魏文峰　褚衍濤　劉燁　霍金?！⊥鮽ッ?/p>

[摘要] 采用超高效液相色譜與串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜（UPLCQTOFMS）聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)方法，分析肺炎支原體（MP）感染小鼠血清內(nèi)源性代謝物的變化，篩選出與肺炎支原體肺炎（MPP）相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物，分析代謝通路，探討MPP的致病機制。采用MP滴鼻感染的方法建立小鼠MPP模型，肺組織病理切片、IgM和支原體核酸的含量測定結(jié)果顯示造模成功。利用UPLCQTOFMS方法分析MP感染小鼠的血清代謝輪廓，利用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLSDA）方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。結(jié)果顯示MP感染模型小鼠的血清代謝譜與正常小鼠有顯著差別，經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索、質(zhì)譜信息匹配，篩選出包括鳥氨酸、皮質(zhì)醇、維生素A、色氨酸等47種生物標(biāo)志物，涉及視黃醇代謝、精氨酸與脯氨酸代謝、甾類激素合成等17條代謝通路。該文建立了基于UPLCQTOFMS技術(shù)的MP感染小鼠血清代謝組學(xué)研究方法，從整體水平反映了MP感染小鼠內(nèi)源性小分子的代謝變化，為進(jìn)一步在分子水平進(jìn)行藥物篩選與評價奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞] 肺炎支原體； 代謝組學(xué)； 超高效液相色譜飛行時間質(zhì)譜； 模式識別

Serum metabonomics in mice infected with mycoplasma

pneumoniae by UPLCQTOFMS

WEI Wenfeng， CHU Yantao， LIU Ye， HUO Jinhai， WANG Weiming*

（Heilongjiang Academy of Chinese Medical Sciences， Harbin 150036， China）

[Abstract] Ultra high performance liquid chromatography coupled with tandem quadrupole time of flight mass spectrometry（UPLCQTOFMS） was applied to metabonomics study in BALB/c mice infected with mycoplasma pneumoniae（MP） to analyze the changes in serum endogenous metabolites， identify potential biomarkers associated with mycoplasma pneumoniae pneumonia（MPP）， analyze the metabolic pathway and explore the pathogenic mechanism of MPP. The BALB/c mice were inoculated with MP by repeated intranasal infectious routes to establish MPP models， and the results of the lung tissue biopsy， IgM and mycoplasma nucleic acid content determination showed that the models of MP in BALB/c mice were successfully established. UPLCQTOFMS was used to analyze the serum metabolic profiling of BALB/c mice infected with MP， and then principal component analysis（PCA） was combined with orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLSDA） for data processing. The results showed that there were significant differences in serum metabolic profile between the MP infected mice and the normal mice. Fortyseven potential biomarkers such as ornithine， cortisol， vitamin A and tryptophan were screened out by database searching and MS information matching. These potential biomarkers related to 17 metabolic pathways including retinol metabolism， arginine and proline metabolism， steroid hormone synthesis and so on. The metabonomic research method for serum of mice infected with mycoplasma pneumoniae based on UPLCQTOFMS was established in this study. The metabolic changes of endogenous small molecules in mice infected with MP were reflected in the overall level， laying the foundation for the selection and evaluation of MPP drugs.

[Key words] mycoplasma pneumonia； metabolomics； ultraperformance liquid chromatography coupled with quadrupole timeofflight mass spectrometry； pattern recognition

肺炎支原體（mycoplasma pneumonia，MP）是引起呼吸道疾病和全身性病變的重要致病菌之一，可引起肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）。它是學(xué)齡前兒童和青少年時期最常見的肺炎之一，發(fā)病率為19.6%～21.9%，呈逐年增加趨勢[1]。小兒肺結(jié)構(gòu)發(fā)育不完善，經(jīng)過反復(fù)感染后，極易受損。MP主要通過飛沫傳播，引起上呼吸道和肺部感染，同時引起腦炎、 心肌炎、 肝炎、 關(guān)節(jié)炎等肺外組織或器官的病變。臨床表現(xiàn)多種多樣，嚴(yán)重時出現(xiàn)暴發(fā)型肺炎，發(fā)展迅速，最終因呼吸衰竭而死亡[2]。

MPP臨床檢測主要利用病原體培養(yǎng)法和血清學(xué)檢測確證。病原學(xué)檢測結(jié)果陽性率低，病原體培養(yǎng)結(jié)果明顯滯后，并且每種診斷都有其局限性，臨床上常采用多種檢測手段聯(lián)合應(yīng)用的方式，但是仍有高達(dá)40%～50%的社區(qū)獲得性肺炎不能確定相關(guān)病原體，嚴(yán)重影響早期的抗菌藥物選擇[3]。代謝組學(xué)從整體觀出發(fā)，以機體代謝物組變化為載體，以時空動態(tài)性和全局性觀點，試圖全面解析疾病對機體的影響[4]。代謝組學(xué)技術(shù)已經(jīng)在實驗動物模型評價中展現(xiàn)了其特色和優(yōu)勢[56]，但目前關(guān)于支原體肺炎代謝組學(xué)的研究尚未見報道。

本研究利用代謝組學(xué)研究方法，以MP感染小鼠血清為研究對象，采用UPLCQTOF 液質(zhì)分析，并通過化學(xué)計量學(xué)模式識別的方法，發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物（potential biomaker）并鑒定，解析代謝通路。從代謝組學(xué)角度闡明MPP的致病機制，為其有效防治提供新理論，促進(jìn)治療MPP藥物的篩選和開發(fā)。

1 材料

ACQUITYTM UPLC液相色譜儀（美國Waters公司）；Sciex 5600+型質(zhì)譜儀（美國AB Sciex公司）；IKA MS3 digital渦旋振蕩器（廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司）；DH5000型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒儀器有限公司）；LDZX75KB型立式蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；DLCJ1N型超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；ST16R型高速低溫離心機（美國賽默飛世爾科技有限公司）。

肺炎支原體國際標(biāo)準(zhǔn)菌株FH（ATCC15531，美國菌種保藏中心）；PPLO培養(yǎng)基（碧迪醫(yī)療器械有限公司）；乙醚（分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；核酸定量檢測試劑盒（廣州中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）；甲醇（色譜級，Merck公司）；乙腈（色譜級，Merck公司）；甲酸（色譜級，Thermo Scientific）；屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

BALB/c雄性小鼠20只，SPF級，體重（20±2）g，北京維通利華實驗動物有限公司提供，許可證號SCXK（京）2012001。飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥科學(xué)院動物實驗中心，環(huán)境溫度 （20±2） ℃，相對濕度 （50±20）%。

2 方法

2.1 支原體培養(yǎng)與造模方法 支原體培養(yǎng)參見文獻(xiàn)[7]。小鼠支原體肺炎模型采用支原體滴鼻感染方法，將20只BALB/c小鼠隨機分為空白組和模型組，每組10只，乙醚麻醉，模型組取MP培養(yǎng)液20 μL緩慢滴入BALB/c小鼠鼻孔內(nèi)，每日1次，連續(xù)感染3 d?？瞻捉M給予無MP的培養(yǎng)液。

2.2 樣品采集與預(yù)處理 小鼠于造模結(jié)束后24 h采集樣本，采集前禁食12 h，各組由眼眶取血，血液靜置1 h后于3 000 r·min-1離心10 min取血清，-80 ℃凍存。取血后處死小鼠，剪取左肺組織10%甲醛固定，用以病理切片觀察；剪取右肺組織用于支原體核酸定量檢測。

HE 染色實驗：取甲醛固定的肺組織，用乙醇梯度脫水，二甲苯透明2 次，放入石蠟內(nèi)進(jìn)行包埋。蠟塊修好后固定于石蠟切片機上切片，將完全展開的蠟片貼附于清潔載玻片上，常規(guī)HE 染色，在顯微鏡下進(jìn)行MP 特異性病變間質(zhì)性肺炎的病理組織學(xué)檢查。

血清IgMMP測定：取各組血清樣品，同時設(shè)定對照孔和標(biāo)準(zhǔn)樣品孔，每孔加入50 μL樣品，50 μL IgM結(jié)合物，室溫孵育1 h，洗去孔內(nèi)液體，加入100 μL底物，室溫孵育30 min，加入100 μL終止液，于450 nm下讀取吸光度值。

支原體核酸含量測定：取肺組織100 mg加入100 μL純水，勻漿，吸取20 μL，加入等量DNA提取液，100 ℃保溫10 min，8 000 r·min-1離心5 min，取上清液2 μL用于測定，同時設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)曲線樣本、質(zhì)控樣本，測試方法參照試劑盒說明書設(shè)定相關(guān)程序。

代謝組學(xué)樣本測定：每個樣本取100 μL血清，加400 μL甲醇，渦旋30 s，4 ℃條件下13 000 r·min-1離心10 min，取上清液用于代謝組學(xué)分析。

2.3 色譜條件 Waters Acquity UPLC BEH C18 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相0.1%甲酸水（A）0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫，0～3 min，95%～40%A，3～4 min，40%A，4～9 min，40%～0%A，流速0.3 mL·min-1； 柱溫50 ℃；樣品倉溫度4 ℃；進(jìn)樣量3 μL；色譜儀流出液不分流直接注入質(zhì)譜儀進(jìn)行正負(fù)離子掃描檢測。

2.4 質(zhì)譜條件 采用ESI離子源，離子化模式為電噴霧正、負(fù)離子模式，正離子掃描模式參數(shù)：離子源電壓5 500 V；離子源溫度550 ℃；霧化氣55 psi（1 psi=6.895 kPa）；輔助氣55 psi；氣簾氣35 psi；去簇電壓80 V；碰撞能量35 eV；碰撞能量擴(kuò)展15 eV；TOFMS掃描范圍80～1 500；Product Ion掃描范圍50～1 500。掃描方式：IDA設(shè)置響應(yīng)值超過100 cps的8個最高峰進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，并開啟動態(tài)背景扣除（DBS）。Analyst TF 1.6 software采集工作站；采用AB Sciex公司的CDS質(zhì)量校正系統(tǒng)在線校正。負(fù)離子掃描模式：離子源電壓-4 500 V；去簇電壓（DP）-80 V；碰撞能量（CE）-35 eV；其余參數(shù)同正離子掃描模式。

2.5 數(shù)據(jù)處理 將所有生物樣本的UPLCMS數(shù)據(jù)導(dǎo)入MarKerview軟件，進(jìn)行峰匹配、峰對齊、峰提取和歸一化處理，進(jìn)而進(jìn)行主成分分析（PCA）及正交偏最小二乘法判別分析（OPLSDA），并采用正交信號校正技術(shù)過濾變量信息，通過代謝軌跡變化趨勢分析模型組與空白組的差異，確定主成分和潛在生物標(biāo)志物（Marker）。利用QTOF測定各Marker的精確相對分子質(zhì)量，對所篩查的具有顯著性差異的代謝物進(jìn)行分析，計算其可能的分子式。再通過分子式檢索Human Metabolome Database（HMDB）數(shù)據(jù)庫，結(jié)合文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)品確證的方式，鑒定潛在生物標(biāo)志物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。通過檢索代謝途徑數(shù)據(jù)庫KEGG和MetPA，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)、生物化學(xué)及分子生物學(xué)知識，探討潛在生物標(biāo)志物相關(guān)生物學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠肺組織病理變化 小鼠肺組織病理切片評分系統(tǒng)由1 個0～26分的可數(shù)評分組成[8]，5 個分類評價系統(tǒng)由管腔周圍浸潤而致的細(xì)支氣管和支氣管數(shù)目、管腔周圍浸潤的程度、管腔內(nèi)滲出的嚴(yán)重度、血管周圍浸潤的頻度、實質(zhì)性肺炎的嚴(yán)重度合并后記分，每張切片選擇5 個視野評分?？瞻捉M支氣管、肺泡、血管等無明顯病變，上皮細(xì)胞狀態(tài)良好，肺組織中未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組支氣管中度改變，官腔有大量分泌物，肺泡上皮壞死，彌漫性細(xì)胞浸潤，邊緣模糊，病變面積較大，肺泡腔內(nèi)伴以淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤，嚴(yán)重者伴有紅細(xì)胞滲入（表1，圖1）。

3.2 血清IgM與MP核酸定量 與空白組相比，模型組血清IgM含量極顯著升高（P<0.01）（圖2），MP核酸數(shù)量顯著上升（P<0.01）（圖3），顯示模型復(fù)制成功。

3.3 小鼠血清代謝組學(xué)分析 采用UPLCMS進(jìn)行血清樣本的分離與數(shù)據(jù)采集，將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入MarkerView軟件進(jìn)行PCA無監(jiān)督分析（圖4），在正離子2個主成分（PC1：82.2；PC2：4.6）和負(fù)離子2個主成分（PC1：56.1；PC2：11.2）構(gòu)建的得分圖可直觀看出，空白組與模型組有顯著分開趨勢。為進(jìn)一步區(qū)分不同組別差異，對2組血清代謝物進(jìn)行有監(jiān)督的OPLSDA分析（圖5），正離子模式的模型參數(shù)為R2=0.959 5，Q2=0.880 9，負(fù)離子模型參數(shù)為R2=0.986 2，Q2=0.961 4，參數(shù)顯示所構(gòu)建模型有效，可用于后續(xù)組間差異成分的尋找及分析。結(jié)合MarkerView軟件中t檢驗包篩選在2組中有顯著性差異（P<0.05）的離子，t檢驗得到的火山圖及其結(jié)合Fold圖且Fold Change>1.5倍，篩選出對分型貢獻(xiàn)較大且具有顯著性差異的離子作為潛在的生物標(biāo)志物進(jìn)行分析鑒定（圖6）。

3.4 MPP潛在生物標(biāo)志物鑒定 潛在標(biāo)志物的鑒定方法為通過一級質(zhì)譜信息確定相對分子量， 利用二級質(zhì)譜信息獲得其結(jié)構(gòu)碎片信息。通過HMDB，KEGG，METLIN等多個數(shù)據(jù)庫檢索，共推斷出47個生物標(biāo)志物，并列舉了各生物標(biāo)志物在空白組和模型組中的表達(dá)水平。與空白組相比，模型組代謝物水平升高的有20種，降低的有27種（表2）。

3.5 代謝通路分析 應(yīng)用MetPA網(wǎng)站構(gòu)建分析代謝通路，并選擇小鼠物種，將推斷的47個代謝物的HMDB編號輸入進(jìn)行代謝通路分析（圖7）。利用拓?fù)浞治?，代謝通路影響的臨界值設(shè)置為0.01，大于這個值將選擇作為潛在的關(guān)鍵代謝通路（表3）。與支原體肺炎相關(guān)的代謝通路共涉及視黃醇代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、甾類激素合成、色氨酸代謝、嘌呤代謝等17個代謝途徑。

3.6 生物標(biāo)志物與生化病理指標(biāo)的相關(guān)性分析 選取OPLSDA中Fold Change>2的差異變量化合物與IgM含量、MP含量及病理切片中病變面積總分進(jìn)行相關(guān)性分析，找出代謝物與病理生化指標(biāo)的相關(guān)性并列出相關(guān)系數(shù)（表4）。結(jié)果表明，5羥吲哚乙酸、2氨基辛酸、賴氨酸、L色氨酸與MP含量有極度相關(guān)性，D2羥谷氨酸、賴氨酸、L色氨酸、對甲酚與病理面積總分有極度相關(guān)性，D2羥谷氨酸、2氨基辛酸、賴氨酸與IgM含量極度相關(guān)。

4 討論

經(jīng)前期實驗摸索，本研究從生化指標(biāo)和肺組織病理指標(biāo)判斷，MPP模型動物造模成功，進(jìn)一步利用代謝組學(xué)方法結(jié)合UPLCQTOFMS技術(shù)，研究MPP小鼠血清內(nèi)源性代謝物的變化規(guī)律。本課題組已熟練掌握肺炎支原體培養(yǎng)、測定及滴鼻感染小鼠的造模方法[8]，經(jīng)前期實驗摸索確定了肺炎支原體感染小鼠的劑量。在UPLCQTOFMS測定中，每間隔5個樣品進(jìn)樣1個QC樣品，選取QC樣品中不同保留時間段內(nèi)響應(yīng)值高的5個化合物質(zhì)控分析，選取化合物的保留時間及峰面積的RSD均小于1.0%，保證此評價方法的可靠性。利用模式識別的數(shù)據(jù)處理方式初步判定47個生物標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)其中對正常組和模型組區(qū)分貢獻(xiàn)較大的代謝物涉及了17條代謝通路。

維生素A（VA）涉及到視黃醇代謝，對維持視覺并促進(jìn)機體生長發(fā)育有重要作用，另外可以增強機體的免疫反應(yīng)[9]。VA的缺乏可引起氣管、支氣管上皮細(xì)胞發(fā)育受阻，細(xì)胞脫落，氣道上皮完整性遭到破壞。本研究中，模型組VA水平降低，提示MPP可引起VA水平下降，進(jìn)而導(dǎo)致氣道上皮完整性的破壞和機體免疫功能下降。

鳥氨酸和乙酰氨基丁酸涉及精氨酸和脯氨酸代謝，本研究中模型組小鼠的鳥氨酸水平降低，鳥氨酸轉(zhuǎn)化作用增強，乙酰氨基丁酸水平降低，說明聚肽類進(jìn)一步轉(zhuǎn)化的作用下降，提示腐胺等聚肽類水平升高，直接或間接影響細(xì)胞的pH[10]。文獻(xiàn)報道，在小鼠哮喘模型的肺組織中聚肽類水平有所增加。同時因為VA的缺乏，氣道上皮的損傷和脫落，炎性細(xì)胞的浸潤等，氣道壁結(jié)構(gòu)易發(fā)生改變，氣道動力出現(xiàn)滯緩，在一定程度上導(dǎo)致了支原體肺炎患者的哮喘癥狀。

色氨酸涉及色氨酸代謝，體內(nèi)氨基酸作為蛋白質(zhì)合成原料及分解代謝產(chǎn)物，參與多種生理和病理過程，其水平的高低往往可以反映機體的代謝情況。色氨酸是人體必需氨基酸之一，在肝臟以外，色氨酸主要通過降解為犬尿氨酸進(jìn)行代謝，該過程受吲哚胺2，3雙加氧酶（IDO）影響，IDO是色氨酸犬尿氨酸轉(zhuǎn)化途徑的限速酶，炎癥因子干擾素γ（IFNγ）是其誘導(dǎo)劑[11]。本研究中，模型組色氨酸水平降低，加速了色氨酸犬尿氨酸途徑，提示機體炎癥明顯。

次黃嘌呤和尿酸涉及嘌呤代謝，嘌呤是動物基因結(jié)構(gòu)的一部分，在機體中起著代謝調(diào)節(jié)、能量供應(yīng)等重要作用。次黃嘌呤和尿酸是腺嘌呤和鳥嘌呤的代謝產(chǎn)物，其中，次黃嘌呤來自一磷酸腺苷的分解代謝，該過程受氧氣含量影響較大，缺氧時，一磷酸腺苷會加速分解，導(dǎo)致次黃嘌呤含量在血中增加[12]。本研究中，模型組次黃嘌呤和尿酸含量升高，可能由于肺組織充血、水腫等，導(dǎo)致氣管和支氣管管壁增厚，管腔變得狹窄，進(jìn)而影響通氣，同時肺泡腔因為滲出阻礙氣體交換，從而引起缺氧環(huán)境而致。

綜上所述本研究采用UPLCQTOFMS技術(shù)結(jié)合模式識別數(shù)據(jù)分析手段，進(jìn)行了小鼠支原體肺炎的血清代謝組學(xué)研究。共標(biāo)識了47種生物標(biāo)志物，并且呈現(xiàn)一定的上調(diào)或下調(diào)趨勢，這些生物標(biāo)志物涉及17條代謝通路，其中視黃醇代謝、精氨酸與脯氨酸代謝、甾類激素合成等代謝途徑與肺組織損傷、炎癥反應(yīng)、免疫抑制有密切關(guān)聯(lián)。本研究從整體水平反映了支原體肺炎內(nèi)源性小分子的代謝變化，有助于MPP代謝網(wǎng)絡(luò)的全面構(gòu)建及疾病診斷，為抗MPP藥物的選擇與評價奠定了基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯 曹陽陽]