劉秦　邵明

[摘要] 目的 探討磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因（PCK1）啟動(dòng)子-232位點(diǎn)基因多態(tài)性與動(dòng)脈硬化性腦梗死的關(guān)系。 方法 選擇2012年5月～2013年2月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）神經(jīng)內(nèi)科住院的動(dòng)脈硬化性腦梗死患者128例為腦梗死組，同時(shí)選擇在我院體檢中心體檢的70名健康成人為對(duì)照組。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法，進(jìn)行PCK1啟動(dòng)子-232基因多態(tài)性分析；測(cè)定血糖、血脂；頸動(dòng)脈超聲多普勒檢查頸總動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度（IMT）及頸動(dòng)脈斑塊。 結(jié)果 腦梗死組GC、GG基因型餐后2 h血糖及低密度脂蛋白膽固醇水平均高于CC基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。腦梗死組GC、GG基因型及G等位基因頻率明顯高于對(duì)照組（P < 0.05）。腦梗死組GG+GC基因型及G等位基因在易損斑塊和非易損斑塊中的分布情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。兩組不同基因型之間左、右側(cè)頸總動(dòng)脈IMT比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 PCK1啟動(dòng)子-232基因多態(tài)性與廣東地區(qū)漢族人群動(dòng)脈硬化性腦梗死的關(guān)系密切，G等位基因可能是腦梗死的易感因素。

[關(guān)鍵詞] 腦梗死；磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶；啟動(dòng)子；基因多態(tài)性

[中圖分類號(hào)] R743 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）12（c）-0036-05

[Abstract] Objective To study the relationship between the polymorphism of phosphoenolpyruvate carboxykinase （PCK1） gene promoter-232 and atherosclerotic cerebral infarction. Methods 128 patients with atherosclerotic cerebral infarction admitted in Department of Neurology， the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University （"our hospital" for short） from May 2012 to February 2013 were selected as cerebral infarction group， and 70 healthy adults were selected as control group in the physical examination center of our hospital. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism （PCR-RFLP） was used to analyze the PCK1 promoter-232 gene polymorphism. The blood glucose and plasma lipids were measured. The carotid intima-media thickness （IMT） and CAP were detected with carotid ultrasonagraphic Doppler. Results Postprandial 2 h blood glucose and low density lipoprotein cholesterol levels of GC， GG genotype in cerebral infarction group were significantly higher than those of CC genotype， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The ratio of GC， GG genotype and G allele in cerebral infarction group were significantly higher than those in control group （P < 0.05）. The distribution of GG+GC genotype and G allele in vulnerable plaque and vulnerable plaque of cerebral infarction group were compared， the differences were statistically significant （P < 0.05）. IMT of left and right carotid artery different genotypes in two groups were compared， with no statistical difference （P > 0.05）. Conclusion PCK1 promoter-232 gene polymorphism is closely correlated with atherosclerotic cerebral infaction， G allele may be a predisposing factor for cerebral infarction.

[Key words] Cerebral infarction； Phosphoenolpyruvate carboxykinase； Promoter； Gene polymorphism

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因（PCK1）所編碼磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK-C），是糖異生和甘油異生的限速酶[1-3]，PCK1的表達(dá)受胰高血糖素和胰島素的調(diào)控，前者促進(jìn)，后者抑制[4-6]。PCK1存在多個(gè)限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性位點(diǎn)，特別在PCK1啟動(dòng)子區(qū)的-232G→C，有試驗(yàn)證實(shí)與2型糖尿病、胰島素抵抗及肥胖相關(guān)[1，7]，但關(guān)于PCK1啟動(dòng)子-232基因多態(tài)性與缺血性腦卒中之間關(guān)系的研究極少，本研究就此進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

連續(xù)收集2012年5月～2013年2月在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）神經(jīng)內(nèi)科住院患者128例為腦梗死組，其中男60例，女68例，年齡為45～81歲，平均（66.70±10.08），所有患者均有動(dòng)脈硬化性腦梗死的臨床特征，并通過(guò)頭顱CT和/或頭顱MR和MRA明確診斷，除外非動(dòng)脈硬化性腦梗死、梗死后出血和腦出血。對(duì)照組為我院體檢中心體格檢查的健康成人，無(wú)腦血管病及腦血管病家族史，共70名，其中男38名，女32名，年齡為37～82歲，平均（63.67±11.12）。所有研究對(duì)象均為廣東地區(qū)漢族自然人群，飲食結(jié)構(gòu)相似，對(duì)象之間無(wú)血緣關(guān)系，排除肝腎功能不全、自身免疫性疾病、合并慢性感染性疾病、心房顫動(dòng)、心瓣膜病、甲狀腺疾病、血液疾病、惡性腫瘤等，并簽署知情同意書。兩組性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本 征得參加者同意后，采集空腹靜脈血各兩個(gè)試管，每管2 mL，分為EDTA抗凝管和非抗凝管，抗凝管用于血基因組DNA提取，-80℃冰箱保存；非抗凝管用于檢測(cè)空腹血糖、總膽固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）等生化指標(biāo)，并在同一日抽取餐后2 h血糖。

1.2.2 頸動(dòng)脈超聲檢測(cè) 由我院B超室固定技師完成操作。采用美國(guó)產(chǎn)GE Vivid 7型彩色多普勒超聲心動(dòng)儀，探頭中心頻率7.0 MHz，分別檢測(cè)雙側(cè)頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）、頸總動(dòng)脈分叉處及頸內(nèi)動(dòng)脈顱外段縱橫軸實(shí)時(shí)二維圖像。舒張末期測(cè)量CCA近端1 cm、CCA分叉處及頸內(nèi)動(dòng)脈起始端1 cm后壁的內(nèi)膜中層厚度（intima-media thickness，IMT），雙側(cè)各測(cè)量3次IMT，取其平均值。仔細(xì)觀察血管內(nèi)膜及有無(wú)斑塊，斑塊的形態(tài)、大小及性質(zhì)。IMT診斷標(biāo)準(zhǔn)：①至少一個(gè)動(dòng)脈段的單個(gè)最大IMT 1.0 mm或局部有斑塊（IMT ≥ 1.2 mm可被診斷為斑塊）；②由以上而引起的管腔狹窄，依據(jù)第一點(diǎn)即可明確診斷。其中腦梗死組111例，對(duì)照組66例行頸動(dòng)脈彩超檢查。易損斑塊及非易損斑塊分類方法參照相關(guān)超聲診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.2.3 基因組DNA提取及PCR反應(yīng) 解凍保存的外周全血，取500 μL用血液基因組試劑盒抽提基因組DNA，方法按試劑說(shuō)明書進(jìn)行，抽提的基因組DNA置-20℃冷凍保存?zhèn)溆?。?yīng)用Primer Primer 5.0軟件并根據(jù)GenBank中序列設(shè)計(jì)、合成所需引物。上游引物為：5′-TGACATCTTATAGCTGTGGTGT-3′；下游引物為：5′-GTGCATTGCCAAATAGTTATTG-3′。

PCR反應(yīng)體系：總體積為25 μL，基因組DNA 2 μL，上下游引物各0.2 μL，10×Buffer 2.5 μL，Taq DNA polymerase 0.2 μL，ddH2O 15.1 μL。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃ 2 min；變性94℃ 45 S，退火52℃ 30 S，延伸72℃ 45 S，共36個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。反應(yīng)完成后吸5 μL用1%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后檢測(cè)。取PCR產(chǎn)物15 μL用試劑盒進(jìn)行純化，純化后用20 μL雙蒸水進(jìn)行溶解。

1.2.4 限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性分析 取PCR產(chǎn)物10 μL，內(nèi)切酶MaeⅢ 0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，ddH2O 12 μL以上各物混勻后，置56℃水溶箱中水溶2 h。取出用1%有瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切后帶型。

1.2.5 基因計(jì)數(shù)法 基因型、等位基因頻率采用基因計(jì)數(shù)法，等位基因頻率=（2×純合子+雜合子）/（2×受檢人數(shù)）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組比較正態(tài)分布資料采用t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布資料采用兩獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)；多組比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因型的判定

根據(jù)Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，計(jì)算PCK1啟動(dòng)子-232多態(tài)性基因型分布，檢驗(yàn)結(jié)果符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，認(rèn)為兩組來(lái)自平衡群體，具有代表性。見(jiàn)圖1。

2.2 PCK1啟動(dòng)子-232基因多態(tài)性與血糖的關(guān)系

腦梗死組及對(duì)照組PCK1啟動(dòng)子-232不同基因型間空腹血糖水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；腦梗死組GC、GG基因型餐后2 h血糖水平明顯高于CC基因型（P < 0.05），GG與GC基因型間餐后2 h血糖水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；對(duì)照組PCK1啟動(dòng)子-232不同基因型間餐后2 h血糖水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

2.3 PCK1啟動(dòng)子-232基因多態(tài)性與血脂的關(guān)系

腦梗死組及對(duì)照組PCK1啟動(dòng)子-232不同基因型間總膽固醇、三酰甘油、HDL-C水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；腦梗死組GC、GG基因型LDL-C水平明顯高于CC基因型（P < 0.05），GC與GG基因型間LDL-C水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；對(duì)照組PCK1啟動(dòng)子-232不同基因型間LDL-C水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表2。

2.4 PCK1啟動(dòng)子-232基因多態(tài)性與頸總動(dòng)脈IMT和斑塊的關(guān)系

2.4.1 PCK1啟動(dòng)子-232基因多態(tài)性與頸總動(dòng)脈IMT的關(guān)系 兩組PCK1啟動(dòng)子-232不同基因型間左、右側(cè)頸總動(dòng)脈IMT比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見(jiàn)表3。

2.4.2 PCK1啟動(dòng)子-232基因多態(tài)性與頸動(dòng)脈斑塊的關(guān)系 腦梗死患者中有斑塊者共95例，其中易損斑塊42例，非易損斑塊組53例；易損斑塊組中GG型16例、GC型20例，非易損斑塊組中GG型9例、GC型29例（由于GG型病例數(shù)較少，因此與GC型合并計(jì)算）。腦梗死組GG+GC基因型及G等位基因頻率與易損斑塊有關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表4。

2.5 PCK1啟動(dòng)子-232基因多態(tài)性與腦梗死的關(guān)系

腦梗死組GC、GG基因型頻率顯著高于對(duì)照組，CC基因型頻率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；腦梗死組G等位基因頻率高于對(duì)照組，C等位基因頻率低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表5。3 討論

2010年，腦卒中成為我國(guó)第一位死亡原因[9-10]，其中缺血性腦卒中占60%～80%[11]，動(dòng)脈粥樣硬化是缺血性腦卒中的重要致病因素[12]，血糖、血脂代謝異常、胰島素抵抗是動(dòng)脈硬化性腦梗死已經(jīng)明確的危險(xiǎn)因素[13-16]。

動(dòng)物試驗(yàn)顯示，在肝臟中過(guò)度表達(dá)PEPCK-C或在脂肪組織中減少PEPCK-C表達(dá)均可能引起2型糖尿病[1]。2004年，Cao等[7]首次報(bào)道了在加拿大人群中，人類PCK1啟動(dòng)子-232位點(diǎn)發(fā)生G→C的突變，會(huì)增加肝臟PEPCK-C的表達(dá)，從而增加患2型糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)（OR = 2.8，95%CI：1.7～4.7，P = 0.000 04）；在香港，也有針對(duì)南中國(guó)地區(qū)人群類似的研究支持該位點(diǎn)的突變與2型糖尿病相關(guān)[17]。目前的研究多集中于PCK1多態(tài)性與肥胖、胰島素抵抗、代謝綜合征等疾病的相關(guān)性[18-20]。

2005年，Hegele等[21]報(bào)道，具有PCK1-232 G/G基因型的人群頸動(dòng)脈IMT明顯高于其他基因型[（0.80±0.02）比（0.73±0.03）mm，P = 0.007]，但在頸動(dòng)脈斑塊數(shù)量上卻少于其他基因型，在國(guó)內(nèi)，也有研究發(fā)現(xiàn)，在PCK1其他基因位點(diǎn)多態(tài)性與頸動(dòng)脈IMT有關(guān)[22]，既往研究發(fā)現(xiàn)，PCK1啟動(dòng)子-232位點(diǎn)GC基因型與頸動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)[23]。

本文報(bào)道了PCK1啟動(dòng)子-232位點(diǎn)多態(tài)性與廣東漢族人群動(dòng)脈硬化性腦梗死發(fā)病存在相關(guān)性。本研究顯示，啟動(dòng)子-232位點(diǎn)GC基因型及G等位基因與腦梗死有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），G等位基因可能是腦梗死的易感基因。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)，GC、GG基因型與CC基因型比較，餐后2 h血糖、LDL-C明顯升高，因此推測(cè)PCK1該位點(diǎn)通過(guò)對(duì)血糖、血脂等因素來(lái)影響腦梗死的發(fā)生。

與既往的研究不同，我們發(fā)現(xiàn)PCK1啟動(dòng)子-232三個(gè)基因型間與頸動(dòng)脈IMT無(wú)明顯關(guān)系，但在易損斑塊中，GG+GC基因型及G等位基因頻率較非易損斑塊升高（P < 0.05），提示該位點(diǎn)多態(tài)性可能與易損斑塊的形成有關(guān)。

動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死是環(huán)境與遺傳相互作用的多因素疾病，本研究結(jié)果僅是單基因研究得出的結(jié)論，同時(shí)還有研究對(duì)象數(shù)量及研究人群種族的局限性，因此更多的工作有待開(kāi)展。

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（收稿日期：2016-09-18 本文編輯：李亞聰）