口銅魚(yú)棲息地萎縮[3]，再加上過(guò)度捕撈、環(huán)境污染等影響，圓口銅魚(yú)資源量急劇下降[4-5]，對(duì)種群的生存構(gòu)成了威脅，其保護(hù)問(wèn)題迫在眉睫[6]。

目前，在圓口銅魚(yú)繁殖生物學(xué)中已有關(guān)于早期發(fā)育、人工繁殖等方面的研究[7-9]，但是對(duì)其精子生物學(xué)特性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)魚(yú)類(lèi)精子生物學(xué)特性進(jìn)行研究，有助于開(kāi)展魚(yú)類(lèi)精子的冷凍保存，人工授精稀釋液的開(kāi)發(fā)，促進(jìn)人工繁殖技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于物種的保護(hù)具有重要意義[10-12]。本研究通過(guò)對(duì)圓口銅魚(yú)的精子密度、精液濃度和精液pH值等生理特性及精漿離子和氨基酸成分的檢測(cè)分析，旨在積累圓口銅魚(yú)繁殖生物學(xué)的相關(guān)數(shù)據(jù)，為圓口銅魚(yú)規(guī)?；斯し庇臀锓N保護(hù)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 圓口銅魚(yú)來(lái)源

試驗(yàn)所用圓口銅魚(yú)來(lái)自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所的封閉循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)(湖北武漢)中人工培育的親魚(yú)。試驗(yàn)魚(yú)選取體格健壯、外表無(wú)損傷及病害、輕壓腹部精液自動(dòng)流出的成熟雄魚(yú)。試驗(yàn)用魚(yú)共15尾，吸取精液前未注射催產(chǎn)劑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 精液的采集與保存

取精液前先以曝氣自來(lái)水洗凈生殖孔，使用干毛巾吸干生殖孔周?chē)绑w表水分，之后使用干燥潔凈的衛(wèi)生紙擦拭生殖孔周?chē)_保吸取精液過(guò)程中精子不會(huì)遇水激活。采集精液時(shí)，輕擠魚(yú)腹兩側(cè)使精液流出，采用2 mL注射器緩慢吸取，采集完畢將精液移放入1.5 mL干燥的離心管中，置于4℃冰箱保存待檢。要求實(shí)驗(yàn)精液無(wú)尿、無(wú)血、無(wú)外來(lái)水滲入，遇水迅速散開(kāi)。

1.2.2 精子密度、精液濃度和pH值的測(cè)定

精子密度測(cè)定時(shí)，用0.85%NaCl溶液將精液稀釋3 000倍，使用XB-K-25血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在OLYMPUS CX41顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)。精子密度計(jì)算：精子密度(個(gè)/mL)=(80小格內(nèi)精子數(shù)/80)×400×104×稀釋倍數(shù)，檢測(cè)3尾魚(yú)，每尾重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。精液pH值采用精密pH試紙測(cè)定，共檢測(cè)3尾魚(yú)，每尾重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果取平均值。精液濃度測(cè)定時(shí)，將精液裝入刻度離心管中，常溫下3 000 r/min離心30 min[13]，計(jì)算精子總體積占精液總體積的百分率，即精液濃度，共檢測(cè)3尾魚(yú)。

1.2.3 精漿成分測(cè)定

采集10尾圓口銅魚(yú)精液，混合后用Neofuge 13R離心機(jī)以3 000 r/min速度離心30 min，取上清液放入經(jīng)硝酸浸泡后干燥的玻璃瓶中，樣品測(cè)定前于-40 ℃下保存。使用電感耦合等離子質(zhì)譜儀(ICP)對(duì)樣品進(jìn)行離子成分分析，氨基酸自動(dòng)分析儀根據(jù)國(guó)標(biāo)GB/T 5009.124-2003對(duì)樣品進(jìn)行水解氨基酸成分分析。

2 結(jié)果

2.1 圓口銅魚(yú)精液生理特性

性成熟的圓口銅魚(yú)精液呈乳白色、較粘稠，pH值為7.3，呈弱堿性；精液濃度為39.7%，精子密度為5.3×109個(gè)/mL(表1)。

表1 圓口銅魚(yú)精液生理特性Tab.1 The basic characteristics of C.guichenoti milt

2.2 精漿主要離子成分

圓口銅魚(yú)精漿中以Na+和K+為主要離子成分，Na+含量最高，為88.7 mmol/L；其次是K+，為10.51 mmol/L；之后Ca2+含量較低為1.689 mmol/L；Mg2+為0.792 mmol/L；Zn2+為0.02 mmol/L；Cu2+含量最低，為0.002 3 mmol/L(表2)。

表2 圓口銅魚(yú)精漿中主要離子成分Tab.2 Composition of main ions in C.guichenoti semen (mmol/L)

2.3 水解氨基酸成分

圓口銅魚(yú)精漿中水解氨基酸總量達(dá)2 872.69 μmol/100 mL，其中以脯氨酸含量最高，為1 649.18 μmol/100 mL；其次是賴(lài)氨酸，為205.35 μmol/100 mL；蛋氨酸含量最低，為8.99 μmol/100 mL(表3)。

表3 圓口銅魚(yú)精漿中水解氨基酸成分Tab.3 Composition of hydrolyzed amino acidsC.guichenoti semen (μmol/100mL)

3 討論

3.1 精液生理特性

精子密度和精液濃度是魚(yú)類(lèi)精子主要的生理特性，魚(yú)類(lèi)精子密度和精液濃度在不同種類(lèi)之間，同種的不同個(gè)體之間以及同一個(gè)體在繁殖季節(jié)的不同階段都是不同的。圓口銅魚(yú)精子的平均密度為5.3×109個(gè)/mL，低于其它淡水魚(yú)類(lèi)，如高白鮭(Coregonuspeled)精子平均密度為28.7×109個(gè)/mL[14]，大黃魚(yú)(Pseudosciaenacrocea)精子平均密度為14.5×109個(gè)/mL[15]，鯉(Cyprinus carpio)精子平均密度為29.4×109個(gè)/mL，團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)精子平均密度為33.2×109個(gè)/mL，四大家魚(yú)精子密度為26.6×109個(gè)/mL～35.6×109個(gè)/mL[13]，圓口銅魚(yú)與鱘魚(yú)精子密度相比差別不大，如達(dá)氏鱘(Acipenserdabryanus)精子平均密度為1.52×109個(gè)/mL[12]，中華鱘(A.sinensisGray)精子的平均密度為3.26×109個(gè)/mL[11]，史氏鱘(Acipenserschrenki)精子密度為2.45×109個(gè)/mL～9.5×109個(gè)/mL[16]。研究精子密度可為人工繁殖提供技術(shù)參數(shù)，已有研究表明，淡水鯉科魚(yú)類(lèi)精卵配比達(dá)3.5×105尾·卵時(shí)，可獲得85%以上的受精率[13-14]。參照此標(biāo)準(zhǔn)，圓口銅魚(yú)繁殖力為1.3～4萬(wàn)粒[7]，在進(jìn)行人工授精時(shí)，所需精子尾數(shù)為(4.55～14)×109尾，根據(jù)表1中圓口銅魚(yú)成熟雄魚(yú)平均精液量為0.75 mL，平均精子密度為5.3×109個(gè)/mL，筆者建議在進(jìn)行圓口銅魚(yú)人工授精時(shí)，可將雌雄比例控制在1∶2～1∶3較為合適。

圓口銅魚(yú)的平均精液濃度為39.67%，低于四大家魚(yú)精液濃度58.3%～69.1%[13]，高于鱘魚(yú)精液濃度，如中華鱘平均精液濃度為17.37%[11]，達(dá)氏鱘平均精液濃度7.67%[12]。多數(shù)魚(yú)類(lèi)是卵生種類(lèi)，體外受精，這樣需要相對(duì)較大量的精液才能保證每個(gè)卵子都有受精的機(jī)會(huì)，所以魚(yú)類(lèi)精液的濃度相對(duì)較大[17]。圓口銅魚(yú)精液pH值范圍為7.3，呈弱堿性，和其他魚(yú)類(lèi)相似，是對(duì)自然水體環(huán)境適應(yīng)的結(jié)果。

3.2 圓口銅魚(yú)精漿主要離子成分

在圓口銅魚(yú)精漿中，Na+和K+是主要的離子成分，起著調(diào)節(jié)精漿滲透壓的重要作用，且在動(dòng)物組織中，K+主要集中于細(xì)胞內(nèi)，Na+主要分布于細(xì)胞外，存在于細(xì)胞間液、淋巴和血液中，細(xì)胞外K+的含量應(yīng)該低于Na+[18]，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是一致的。圓口銅魚(yú)精漿中Ca2+和Zn2+的含量明顯高于其他魚(yú)類(lèi)，有研究表明Ca2+是多數(shù)魚(yú)類(lèi)精子激活所必需的[19]，較低濃度的Ca2+就能引起精子的聚集，且隨濃度的升高，聚集現(xiàn)象會(huì)更明顯，同時(shí)會(huì)表現(xiàn)對(duì)精子強(qiáng)烈的活力抑制作用[20-23]，因此，圓口銅魚(yú)精漿中較高的Ca2+有利于抑制精子在精漿中的運(yùn)動(dòng)。精漿中Zn2+的含量與精液品質(zhì)優(yōu)劣有密切關(guān)系，含量過(guò)低，精液品質(zhì)差，精漿中Zn2+含量高，則精液質(zhì)量好[12]，圓口銅魚(yú)精漿中Zn2+含量較高，代表其精液質(zhì)量較好。另外圓口銅魚(yú)中Mg2+的含量也較其他幾種魚(yú)類(lèi)高出許多，由此表明種屬間精漿離子成分存在較大的差異，但造成這種差異的原因尚不十分清楚，有待于進(jìn)一步的研究。

3.3 水解氨基酸成分

圓口銅魚(yú)精漿的水解氨基酸總量為2 872.69 μmol/100mL，其中以脯氨酸、賴(lài)氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸等6種氨基酸含量相對(duì)較高(尤其以脯氨酸的相對(duì)濃度最高)，蛋氨酸、酪氨酸和組氨酸相對(duì)含量最低。結(jié)果與魯大椿等[24]對(duì)我國(guó)草、鯉、鰱和鳙等魚(yú)類(lèi)精漿水解氨基酸含量的測(cè)定結(jié)果有相似之處，均是以賴(lài)氨酸、谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸的濃度較高，脯氨酸、精氨酸濃度有較大差異，表明魚(yú)類(lèi)精漿氨基酸濃度存在一定種間差異。氨基酸可能形成一種能量基質(zhì)，為精子泳動(dòng)提供能源[25]。本研究結(jié)果顯示圓口銅魚(yú)精液中的氨基酸濃度很高，表明在繁殖季節(jié)中圓口銅魚(yú)成熟精子的代謝活動(dòng)旺盛。

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(責(zé)任編輯：張紅林)

Analysis of physical and chemical properties of seminal plasma ofCoreiusguichenoti

WANG Chang-lin1,2，WU Xing-bing1，ZHU Yong-jiu1，YANG De-guo1，WANG Ya-long1,3，CHEN Liang1,3， YANG Shao-rong4，WANG Xiao-ming4

(1.KeyLaboratoryofFreshwaterBiodiversityConservation,MinistryofAgricultureofChina,YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute,ChineseAcademyofFisherySciences，Wuhan430223,China;2.CollegeofAquaculture,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China;3.CollegeofFisheriesandLifeScience,ShanghaiOceanUniversity,Shanghai201306,China;4.ChinaThreeGorgesCorporation,Chengdu610041,China)

This paper focused on the main physiological characteristics of semen, seminal plasma ion and amino acid composition ofCoreiusguichenoti. The results showed that the semen pH and semen concentration ofC.guichenotiwere at the range of 7.3 and 39.7%, respectively, and which was weakly alkaline. The sperm density was 5.3×109ind./ mL. The highest content in plasma was Na+with the concentration of 88.7 mmol/ L, then followed by K+,Ca2+,Mg2+,Zn2+,Cu2+. The total amount of hydrolyzed amino acids in seminal plasma was 2 872.69 μmol/ 100 mL, and the content of proline was the highest, and that of methionine, tyrosine and histidine were the lowest. The results could enrich the research contents of fish sperm biology and provide basic theory support for large-scale artificial breeding and species protection.

Coreiusguichenoti; semen concentration; sperm density; seminal plasmaion; hydrolyzed amino acids

2017-01-11；

2017-03-15

農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201203086-02)；中國(guó)長(zhǎng)江三峽集團(tuán)公司科研專(zhuān)項(xiàng)(JGJ0252013)

王昌霖(1992- )，男，碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向?yàn)轸~(yú)類(lèi)生態(tài)學(xué)。E-mail：479695090@qq.com

楊德國(guó)。E-mail：yangdg@yfi.ac.cn

S917.4

A

1000-6907-(2017)03-0041-04