馬曉靜　王嵐　殷小杰　王智民　劉曉謙　貢磊磊　陳兩綿　梁日欣　高慧敏

[摘要] 觀察燈盞乙素乙酯對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈結(jié)扎所致局灶性腦缺血的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。該實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)雄性SD大鼠84只，隨機(jī)分為7組：假手術(shù)組、模型組、陽性藥組（尼莫地平組12 mg·kg-1）、燈盞花素片組（48 mg·kg-1）、燈盞乙素乙酯高、中、低劑量組（100，50，25 mg·kg-1）。采用線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈結(jié)扎（MCAO）模型，觀察大鼠MCAO時(shí)神經(jīng)功能狀態(tài)，TTC染色法測(cè)腦梗死面積，半自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中MDA，SOD，NO的變化。分別采用200 mg·L-1OxLDL和100 μg·L-1TNFα作用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）24 h，建立OxLDL和TNFα細(xì)胞損傷模型，測(cè)定細(xì)胞上清液中MDA，SOD，NO，ET，6ketoPGF1α，TXB2，IL1，IL6，IL8，ICAM1和PECAM1水平。結(jié)果顯示，燈盞乙素乙酯能有效改善MCAO大鼠神經(jīng)功能，明顯減小腦梗死面積。與模型組比較，血清中SOD和NO活性提高，MDA含量降低；細(xì)胞上清液中SOD，6ketoPGF1α和NO活性提高，IL1，IL6，IL8，ICAM1，PECAM1，TXB2，ET和MDA含量降低。結(jié)果表明，燈盞乙素乙酯對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈結(jié)扎所致局灶性腦缺血具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抗氧化應(yīng)激，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及減輕炎性反應(yīng)有密切關(guān)系。

[關(guān)鍵詞] 燈盞乙素乙酯； 中動(dòng)脈結(jié)扎； 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞； 氧化應(yīng)激； 炎性反應(yīng)

Protective effect and mechanism of scutellarin ethyl ester on focal

cerebral ischemia induced by ligation of middle cerebral artery in rats

MA Xiaojing， WANG Lan， YIN Xiaojie， WANG Zhimin， LIU Xiaoqian， GONG Leilei，

CHEN Liangmian， LIANG Rixin*， GAO Huimin*

（Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medicine Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] To observe the protective effect of scutellarin ethyl ester on focal cerebral ischemia injury induced by middle cerebral artery occlusion in rats（MCAOR）， and explore its mechanism. Totally 84 male SD rats were randomly divided into seven groups： shamoperated group， model group，positive drug group（niomdipine，12 mg·kg-1）， Brevisapin tablets group（48 mg·kg-1）， and high， middle and lowdose scutellarin ethyl ester groups（100， 50， 25 mg·kg-1）. The MCAOR model was prepared by using thread embolism method to observe the neurological function of rats， the area of cerebral infarction was measured with TTC， and the levels of MDA， SOD and NO in serum were detected with semiautomatic biochemistry analyzer.OxLDL and TNFα cell injury models was established by treating HUVECs with 200 mg·L-1 oxLDL and 100 μg·L-1TNFα，and the levels of MDA， SOD， NO， ET， 6ketoPGF1α，TXB2， IL1， IL6， IL8， ICAM1 and PECAM1 in the cell supernatant were determined. The results showed that scutellarin ethyl ester could effectively improve the neurological function of MCAOR rats， and significantly reduce the area of cerebral infarction. Compared with the model group， activities of SOD and NO in serum increased， while content of MDA decreased. In the cell supernatant， activities of SOD， 6ketoPGF1α and NO increased， content of IL1， IL6， IL8， ICAM1， PECAM1， TXB2， ET and MDA decreased， which indicated that scutellarin ethyl ester has a certain protective effect on focal cerebral ischemia injury induced by middle cerebral artery occlusion in rats， and its mechanism may be related to antioxidative stress， improvement of endothelial function and reduction in inflammatory reaction.

[Key words] scutellarin ethyl ester； ligation of the middle cerebral artery； HUVEC； oxidative stress； inflammatory reaction

缺血性腦血管病是嚴(yán)重威脅人類健康的一種臨床常見病[1]，在中醫(yī)學(xué)中屬中風(fēng)病范疇。西醫(yī)學(xué)主要以Ca2+拮抗劑，血管擴(kuò)張劑及α腎上腺素受體抑制劑為主要治療手段。中醫(yī)學(xué)則采用血塞通，丹紅注射液，燈盞花素，葛根素等活血益氣藥。燈盞花素是從菊科飛蓬屬植物短葶飛蓬中提取的黃酮類有效成分，包括燈盞乙素和少量的燈盞甲素。藥理研究表明，燈盞花素具有擴(kuò)張血管，增加腦血流量，降低腦血管阻力及抗血小板聚集等作用；臨床上主要用于腦中風(fēng)后遺癥的治療[2]。但是，就目前上市的燈盞花素制劑來說，其注射劑半衰期短，消除速度快；而且，作為中風(fēng)恢復(fù)期用藥，患者多選擇在家庭接受治療，注射給藥不認(rèn)為是最佳給藥途徑。片劑雖然方便廉價(jià)，但存在生物利用度極低的問題。因此，如何對(duì)燈盞乙素開展前藥設(shè)計(jì)，提高生物利用度是迫切需要解決的問題。課題組在前期工作中，引入前藥設(shè)計(jì)理念，結(jié)合制劑學(xué)的考慮，合成了一系列燈盞乙素衍生物，發(fā)現(xiàn)其中的燈盞乙素乙酯（DZY02）對(duì)大鼠中動(dòng)脈結(jié)扎所致的局灶性腦缺血具有保護(hù)作用，本文是在其藥效學(xué)初篩的基礎(chǔ)上，采用大鼠大腦中動(dòng)脈結(jié)扎造成局灶性腦缺血模型，進(jìn)一步觀察了DZY02對(duì)腦缺血的保護(hù)作用；并采用OxLDL和TNFα誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，從抗氧化和內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)等角度，探討了作用機(jī)制，旨在為燈盞乙素乙酯開發(fā)成為防治腦缺血的新藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物及細(xì)胞株

SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體重200～220 g，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，合格證號(hào)SCXK（京）20090017。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所崔紅玉惠贈(zèng)。

1.2 藥物及試劑

燈盞乙素乙酯（中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中心高慧敏研究員提供，批號(hào)140210）；尼莫地平購(gòu)自天津市中央藥業(yè)有限公司（批號(hào)130106）；燈盞花素片購(gòu)自廣東彼迪藥業(yè)有限公司（批號(hào)20131101）；紅四氮唑（TTC，美國(guó)Amresco試劑公司）；總超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒（批號(hào)20131228）、丙二醛（MDA）測(cè)試盒（批號(hào)20131230）、一氧化氮（NO）測(cè)試盒（批號(hào)20140318）均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；Hyclone DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Thermo公司（批號(hào)NYK0997）；胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司（批號(hào)130928）；0.25%胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司（批號(hào)1155732）；DMSO（ACS級(jí)）購(gòu)自美國(guó)Amereso公司；噻唑藍(lán)（MTT）購(gòu)自Sigma公司；OxLDL購(gòu)自北京協(xié)生生物技術(shù)有限公司（批號(hào)20140109，質(zhì)量濃度1.32 g·L-1）；內(nèi)皮素（ET）放免試劑盒（批號(hào)20150620）、6酮前列腺素1α（6ketoPGF1α）放免試劑盒（批號(hào)20150620），血栓烷素B2（TXB2）放免試劑盒（批號(hào)20150620）均購(gòu)自北京北方生物技術(shù)研究所；白介素1（IL1）定量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)201607AO201701AC）、白介素6（IL6）定量檢測(cè)試劑盒（批號(hào) 201607AN201701ZC）、白介素8（IL8）定量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)201607JD201701AT）均購(gòu)自上海騫億生物科技有限公司。MCAO栓線（北京沙東生物技術(shù)有限公司，編號(hào)2432A3100）。

1.3 儀器

SWCF2FD雙人單面超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）；MCO18AIC（UV）型CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Scientific公司）；GFD800半自動(dòng)生化儀﹙山東高密彩虹分析儀器有限公司）。

2 方法

2.1 燈盞乙素乙酯對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈結(jié)扎所致局灶性腦缺血的保護(hù)作用

2.1.1 分組與給藥 84只大鼠隨機(jī)分為7組，每組12只。假手術(shù)組及模型組給予等量蒸餾水；按體表面積法換算等量動(dòng)物的等效劑量，陽性藥尼莫地平組給予12 mg·kg-1；燈盞花素片組給予48 mg·kg-1；燈盞乙素乙酯組分高、中、低劑量組，分別為給予100，50，25 mg·kg-1。每日灌胃給藥1次，連續(xù)12 d；術(shù)后各組再給藥1次。DZY02藥物配制：將DZY02與MCT（中鏈甘油三酸酯）混合并充分研磨至均勻后，加阿拉伯膠，并加入少量水，研磨，使之乳化成初乳，再逐漸加水稀釋至全量，其中DZY02，MCT和阿拉伯膠比例為1∶2∶4。

2.1.2 大腦中動(dòng)脈梗塞動(dòng)物模型[3]（MCAO法） 大鼠用350 mg·kg-1的水合氯醛腹腔注射麻醉。頸部正中切口約2 cm，在一側(cè)的肩胛舌骨和胸鎖乳突肌形成的三角處暴露頸總動(dòng)脈（CCA）及其分支頸外動(dòng)脈（ECA）、頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）。結(jié)扎ECA及其分支枕動(dòng)脈、甲狀腺上動(dòng)脈及ECA終末支，分離ICA的分支翼突腭動(dòng)脈。夾閉CCA，ICA及翼突腭動(dòng)脈，將前端燒成0.3 mm小球的尼龍線自ECA切口插入，導(dǎo)入至ICA，松開ICA，繼續(xù)插入尼龍線至其顱內(nèi)段，當(dāng)感到有明顯阻力時(shí)，此時(shí)插入尼龍線距CCA分叉處約2 cm，即可阻斷大腦中動(dòng)脈（MCA）。假手術(shù)動(dòng)物插線入1 cm，其余處理同模型。

2.1.3 神經(jīng)功能評(píng)分[4] 在大腦中動(dòng)脈結(jié)扎24 h，按Longa評(píng)分的5級(jí)4分法進(jìn)行評(píng)分。0分：無明顯神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：神經(jīng)功能輕微缺損，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分：局灶性神經(jīng)功能中度缺損，向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)；3分：局灶性神經(jīng)功能重度缺損，行走時(shí)向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自行行走及昏迷。

2.1.4 腦梗死面積檢測(cè) 大腦中動(dòng)脈結(jié)扎后24 h，動(dòng)物處死取腦，梗死部位切成2 mm厚片，放入已配好的TTC 5 mL染液瓶中，立即放入37 ℃水浴，20～30 min后取出染液瓶，棄染液，在原瓶?jī)?nèi)放入5 mL的10%甲醛，固定24 h，取出稱重。腦切片染色后掃描（采用PhotoShop 6.0 軟件測(cè)量像素，分析梗死面積[5]），計(jì)算腦重指數(shù)和梗死率。腦重指數(shù)=腦重/體重×100%；梗死率=梗死面積/全腦面積×100%。

2.1.5 MDA，SOD和NO檢測(cè) 大腦中動(dòng)脈結(jié)扎后24 h，腹主動(dòng)脈采血5 mL，3 000 r·min-1離心15 min以分離血清，用于MDA，SOD和NO的測(cè)定。

2.2 燈盞乙素乙酯對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈結(jié)扎所致局灶性腦缺血保護(hù)作用的機(jī)制研究

2.2.1 DZY02母液的配制 取DZY02粉末約1 mg，精密稱定，溶于50 μL DMSO中，用不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋至10 mL，超聲2 h促進(jìn)藥物溶解，藥物終濃度為100 mg·L-1。超聲后用0.45 μm微孔濾膜過濾除菌，實(shí)驗(yàn)時(shí)用不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基配成所需濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 復(fù)蘇的HUVECs，按4.0×104個(gè)/mL的密度接種于20 mm×100 mm培養(yǎng)皿中，加入10 mL的10%FBS DMEM培養(yǎng)基（含1×105 U·L-1青霉素，100 mg·L-1鏈霉素，20 mmol·L-1的谷氨酰胺），置37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。次日換液，2～3 d待細(xì)胞長(zhǎng)至融合后，以0.25%胰酶EDTA消化按1∶3傳代，細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期用于實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 OxLDL誘導(dǎo)HUVECs損傷模型建立及藥物預(yù)處理 OxLDL以200 mg·L-1作用細(xì)胞24 h為造模條件。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HUVEC細(xì)胞，以7.0×104 個(gè)/mL接種于96孔板，每孔0.1 mL，24 h細(xì)胞貼壁后，分為對(duì)照組、模型組、DZY02組（2.5，5，10 mg·L-1，無血清DMEM溶解，過濾除菌）；給藥組DZY02預(yù)先干預(yù)24 h，對(duì)照組和模型組給予等量的無血清培養(yǎng)基。24 h后，吸棄上清，模型組和給藥組加入終濃度200 mg·L-1OxLDL的培養(yǎng)基，對(duì)照組不做處理，各組均置37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

2.2.4 TNFα誘導(dǎo)細(xì)胞損傷模型的建立及藥物預(yù)處理 TNFα以100 μg·L-1作用細(xì)胞為造模條件。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HUVEC細(xì)胞，以7.0×104 個(gè)/mL接種于96孔板，每孔0.1 mL，24 h細(xì)胞貼壁后，分為對(duì)照組、模型組、DZY02組（2.5，5，10 mg·L-1，無血清DMEM溶解，過濾除菌）；給藥組DZY02預(yù)先干預(yù)24 h，對(duì)照組和模型組給予等量的無血清培養(yǎng)基。24 h后，吸棄上清，模型組和給藥組加入終濃度100 μg·L-1TNFα的培養(yǎng)基，對(duì)照組不做處理，各組均置37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

2.2.5 細(xì)胞存活率測(cè)定 模型處理結(jié)束后，吸出上清液，每孔加入200 μL培養(yǎng)基和50 g·L-1的MTT 20 μL孵育4 h，吸出上清液，每孔加入DMSO 150 μL，搖床避光震蕩15 min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度（A），吸收波長(zhǎng)為570 nm，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

2.2.6 MDA，SOD，NO/ET，6ketoPGF1α/TXB2，ICAM1，PECAM1及IL1，IL6，IL8的測(cè)定 模型處理結(jié)束后，吸出上清液，按試劑盒說明進(jìn)行測(cè)定。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)（假手術(shù)組與模型組）或ANOVA單因素方差分析，組間比較方差齊時(shí)采用LDS，方差不齊時(shí)采用GamesHowell；有序資料采用Ridit分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 燈盞乙素乙酯對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈結(jié)扎所致局灶性腦缺血的保護(hù)作用

3.1.1 對(duì)腦缺血大鼠大鼠腦梗死體積及梗死率的影響 燈盞乙素乙酯高、中、低3個(gè)劑量組均明顯降低腦缺血大鼠腦梗體積和梗死率，與模型組比較，具有顯著性差異（P<0.05或P<0.01），見表1。

3.1.2 對(duì)腦缺血大鼠行為評(píng)分的影響 腦缺血大鼠行為學(xué)評(píng)分，模型組與假手術(shù)組比較，有顯著性差異（P<0.01）；各給藥組與模型組比較，也均有顯著差異（P<0.05或P<0.01），提示燈盞乙素乙酯及陽性藥均對(duì)腦缺血大鼠的行為學(xué)有明顯的改善作用；而各給藥組之間的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分無顯著差異，見表2。

3.1.3 對(duì)腦缺血大鼠血清SOD，MDA及NO含量的影響 燈盞乙素乙酯低劑量組提高SOD和NO活性，降低MDA含量，與模型組比較，有顯著性差異（P<0.05或P<0.01）；高、中劑量組對(duì)其沒有影響，尼莫地平和燈盞花素提高SOD 活性，見表3。

3.2 燈盞乙素乙酯對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈結(jié)扎所致局灶性腦缺血作用的機(jī)制研究

3.2.1 對(duì)OxLDL誘導(dǎo)HUVECs損傷的影響 與對(duì)照組比較，200 mg·L-1的OxLDL可明顯降低HUVEC的存活率（P<0.01）。與模型組相比，DZY02組（2.5，5，10 mg·L-1）3個(gè)濃度可顯著提高OxLDL誘導(dǎo)的HUVECs的存活率（P<0.05），見表4。

3.2.2 對(duì)OxLDL誘導(dǎo)HUVECs損傷細(xì)胞上清液中MDA和SOD含量的影響 與對(duì)照組相比，模型組MDA含量明顯升高（P<0.01），SOD及NO含量降低（P<0.01）。藥物處理組與模型組相比，DZY02組（2.5，5，10 mg·L-1）MDA含量顯著降低（P<0.05），SOD及NO含量顯著升高（P<0.05），見表5。

3.2.3 對(duì)OxLDL誘導(dǎo)HUVECs損傷細(xì)胞上清液中NO/ET，6ketoPGF1α，TXB2含量的影響 與對(duì)照組相比，模型組中ET，TXB2的含量明顯升高（P<0.01），NO及6ketoPGF1α含量降低（P<0.01）。各藥物處理組與模型組比較（2.5，5，10 mg·L-1），使ET，TXB2的含量顯著降低，NO和6ketoPGF1α含量升高（P<0.01），見表6。

3.2.4 對(duì)OxLDL誘導(dǎo)HUVECs損傷細(xì)胞上清液中ICAM1和PECAM1的影響 與空白組比較，模型組ICAM1和PECAM1含量明顯升高（P<0.01），與模型組相比，3個(gè)給藥組（2.5，5，10 mg·L-1）能顯著降低ICAM1和PECAM1的含量（P<0.05），見表7。

3.2.5 對(duì)TNFα誘導(dǎo)損傷的HUVECS存活率的影響 與空白組比較，100 μg·L-1的TNFα可明顯降低HUVEC的存活率（P<0.001）。與模型組相比，經(jīng)DZY02預(yù)先干預(yù)24 h后，2.5，5，10 mg·L-13個(gè)劑量均提高了HUVEC的存活率（P<0.05），并且隨著藥物劑量增加呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，見表8。

3.2.6 對(duì)TNFα誘導(dǎo)損傷的HUVECs分泌炎性因子的影響 與空白組比較，模型組的IL1，IL6，IL8含量明顯升高（P<0.05），與模型組比較，DZY02組2.5，5，10 mg·L-13個(gè)劑量顯著降低了IL1，IL6和IL8的含量（P<0.05），見表9。

3.2.7 對(duì)TNFα誘導(dǎo)損傷的HUVECs分泌ICAM1和PECAM1的影響 與空白組比較，模型組的ICAM1和PECAM1含量明顯升高（P<0.01），與模型組比較，DZY02組2.5，5，10 mg·L-13個(gè)劑量顯著降低了ICAM1和PECAM1的含量（P<0.05），見表10。

4 討論

缺血性腦血管疾?。↖CVD）是目前世界上致死率較高的疾病之一，主要由短暫性和持久性的局部

腦缺血引起，其發(fā)生和發(fā)展是多因素、多機(jī)制及多環(huán)節(jié)的惡性級(jí)聯(lián)過程，可能與自由基損傷、炎性反應(yīng)及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)[6]。本文從行為學(xué)、形態(tài)學(xué)及生物標(biāo)志物等方面證實(shí)了燈盞乙素乙酯對(duì)大鼠局灶性腦缺血損傷的保護(hù)作用；并從抗氧化、炎性反應(yīng)

和內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)等角度，進(jìn)一步證實(shí)了燈盞乙素乙酯對(duì)腦缺血損傷的保護(hù)作用可能與抗氧化應(yīng)激，降低炎性反應(yīng)及保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能有關(guān)。

4.1 對(duì)MCAO損傷后大鼠神經(jīng)功能缺損及腦梗死體積的改善作用

MCAO損傷是一種常見的臨床病理生理過程，由此引發(fā)的腦腫脹，可引起神經(jīng)功能障礙，并最終導(dǎo)致死亡[7]。大腦調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)區(qū)域的血流主要由MCA提供，MCA阻斷后該區(qū)域腦組織發(fā)生缺血性損傷，因此，MCAO損傷后大鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能障礙，表現(xiàn)為肢體肌無力，運(yùn)動(dòng)時(shí)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，燈盞乙素乙酯能夠降低神經(jīng)動(dòng)能評(píng)分及腦梗死體積，提示燈盞乙素乙酯可以改善MCA大鼠的神經(jīng)功能障礙，對(duì)腦缺血性損傷具有保護(hù)作用。

4.2 提高M(jìn)CAO損傷后大鼠的抗氧化應(yīng)激能力

腦缺血性損傷的發(fā)病機(jī)制涉及多因素，但主要與缺血本身直接攻擊腦細(xì)胞，造成腦組織壞死，影響細(xì)胞內(nèi)部的基因調(diào)控，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，而這2個(gè)因素都與氧化應(yīng)激密不可分。MDA是氧自由基引發(fā)的生物膜不飽和脂肪酸過氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，反映了細(xì)胞損傷程度。SOD作為天然抗氧化劑，能夠清除體內(nèi)的氧自由基，其活性反映了機(jī)體清除氧自由基的能力[8]。本實(shí)驗(yàn)觀察到，MCAO損傷模型組大鼠血漿MDA水平升高，SOD活性降低，說明腦缺血后機(jī)體氧自由基大量產(chǎn)生，而清除氧自由基能力障礙。燈盞乙素乙酯能夠降低MDA水平，提高SOD活性和NO水平，表明其能夠減輕腦缺血引起的氧自由基損傷，具有一定的抗氧化應(yīng)激作用。

4.3 燈盞乙素乙酯對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈結(jié)扎所致局灶性腦缺血作用的機(jī)制研究

缺血性損傷引起腦組織中鈣超載，氧自由基（氧化應(yīng)激）和炎性因子大量生成，三者之間可互相促進(jìn)。在缺血性損傷發(fā)生后的數(shù)小時(shí)內(nèi)，炎性因子表達(dá)的顯著增加會(huì)引發(fā)腦組織損傷，從而導(dǎo)致氧自由基的產(chǎn)生[9]，過量的自由基通過破壞膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。神經(jīng)細(xì)胞脂質(zhì)膜的損傷使其通透性增加，又造成鈣離子超載及促炎因子的大量釋放，進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激過程。氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)互相促進(jìn)，誘導(dǎo)細(xì)胞中凋亡基因表達(dá)，促使細(xì)胞凋亡，造成了腦組織缺血后連鎖反應(yīng)。缺血后的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)是腦組織不可逆損傷的重要機(jī)制之一。因此，本文分別采用OxLDL和TNFα誘導(dǎo)損傷的HUVECs 模型，從抗氧化應(yīng)激，血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)和影響炎性反應(yīng)的角度，探討燈盞乙素乙酯的作用機(jī)制。

ET和NO是近幾年發(fā)現(xiàn)的血管調(diào)節(jié)因子。ET具有強(qiáng)烈而持久的縮血管作用，而NO具有明顯的擴(kuò)血管作用，并抑制血小板聚集。正常狀態(tài)下，二者的合成釋放保持動(dòng)態(tài)平衡，維持血管的正常舒縮功能，ICVD 的發(fā)生發(fā)展與這種平衡的破壞有關(guān)[10]。PGI2是血管內(nèi)皮細(xì)胞合成釋放的具有舒血管和抗血小板聚集作用的生物活性物質(zhì)，而TXA2是促進(jìn)血小板聚集和血管收縮的生物活性物質(zhì)，兩者由于半衰期短，分別迅速轉(zhuǎn)化為6ketoPGF1α和TXB2[11]。正常生理狀態(tài)下，PGI2和TXA2 保持動(dòng)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)血管的舒縮活動(dòng)，防止血栓形成[12]。本文觀察到，在OxLDL損傷狀態(tài)下，HUVECs分泌NO和6ketoPGF1α減少，ET和TXB2分泌增多，NO/ET和6ketoPGF1α/TXB2比例失調(diào)，同時(shí)，MDA產(chǎn)生增多，SOD活性降低，表明氧化損傷能夠?qū)е聝?nèi)皮細(xì)胞功能紊亂并影響細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性物質(zhì)的分泌。燈盞乙素乙酯作用于OxLDL損傷的HUVECs后，增加NO和6ketoPGF1α的釋放，減少ET和TXB2的分泌，MDA產(chǎn)生減少，SOD活性升高，表明燈盞乙素乙酯對(duì)MCAO損傷后大鼠的保護(hù)作用可能與改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能和抗氧化應(yīng)激有關(guān)。

炎癥反應(yīng)在腦缺血損傷中起重要作用，在腦缺血早期炎癥介質(zhì)如IL1，IL6，IL8及TNFα等即可產(chǎn)生，是白細(xì)胞聚集，游出血管發(fā)揮細(xì)胞毒過程中的關(guān)鍵因素。白細(xì)胞聚集阻塞腦微血管，誘發(fā)血栓形成；游出的白細(xì)胞通過進(jìn)一步釋放炎性因子及氧自由基等直接損傷神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞，進(jìn)而加重，腦缺血后的繼發(fā)性腦損害[13]。本文采用TNFα誘導(dǎo)損傷的HUVECs模型，探討燈盞乙酸乙酯的作用機(jī)制，結(jié)果顯示，TNFα誘導(dǎo)損傷的HUVECs模型組，IL1，IL6，IL8明顯升高，燈盞乙酸乙酯降低IL1，IL6，IL8的釋放，表明減輕炎性反應(yīng)可能是燈盞乙素乙酯保護(hù)MCAO所致大鼠腦缺血損傷保護(hù)作用的機(jī)制之一。

ICAM1和PECAM1是免疫球蛋白超家族成員，與腦缺血后繼發(fā)神經(jīng)元損傷及炎性機(jī)制有密切關(guān)系。黏附分子的表達(dá)和活化是一個(gè)復(fù)雜而且高度調(diào)控的過程。多種介質(zhì)，如氧自由基、TNFα等均可以上調(diào)黏附分子的表達(dá)[14]。在局灶性腦缺血炎性反應(yīng)過程中，促進(jìn)白細(xì)胞的活化、聚集、遷移及與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附，進(jìn)而通過各種機(jī)制，加重腦組織損傷。本文在OxLDL和TNFα誘導(dǎo)HUVECs損傷的實(shí)驗(yàn)中觀察到，OxLDL和TNFα均升高ICAM1和PECAM1，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。燈盞乙素乙酯可以降低ICAM1和PECAM的分泌，表明黏附因子可能參與了燈盞乙素乙酯對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈結(jié)扎所致局灶性腦缺血的保護(hù)作用。

綜上所述，燈盞乙素乙酯對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈結(jié)扎所致局灶性腦缺血具有良好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抗氧化應(yīng)激，改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能及減輕炎性反應(yīng)有密切關(guān)系。

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