李秀楠　吳玉梅　劉愛蕙

[摘要] 目的 探討miR-27b在雌激素受體（ER）陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化及他莫昔芬耐藥中的調(diào)控機(jī)制。 方法 通過(guò)反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定miR-27b的表達(dá)。用雙熒光素酶報(bào)告和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-27b對(duì)HMGB3的靶向調(diào)控作用。在他莫昔芬敏感（TamS）或耐藥（TamR）的MCF-7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-27b或敲減HMGB3后測(cè)定細(xì)胞活力，分析上皮和間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)，檢測(cè)細(xì)胞侵襲力。 結(jié)果 TamR MCF-7細(xì)胞中miR-27b的水平約為TamS MCF-7細(xì)胞的20%。過(guò)表達(dá)miR-27b增加了4-羥基他莫昔芬（4-OHT）對(duì)TamR MCF-7細(xì)胞的活力抑制。TamS與TamR細(xì)胞在miR-27b過(guò)表達(dá)后，穿膜細(xì)胞數(shù)目均明顯減少。在TamR MCF-7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-27b mimics增加了約3倍的E-cadherin表達(dá)，同時(shí)也降低了約70%的N-cadherin表達(dá)。miR-27b可以結(jié)合預(yù)測(cè)的HMGB3 3′非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合位點(diǎn)并降低HMGB3在蛋白水平的表達(dá)。HMGB3敲減和miR-27b過(guò)表達(dá)具有類似的生物學(xué)功能。 結(jié)論 miR-27b可以通過(guò)抑制HMGB3的表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化并增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞他莫昔芬敏感性。

[關(guān)鍵詞] 雌激素受體；乳腺癌；miR-27b；他莫昔芬；HMGB3

[中圖分類號(hào)] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）12（c）-0058-05

[Abstract] Objective To investigate regulation mechanism of miR-27b in epithelial-to-mesenchymal transition and Tamoxifen sensitivity of ER positive breast cancer cells. Methods qRT-PCR was performed to detect miR-27b expression. Dual luciferase assay and Western blot assay were performed to detect the regulative effect of miR-27b on HMGB3 expression. Tamoxifen sensitive （TamS） and tamoxifen resistant （TamR） MCF-7 cells were transfected with miR-27b mimics or HMGB3 siRNA. Then cell viability， the expression of epithelial and mesenchymal markers and cell invasion were measured. Results TamR MCF-7 had approximately 20% of miR-27b expression compared to TamS MCF-7 cells. miR-27b overexpression significantly enhanced the suppressive effect of 4-hydroxytamoxifen on cell viability in TamR MCF-7 cells. miR-27b overexpression significantly inhibited cell invasion in both TamS and TamR cells. In TamR MCF-7 cells， transfection of miR-27b mimics resulted in approximately 3 folds increase of E-cadherin and 70% decrease of N-cadherin. miR-27b could bind to the predicted binding site in the 3′UTR of HMGB3 and decrease HMGB3 expression at protein level. Knockdown of HMGB3 phenocopied the effects of miR-27b. Conclusion miR-27b can inhibit epithelial-to-mesenchymal transition and sensitize ER positive breast cancer cells to tamoxifen via targeting HMGB3.

[Key words] ER； Breast cancer； miR-27b； Tamoxifen； HMGB3

他莫昔芬與雌二醇競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合雌激素受體（ER），廣泛應(yīng)用于ER陽(yáng)性乳腺癌術(shù)后的輔助治療[1-2]。雖然他莫昔芬的臨床運(yùn)用顯著提高了患者的生存期，但乳腺癌細(xì)胞通常會(huì)在一段時(shí)間治療后出現(xiàn)他莫昔芬耐藥，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和治療失敗[1，3]。

研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞獲得性他莫昔芬耐藥通常伴隨多種miRNA的異常表達(dá)[4-6]。如4-羥基他莫昔芬（4-OHT）處理后，ER陽(yáng)性的乳腺癌MCF-7細(xì)胞中miR-574-3p表達(dá)降低，導(dǎo)致了網(wǎng)格蛋白重鏈異常升高，從而參與了他莫昔芬耐藥[7]。乳腺癌細(xì)胞中miR-320的降低可以通過(guò)增加cAMP調(diào)控的磷酸蛋白（ARPP-19），雌激素相關(guān)受體γ及其下游效應(yīng)分子的表達(dá)，包括c-Myc和細(xì)胞周期蛋白D1，導(dǎo)致獲得性他莫昔芬耐藥[8]。有研究指出，miR-27b低表達(dá)也與乳腺癌細(xì)胞獲得性他莫昔芬耐藥密切相關(guān)[9]。但miR-27b在乳腺癌細(xì)胞中的下游調(diào)控機(jī)制還不是很清楚。本研究擬探討miR-27b/HMGB3調(diào)控軸對(duì)ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和他莫昔芬敏感性的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

ER陽(yáng)性且他莫昔芬敏感（TamS）的乳腺癌細(xì)胞MCF-7購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。采用低劑量逐步加量法誘導(dǎo)他莫昔芬耐藥的（TamR）MCF-7細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞用RMPI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，添加10% FBS，2 mmol/L谷氨酰胺，100 U青霉素/mL和100 μg鏈霉素/mL。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

miR-27b模擬物（mimics），HMGB3si-RNA（si-HMGB3）和對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照購(gòu)自銳博生物。參考轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamie 2000（Invitrogen）說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

使用Target Scan 7.1預(yù)測(cè)miR-27b和HMGB3的結(jié)合位點(diǎn)。

1.4 RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量

按照TRIzol RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA。應(yīng)用TaqMan miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Applied Biosystems）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用TaqMan miRNA分析試劑盒檢測(cè)miR-27b的表達(dá)。所有qRT-PCR實(shí)驗(yàn)均使用Applied Biosystems 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行。RNA的相對(duì)表達(dá)量使用2-ΔΔCT法計(jì)算。

1.5 細(xì)胞活力檢測(cè)

取轉(zhuǎn)染miR-27b mimics或HMGB3 siRNA后24 h的TamS或TamR MCF-7細(xì)胞，接種于96孔板（3×103個(gè)細(xì)胞/孔），繼續(xù)培養(yǎng)24 h。之后，將培養(yǎng)基換為5 μmol/L的4-OHT培養(yǎng)基。細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h后進(jìn)行CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)

將基質(zhì)膠鋪于小室底部，小室下層加入含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液500 μL，上層加入無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)液100 μL。轉(zhuǎn)染48 h后，制備細(xì)胞懸液，小室上層鋪500 μL的細(xì)胞懸液（含1×105個(gè)細(xì)胞），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，4%甲醛固定、0.1%結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下（100×）隨機(jī)挑取10個(gè)視野計(jì)數(shù)穿膜的細(xì)胞計(jì)算其均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.7 蛋白質(zhì)印跡分析

細(xì)胞樣品應(yīng)用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白樣品按30 μg/孔在10% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)膜，封閉。后用相應(yīng)一抗于4℃孵育過(guò)夜，洗滌。加二抗孵育，洗滌。加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑，X線曝光、顯影和定影。以目的蛋白質(zhì)條帶的灰度值與內(nèi)參β-actin蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

將含預(yù)測(cè)的野生型miR-27b結(jié)合位點(diǎn)的HMGB3 3′UTR序列片段和含突變型miR-27b結(jié)合位點(diǎn)的HMGB3 3′UTR序列片段分別插入熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒pmirGLO（Promega）的Xhol和Xbal位點(diǎn)之間。重組質(zhì)粒分別命名為pGLO-HMGB3-WT和pGLO-HMGB3-MT。將miR-27b mimics、mimics對(duì)照分別與內(nèi)參對(duì)照和熒光素酶報(bào)告載體共轉(zhuǎn)染入MCF-7細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24 h后，采用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System進(jìn)行樣品Luciferase活性檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-27b對(duì)ER陽(yáng)性乳腺癌他莫昔芬敏感性和侵襲力的調(diào)控

TamR MCF-7細(xì)胞中miR-27b的水平約為TamS MCF-7細(xì)胞的20%（圖1A）。5 μmol/L的4-OHT處理并不能抑制TamR MCF-7細(xì)胞的活力；但在TamR MCF-7細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-27b后，5 μmol/L的4-OHT處理則導(dǎo)致約15%的細(xì)胞活力抑制（圖1B）。TamS MCF-7與TamR MCF-7細(xì)胞在miR-27b過(guò)表達(dá)后，穿膜細(xì)胞數(shù)目均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.028、0.006）（圖1C、圖1D）。

2.2 miR-27過(guò)表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果證明，TamR MCF-7細(xì)胞中，miR-27b過(guò)表達(dá)增加了約3倍的E-cadherin表達(dá)，降低了約70%的N-cadherin表達(dá)（圖2）。

2.3 miR-27b對(duì)HMGB3在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)的影響

生物信息學(xué)結(jié)果顯示，在HMGB3 3′非翻譯區(qū)有一個(gè)可能的miR-27b結(jié)合位點(diǎn)（圖3A）。在TamS和TamR MCF-7細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)miR-27b可以降低HMGB3蛋白表達(dá)（圖3B）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-27b是否與預(yù)測(cè)的HMGB3 3′UTR結(jié)合位點(diǎn)有直接結(jié)合作用，將野生型和突變型的HMGB3 3′UTR片段插入pmirGLO熒光素酶表達(dá)載體后進(jìn)行miR-27b結(jié)合實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，miR-27b可以顯著抑制pGLO-HMGB3-WT的熒光素酶在TamS和TamR MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)，但是并不能抑制pGLO-HMGB3-MT的熒光素酶表達(dá)（圖3C、圖3D），說(shuō)明miR-27b可以結(jié)合預(yù)測(cè)HMGB3 3′UTR結(jié)合位點(diǎn)。

2.4 HMGB3敲減對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響

HMGB3 siRNA顯著抑制了HMGB3的表達(dá)（圖4A）。TamR MCF-7細(xì)胞在抑制HMGB3后，5 μmol/L的4-OHT處理導(dǎo)致了約20%的細(xì)胞活力抑制（圖4B）。抑制HMGB3也顯著減少了TamS和TamR MCF-7細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)目（P = 0.009、0.004）（圖4D）。HMGB3 siRNA顯著增加了E-cadherin表達(dá)，同時(shí)也明顯降低了N-cadherin表達(dá)（圖4C）。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，多個(gè)miRNA在TamR乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)顯著下降，包括miR-497，miR-221/222，miR-195和miR-27b[10]。miR-27b可以參與多項(xiàng)乳腺癌病理發(fā)展過(guò)程。如miR-27b表達(dá)下降與ErbB2依賴的乳腺上皮細(xì)胞癌變和侵襲力增強(qiáng)密切相關(guān)[11]。miR-27b表達(dá)降低也導(dǎo)致了ENPP1激活，從而參與了乳腺癌腫瘤干細(xì)胞的發(fā)生[9]。在多種腫瘤細(xì)胞中，miR-27b低表達(dá)也與癌細(xì)胞的化療敏感性相關(guān)。如miR-27b過(guò)表達(dá)可以在胃癌細(xì)胞中激活p53依賴的細(xì)胞程序性死亡，減少CYP1B1調(diào)控的藥物減毒作用，從而增加腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的敏感性[12]。在乳腺癌細(xì)胞中，miR-27b過(guò)表達(dá)可以通過(guò)減少側(cè)群細(xì)胞的形成，從而降低獲得性的藥物耐藥[9]。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化不僅是腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)侵襲力的重要機(jī)制之一[13]，也是獲得性他莫昔芬耐藥的重要機(jī)制之一[14-15]。如果在他莫昔芬耐藥的乳腺癌細(xì)胞中恢復(fù)一些下調(diào)的miRNA的表達(dá)，如miR-375和miR-200，可以部分逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并增加他莫昔芬的敏感性[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，在他莫昔芬耐藥的MCF-7細(xì)胞中恢復(fù)miR-27b的表達(dá)，可以顯著增加他莫昔芬對(duì)細(xì)胞活力的抑制，減弱腫瘤細(xì)胞的侵襲力，同時(shí)也部分逆轉(zhuǎn)了腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

人高遷移率族蛋白（HMG-box）在腫瘤細(xì)胞的DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組和修復(fù)中有重要的生理功能[17-18]。在乳腺癌中，HMGB3是一個(gè)原癌基因，并且可以調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥性[19-20]。本研究證實(shí)，miR-27b可以結(jié)合預(yù)測(cè)HMGB3的3′UTR結(jié)合位點(diǎn)，降低HMGB3的表達(dá)。HMGB3敲減具有類似miR-27b過(guò)表達(dá)的生物學(xué)功能，可以減弱乳腺癌細(xì)胞的他莫昔芬耐藥性，減弱細(xì)胞侵襲力，也部分逆轉(zhuǎn)了癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。因此，HMGB3很有可能是miR-27b在乳腺癌細(xì)胞中的重要下游靶點(diǎn)。

本研究只用了一種他莫昔芬耐藥的乳腺癌細(xì)胞，這是本研究的局限性。后續(xù)研究擬用多種乳腺癌腫瘤細(xì)胞系和基于裸鼠的體外腫瘤模型對(duì)miR-27b和HMGB3的作用機(jī)制及參與的信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行深入研究。

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（收稿日期：2016-09-18 本文編輯：李亞聰）